Abstract
Descoberta de biomarcadores Novel desempenha um papel crucial no fornecimento de detecção mais sensível e específico para a doença. Infelizmente muitos biomarcadores baixa abundância que existem em fluidos biológicos não pode ser facilmente detectada com a espectrometria de massa ou imunoensaios, pois eles estão presentes em concentrações muito baixas, são instáveis, e muitas vezes são mascarados por proteínas de abundância elevada, tais como albumina ou imunoglobulina. Bait contendo poli (N-isopropilacrilamida) (NiPAM) nanopartículas à base são capazes de superar essas barreiras fisiológicas. Num passo que eles são capazes de captar, concentrar e preservar biomarcadores de fluidos corporais. Analitos de baixo peso molecular entrar no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, os quais actuam como iscos de proteína com elevada afinidade. As nanopartículas são capazes de se concentrar as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. Este factor de concentração é suficiente para aumentar o nível de proteína de tal modo que as proteínas estão dentro dolimite de detecção de corrente de espectrómetros de massa, transferência de western, e imunoensaios. As nanopartículas podem ser incubadas com uma variedade de fluidos biológicos e que são capazes de enriquecer grandemente a concentração de proteínas de baixo peso molecular e de péptidos e excluindo albumina e outras proteínas de alto peso molecular. Os nossos dados mostram que uma amplificação de 10.000 vezes na concentração de um analito particular, pode ser conseguido, permitindo que a espectrometria de massa e ensaios imunológicos para detectar biomarcadores anteriormente indetectáveis.
Introduction
Apesar da conclusão do seqüenciamento do genoma humano, um progresso significativo não foi alcançado na identificação de biomarcadores preditivos de doença em estágio inicial, ou que se correlacionam com os resultados terapêuticos, ou prognóstico 1. Uma das razões para esta falta de progresso é que muitos biomarcadores potencialmente significativas existem em uma concentração abaixo do limite de detecção de espectrometria de massa convencional e outras plataformas de descoberta de biomarcadores. Espectrometria de massa (MS) e monitorização de reacções múltiplas (MRM) tem uma sensibilidade de detecção, tipicamente maior do que 50 ng / ml, enquanto a maioria dos analitos medido por imunoensaios em uma queda de laboratório clínico no intervalo entre 50 pg / ml e 10 ng / mL . Isto significa que muitos biomarcadores, particularmente na fase inicial de uma doença que não pode ser detectado por MS convencional e MRM 2. Além disso, a presença de proteínas de elevada abundância, tais como albumina e imunoglobulina em fluidos biológicos complexos, frequentemente mascarar por mil vezes excess baixa abundância, proteínas de baixo peso molecular e de péptidos 3, 4. Por esta razão várias etapas de preparação da amostra é necessária antes da espectrometria de massa e sequenciação de identificação. Um tal passo preparatório emprega a depleção de proteínas de alta abundância com colunas de depleção disponíveis comercialmente 5-8. Infelizmente, este passo leva à diminuição do rendimento de biomarcadores candidatos porque eles são muitas vezes não covalentemente associada com proteínas transportadoras que estão a ser removidos. Um outro desafio é representado pela estabilidade dos biomarcadores candidatos ex-vivo, uma vez que as amostras são recolhidas. As proteínas são sujeitas a degradação por proteases endógenas ou exógenas 9. Nanopartículas de hidrogel podem ultrapassar estes desafios críticos, amplificando a concentração biomarcador putativo para um nível dentro da gama do ensaio, ao mesmo tempo proteger a proteína de degradação 10-13.
É importante notar ªLMW em proteínas no sangue são uma mistura de proteínas intactas pequenas, bem como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas derivadas de tecido superior a 60 kDa são demasiado grandes para entrar passivamente o fluxo de sangue através da membrana basal vascular, mas eles podem ser representados no sangue como péptidos ou fragmentos de proteínas 14. Nosso objetivo é medir novos circulando biomarcadores que podem ser candidatos para a detecção precoce da doença, a estratificação dos pacientes para a terapia, e monitorar a resposta à terapia. Nossos nanopartículas são criados para excluir selectivamente imunoglobulinas e albumina de abundância alta e, simultaneamente, a captura de proteínas e péptidos mais pequenos e concentrá-los até 100 vezes dependendo do volume de partida.
O nosso grupo identificado um conjunto de pequenas corantes orgânicos que podem funcionar com sucesso como engodos moleculares de elevada afinidade para proteínas e péptidos. Ligação da proteína-corante é provavelmente devido a uma combinação de interacção hidrofóbica e electrostáticos. Os anéis aromáticos do corante intercalar com proteínas através de bolsas hidrofóbicas na superfície de proteínas 11.
