In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Summary

Il protocollo per l'imaging longitudinale dinamico e selettivo lesione laser di terminazioni nervose in topi transgenici giornalista è presentato.

Abstract

Terminazioni nervose in pelle sono coinvolti in processi fisiologici quali sensing ¹ e nei processi patologici come il dolore neuropatico ^2. Il loro posizionamento close-superficie facilita l'imaging microscopico delle terminazioni nervose della pelle nel vivere intatta di un animale. Utilizzando la microscopia multiphoton, è possibile ottenere immagini belle superando il problema della forte dispersione della luce del tessuto cutaneo. Reporter topi transgenici che esprimono EYFP sotto il controllo di Thy-1 promoter nei neuroni (compresi periferia neuroni sensoriali) sono adatti per gli studi longitudinali delle singole terminazioni nervose più lunghi periodi di tempo fino a diversi mesi o addirittura per tutta la vita. Inoltre, utilizzando lo stesso laser a femtosecondi come per imaging, è possibile produrre lesioni altamente selettivi di fibre nervose per gli studi della ristrutturazione fibre nervose. Qui, vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per multiphoton longitudinale imaging in vivo emicrochirurgia laser-based sul topo terminazioni nervose della pelle.

Introduction

Terminazioni nervose cutanee subiscono cambiamenti dinamici sotto diversi stati fisiopatologici. Le fibre nervose possono passare attraverso il processo di degenerazione e di rigenerazione o di ristrutturazione nel corso di tali malattie come neuropatia periferica ² o Morton neuroma ^3. Dopo la lesione traumatica, una parte importante di terminazioni nervose dinamiche in pelle è reinnervazione della zona danneggiata. Tuttavia, l'approccio comune per le indagini di terminazioni nervose sia ex vivo istologica di sezionamento che non dispone di informazioni in tempo reale sui processi in corso ^4. Utilizzo di marcatori fluorescenti geneticamente codificati, è possibile tracciare le terminazioni nervose nella pelle degli animali vivi, ottenendo così ricco di informazioni e significativamente più rilevante sui cambiamenti strutturali. L'indagine di terminazioni nervose cutanee è possibile utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale, tuttavia, la forte dispersione della luce del tessuto cutaneo mina fortemente la qualitàdei dati acquisiti ^5. Microscopia Multiphoton permette l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione nei tessuti fortemente dispersione dovuta alla sommatoria non lineare di energia di eccitazione fotoni di luce con conseguente emissione di fluorescenza solo dal punto focale dell'obiettivo. Questo effetto porta ad un forte aumento della profondità di penetrazione e il miglioramento di rapporto segnale-rumore per la misura nei tessuti cutanei ^6. Utilizzando lo stesso laser per l'imaging, è possibile produrre dissezione selettiva delle fibre nervose ^7. Nel seguente protocollo mostriamo il metodo dell'imaging longitudinale di terminazioni nervose cutanee in vivo in topi transgenici giornalista combinato con lesione selettiva laser con sistema disponibile in commercio microscopio multiphoton.

Protocol

Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Consiglio Experiment Animal Nazionale, Finlandia.

1 Preparazione degli animali per Imaging

1. Anestetizzare un mouse da intraperitional (IP) iniezione di ketamina (0,08 mg per peso corporeo) e xilazina (0,01 mg per peso corporeo). Controllare l'anestesia con il pizzico punta posteriore reflex.
2. Immergere gli occhi dell'animale in collirio (Viscotears) per proteggere gli occhi dalla disidratazione.
3. Posizionare il mouse su una piastra elettrica (Supertech) a 37 ° C per evitare l'ipotermia.
4. Pulire il rilievo del piede designato per l'imaging con il 70% di etanolo.
5. Aggiungere una goccia d'acqua sulla pelle del rilievo del piede per l'accoppiamento immersione tra pelle e vetro di copertura.
6. Mettere il materiale da imballaggio in plastica sotto la zampa posteriore che è posizionato sotto un anello di metallo con coperchio di classe.
7. Regolare lo spessore del materiale di confezionamento in plastica per appiattire la pelle.
8. Mettere una goccia d'acqua sulle glas copertinas per l'immersione tra il vetro di copertura e l'obiettivo.

2. metallo fissatore Anello Preparazione

1. Per la stabilizzazione della pelle utilizzare il fissatore metallo. Usiamo disegni e modelli comunitari protetti fissatore due ali con un anello di metallo (per gentile concessione di Neurotar Ltd, Finlandia). Riempire la siringa con supercolla, mettere la piccola goccia di colla attraverso l'ago sull'anello e diffondere delicatamente la colla per la copertura uniforme della superficie dell'anello. E 'fondamentale per mettere la quantità minima di colla che è necessario solo per una copertura uniforme, causa eccessiva quantità di colla può ridurre il campo della vista e di ostacolare l'imaging successiva.
   NOTA: In alternativa, la combinazione di una barra metallica (da sotto) e dello standard vetrino da microscopio (come copertura) potrebbe essere utilizzato per appiattire la pelle e per garantire il corretto accoppiamento ottico del gruppo ^14. Due clip di carta potrebbero essere utilizzati per fissare la zampa tra il vetro e la superficie barra di metallo (figura 4
2. Coprire l'anello con coperchio vetrino da microscopio (5 mm di diametro, Electron Microscopy Science).
3. Avvitare il fissatore anello alla barra metallica rigida che viene montaged sul palco microscopio motorizzato.