Os iscos de acordo com a química, mostram uma afinidade específica para as classes de analitos seleccionados. Os iscos competir com as proteínas transportadoras, tais como albumina, para as proteínas ou péptidos. As de baixo peso molecular de proteínas / péptidos tornam-se aprisionados na partícula. Proteínas de alto peso molecular tais como albumina e imunoglobulinas são impedidas de entrar na partícula, devido à capacidade de crivagem, devido ao poro restritiva do hidrogel 11 (Figura 1).
Nanopartículas de hidrogel são sintetizados por polimerização a precipitação iniciada por persulfato de amónio 11. N-isopropilacrilamida (NiPAM), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) e alilamina (AA) e N, N'-metilenobisacrilamida (BIS) de reticulação são deixados reagir a 70 ° C durante 6 h em condições de diluição 11, 13. A afinidade de ligação da proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NiPAM-co-AAc) nanoparticlesis conseguida por ligação covalente incorporando corantes contendo amino (isto é. Sulfonatedanthraquinonetriazine, corantes) em que as nanopartículas através uma reacção de amidação realizada em solventes aquosos ou orgânicos, dependendo das características hidrofóbicas / hidrofílicas dos corantes 11, 13. substituição nucleofílica dos grupos amina na nanopartículas com o átomo de cloro de um corante anthraquinonetriazine é utilizado para criar poli que contém o corante (NiPAM -CO-alilamina) (AA) nanopartículas 11, 12. Um processo de polimerização em duas etapas é utilizado para criar as nanopartículas de hidrogel contendo um invólucro exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) 11, 13.
Nanopartículas de hidrogel pode ser aplicado a vários fluidos biológicos, incluindo o sangue total, plasma, soro, fluido cefalorraquidiano, suor e urina. Em uma etapa, em solução, o nanoparticles realizar uma rápida (dentro de minutos), a fixação ea concentração de analitos de baixo peso molecular de 10, 11, 13, 15-18. As proteínas são seguidamente eluídas das nanopartículas e detectado utilizando a técnica Western Blot 19-21, espectrometria de massa de 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, imunoensaios / ELISA 10, 11, 15, 18, ou proteína de fase inversa microarray 16, 24 ensaios. As nanopartículas funcionalizadas com isca química, e apresentando um núcleo ou núcleo shell arquitetura, captura e concentrar as proteínas com base nas propriedades físico-químicas isca / shell. Diferentes corantes incorporados nas nanopartículas, por conseguinte, irá capturar diferentes subconjuntos de proteínas com base na eficiência de afinidade de corante, pH da solução, e a presença / ausência de proteínas de alto-13 competem variando abundante. Além disso, a quantidade de nanopartículas em relação ao volume da solução irá afectar a produção de proteína a partir das nanopartículas. Estes aspectoscolheita das nanopartículas de hidrogel são demonstradas utilizando três iscas nanopartículas diferentes para proteínas de colheita de amostras de plasma que contêm quantidades elevadas de proteína, e a partir de amostras de urina, que tipicamente não contêm grandes quantidades de proteínas. Neste protocolo, demonstrar a colheita concentrando e factor de necrose tumoral alfa (TNFa) a partir de amostras de plasma utilizando poli (NiPAM-co-AAc), poli (NiPAM / corante), e nanopartículas de casca Core- (poli (NiPAM-co-VSA)) . Poli (NiPAM / corante) nanopartículas são mostrados para concentrar antigénio espécies de Mycobacterium que foi adicionado a amostras de urina humana, para imitar os indivíduos infectados pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis.
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Protocol
O plasma humano e urina foi coletada a partir de doadores voluntários saudáveis, com consentimento informado por escrito, seguindo de Revisão Institucional da Universidade George Mason Conselho aprovou protocolos. Os doadores foram distribuídos igualmente entre homens brancos e mulheres entre as idades de 25 e 42 amostras foram analisadas individualmente e não foram reunidas.
1. nanopartículas de Processamento de amostras de soro ou plasma
Baixas biomarcadores potenciais abundante no plasma são capturados, em solução, com nanopartículas de hidrogel. As partículas são adicionadas ao plasma, incubadas, separadas por centrifugação, lavadas, e as proteínas capturadas são eluídas. As proteínas eluidas são secos sob um fluxo de azoto durante a jusante sequenciação e espectrometria de massa de identificação.
- Dilui-se 500 ul de soro de 1: 2, com 50 mM Tris-HCl de pH 7 (500 mL de soro + 500 ul Tris-HCl), em um tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 500 mL de poli (NiPAM / AAC) núcleo NanOpartigos. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
- Adicionar 500 ul de tiocianato de sódio (25 mM) para o sedimento. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
- Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
- Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
- Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
- Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 700 ul de acetonitrilo e 300 ul de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser prepared imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição.