3. Imaging Procedura

1. In caso di utilizzo Thy1-YFP-H mouse, scegliere la parte blu della fluorescenza spettri lampada per visualizzare fibre nervose. Trovare il nervo di interesse in modalità epifluorescenza e concentrarsi su di esso.
2. Annotare le coordinate di un punto per l'imaging longitudinale. Utilizzare un pad carpale come punto di riferimento. Durante le seguenti sessioni di imaging, rilevare prima il pad carpale e poi trovare le stesse fibre nervose a monte grande e tornare indietro utilizzando le coordinate salvate. È essenziale posizionare il pad piede nella stessa direzione perpendicolare alla barra di metallo per mantenere lo stesso sistema di riferimento.
3. Attivare la modalità a due fotoni. Ai topi Thy1-YFP-H, è adatto per usare la lunghezza d'onda di 950 nm di radiazione laservisualizzare le fibre nervose.
4. Selezionare la banda di laser e di emissione canali (450-480 nm per la seconda rilevazione armonica generazione, 520-550 nm per l'imaging di nervi YFP-etichettati e 580-630 nm per la rilevazione di YFP fluorescenza e autofluorescenza dei capelli), iniziare con bassa potenza del laser (3-5%) per evitare fotodanneggiamento e candeggio. La tensione tipica sui tubi fotomoltiplicatori è 600-700 V per questo tipo di imaging.
5. Impostare la risoluzione desiderata (512 x 512 o 640 x 640 per misure eventi veloci, 800 x 800 o 1.024 x 1.024 per l'imaging morfologico), passo assiale (1-3 micron), spessore del campione e gli intervalli di tempo (1-10 min). Il tempo di esposizione è dell'ordine di 1 msec per un pixel.
6. Prima segnare i limiti superiori e inferiori del volume di imaging nel software.
7. Acquisire la pila di immagini di riferimento per il riferimento prima della lesione. Quando necessario, è possibile registrare il basale durante parecchi minuti.
8. Dopo l'imaging pulito il pad con un fazzoletto e mettere il mouse in una scatola di ripresa a 36 ° C fino a quando non è completamente sveglio.
   NOTA: In genere, la durata di una sessione di imaging combinato con laser indotta lesione (vedi sotto) non superi 1 ora. Si consiglia di verificare che l'animale è profondamente anestetizzato ogni 10-15 minuti; questo non dovrebbe interferire con l'imaging in sé, ma deve essere considerato, mentre è prevista procedura sperimentale. La durata degli effetti di una singola dose di ketamina / xylazyne è di circa 30 e 40 minuti, quindi si consiglia di applicare ulteriore ¼ a ½ dose dopo 25-30 min.
   NOTA: Si deve essere considerata come bene quando la sperimentazione prevede che la frequenza delle sessioni di imaging per un singolo animale non deve superare 1 seduta per 2 giorni per evitare gli effetti negativi del recompetitivo anestesia.

4 Laser Lesion

1. Dopo aver acquisito l'immagine pila di riferimento, utilizzare il protocollo sbiancante per fare una micro lesione.
2. Aumentare la potenza del laser al 100%.
3. Aumentare il tempo di esposizione di 100-1.000 msec per regione di interesse (100-1,000x più che nel caso di immagini standard).
4. Delineare l'area per la lesione.
5. Rendere la lesione accendendo lo sbiancamento.
6. Tornare alla modalità di imaging regolare e continuare con le registrazioni time-lapse.

5. Data Processing and Analysis

1. Procedere con unmixing usando unmixing Spectral plug-in ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Aprire la serie di immagini e dividere i canali.
3. Trova l'area libera dei nervi o dei capelli per le misurazioni del fondo. Mettere una regione of interesse in quella zona.
4. Delineare con cura la parte del capello, dove si distingue nettamente dai nervi.
5. Outline nervo nella parte dell'immagine in cui è separato dai capelli.
6. Salva unmixing matrice.
7. Applicare matrice unmixing misurato per l'intero stack.
8. Salvare le nuove pile di immagini elaborate in formato * tif.

Representative Results

Utilizzando la tecnica descritta è possibile seguire la stessa fibra dopo la lesione e per studiare la degradazione delle terminazioni nervose danneggiate (Figura 1). Acquisizione della pila con spessore di 120-150 micron è generalmente appropriato per imaging ripetitivo durante parecchi giorni, al fine di mantenere l'intera fibra nel campo visivo.

La lesione tipicamente può essere prodotto sinteticamente quando il materiale di imballaggio in plastica viene regolata per appiattire la pelle, così gli strati di collagene apparire con intensità uniforme sull'immagine (Figura 2). Le terminazioni nervose sopra lo strato di collagene sono i più adatti a produrre la lesione preciso.

Nel caso in cui la pelle non è appiattito, l'immagine può verificarsi ad essere offuscata (Figura 3). L'intensità di tale situazione può ancora essere adatto per indagini morfologiche delle fibre nervose, ma la procedura lesione laser sarebbe essere ostacolato.

Figura 1 Tempo traccia dell'effetto della lesione laser sulla fibra nervosa presentato come immagini massimi di proiezione. Le immagini superiori mostrano la fibra prima ed immediatamente dopo la lesione, il pannello inferiore mostra la stessa fibra dopo 30 min e 10 giorni (a sinistra e pannelli di destra, corrispondentemente). Ci sono alcuni YFP che esprimono strutture di natura non-neuronale che appaiono 10 giorni dopo la lesione. Queste strutture sono suscettibili di essere cheratinociti che sono noti per esprimere gene Thy1 transitoriamente in condizioni traumatiche. La fluorescenza YFP delle fibre nervose viene visualizzato in giallo. Una freccia indica la regione della lesione. Scala bar 30 micron.

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Figura 2. immagine di proiezione massima per le terminazioni nervose nella zona di pelle appiattito. La fluorescenza YFP delle fibre nervose viene visualizzato in giallo, la generazione di seconda armonica del collagene è mostrata in blu. Scala bar 50 micron.

Figura 3 Le terminazioni nervose nella zona curva della pelle ottenuta come z-sporgenza massima per più sezioni ottiche. La fluorescenza YFP di fibre nervose e autofluorescenza dei capelli è mostrata in giallo, viene mostrata la generazione di seconda armonica del collagene in blu. Scala bar 50 micron.

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Figura 4 La procedura di sintesi zampa tramite il vetrino da microscopio come copertura. La slitta è collegata alla barra metallica mediante graffette standard.

Discussion

In questo protocollo video dimostriamo il metodo per non invasiva longitudinale a due fotoni di imaging di terminazioni nervose singoli.

La dinamica delle innervazioni pelle è influenzata in tali malattie come la psoriasi e la neuropatia periferica ^2, e in lesioni traumatiche ^9. L'imaging a due fotoni permette un'analisi dettagliata delle strutture fibre nervose in matrice di collagene. L'uso di topi transgenici transgenici permette di evitare i problemi di colorazione delle fibre nervose. Thy1-YFP-H ceppo sembra essere sufficientemente robusto per morfologica analisi dei dati ^10, mentre i topi Thy1-mitoCFP possono fornire l'opportunità di studi funzionali della dinamica mitocondriale nelle fibre nervose ^11. La linea YFP-16 / ICR può essere utilizzato per l'osservazione dei corpi Meissner ^12. L'approccio alternativo potrebbe essere l'iniezione virale nel ganglio della radice dorsale per il monitoraggio selettivo di specifiche popolazioni neuronali13.

Vale la pena notare che la produzione di lesione selettiva all'interno della matrice di collagene è fortemente ostacolata rispetto agli strati superiori della pelle. Ecco perché a volte tempi di esposizione per la dissezione di fibre nervose possono differire tanto quanto dieci volte mentre l'intensità della fluorescenza per imaging differisce sulla gamma di 10-20%. Per mantenere una buona qualità dell'immagine giunto immersione costante deve essere mantenuta.

La risoluzione dell'immagine solito dipende dalla velocità di acquisizione desiderabile. Tempo tipico per la produzione di una pila Cornici- 30 con risoluzione di 800 x 800 pixel è di 1 min, così si può diminuire la risoluzione o lo spessore della zona con immagini di rilevare i cambiamenti veloci o aumentare la risoluzione per fini caratteristiche morfologiche studi.

Fissaggio della zampa dovrebbe essere sufficiente a non permettere la deriva dell'immagine stretto, ma allo stesso tempo non dovrebbe influenzare la circolazione del sangue in tegli pelle. Per l'ottimizzazione della procedura, iniezioni di vasi sanguigni traccianti (ad esempio, TexasRed etichettati 70 kDa destrano) sono possibili, permettendo di regolare la pressione del materiale di imballaggio in plastica tramite il monitoraggio del flusso di sangue. Artefatti di movimento nella preparazione descritta in questo protocollo è improbabile perché l'animale è profondamente anestetizzato, la zampa si è saldamente attaccato al gruppo di fissazione, e perché il battito cardiaco e il movimento respiratorio non vengono trasmessi direttamente alla zampa. Tuttavia, leggeri movimenti sono possibili, soprattutto se viene eseguita l'imaging ad alto ingrandimento. In questo caso possiamo raccomandare l'uso di plugin di ImageJ destinati a compensare artefatti da movimento.

La formazione immagine ripetitivo della stessa area può essere ottenuto utilizzando tali punti di riferimento come pad carpale ^14, o in caso di iniezione di alcune sostanze nella zampa del punto di iniezione può servire come punto di riferimento ^6. L'altra possibilità è tatuaggio della pelle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782