- Adicionar 300 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e guarde o fluido em um tubo de microcentrífuga rotulado limpo.
- Repita os passos 1,9-1,10. Combine as duas eluatos em um tubo de microcentrífuga.
- Secam-se os produtos de eluição sob fluxo de azoto, em um evaporador colector de azoto a 42,1 ° C, com um fluxo de ar ajustado para 8 (Figura 2F).
- Armazenar o eluato secas à temperatura ambiente durante ó armazenamento / N, ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, antes da espectrometria de massa, transferência de western, ensaios de ELISA ou (opcional).
2. nanopartículas Processamento das amostras de urina
A urina normal contém menos do que 30 mg / dl e proteínamenos do que 1 + no sangue. No entanto, muitas doenças / condições podem alterar os níveis normais de proteína na urina e no sangue. Para ajudar a determinar o volume óptimo de nanopartículas para adicionar à amostra de urina, uma análise de urina é realizada antes da colheita de nanopartículas. Biomarcadores de urina podem existir em concentrações extremamente baixas, o que pode exigir optimizar a proporção de nanopartículas com o volume de urina. Este processo descreve a colheita de amostras de urina de nanopartículas para análise de Western blot a jusante.
- Coletar amostras de urina em um ambiente limpo, copo de plástico seco. Um volume mínimo de 22 ml é necessária. Urina loja amostras à temperatura de -80 ° C até estar pronto para a análise.
- Descongele a urina congelada à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Despeje pelo menos 22 ml de urina para um tubo de polipropileno de fundo cónico de 50 ml.
- Girar a urina numa centrífuga com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 15 min. Decantar a urina, sem perturbar o sedimento, em um POLYPR fundo cónico de 50 ml limpotubo opylene. Descarte o sedimento.
- Realizar exame de urina usando uma multi-analito "vareta de urina" tira reagente. Nota: guarde as tiras reagentes em um recipiente bem fechado longe da luz solar e umidade 17, 18 direto.
- Coloque a tira reagente, virada para cima, sobre uma toalha de papel limpo e seco.
- Usar uma pipeta descartável para aspirar 1 ml de urina, preparado no passo 2.3.
- Defina um temporizador para 2 min, mas não iniciá-lo. Dispensar rapidamente 1-2 gotas de urina em cada almofada de teste da tira reagente. Iniciar imediatamente o timer. Nota: Não mergulhe a tira reagente diretamente no recipiente de urina. Os indicadores de tintura / química na fita reagente pode, potencialmente, vaza da tira reagente para o recipiente de urina.
- No tempo indicado na embalagem tira reagente, gravar os resultados qualitativos para os vários analitos sobre a tira reagente, comparando a cor das fitas reagentes individuais indica o código de cores correspondentedores no recipiente de reagente. Resultados de urina normais típicas são: (normal ou negativa) para o sangue, proteína, leucócitos, nitrito, glucose, cetona, bilirrubina, e urobilinogénio; Urina pH (5,5-7,0); gravidade específica (1,001-1,020). Nota: Os níveis elevados de proteínas numa amostra de urina, podendo competir com a proteína de interesse para os locais de ligação sobre as nanopartículas. Para maximizar a colheita de proteínas com nanopartículas, a / volume de urina de volume de nanopartículas pode ser ajustado para qualquer competição limite de proteínas de alta abundância, ou pode ser otimizado para colher as proteínas que existem em concentrações muito baixas. Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar volumes 2x de nanopartículas no passo 2.5 abaixo. Se o analito de interesse é uma proteína muito baixo abundante, pode ser necessário aumentar o volume de nanopartículas até 2 ml (Figura 3).
- Transferir 20 ml de urina clarificado do passo 2.3 em 50 mL de um tubo de polipropileno de fundo cónico limpo. Nãoperturbar quaisquer detritos / sedimento que pode ser no fundo do tubo de urina. Adicionar 200 ul de nanopartículas para os 20 ml da amostra de urina. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Nota: Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar 400 mL de nanopartículas a 20 ml de urina.
- Incubar a mistura de urina / nanopartículas durante 30 min à temperatura ambiente, sem balançar / mistura.
- Girar a suspensão de urina / nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é seguir a centrifugação visível, girar as amostras para um adicional de 2-7 min.
- Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas.
- Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir a solução de nanopartículas de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo.
- Rodar as nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é visível folmugido centrifugação, girar as amostras para um adicional de 2-7 min.
- Remova e descarte o sobrenadante.
- Repita os passos 2.8 e 2.11 (duas vezes) com 200 ul de 18 MiliQ de água para lavar as nanopartículas.
- Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 970 ul de acetonitrilo a 30 mL de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser preparado imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição.
- Adicionar 20 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Gire as amostras de nanopartículas a 16.100 xg por 10 min. Retire e guarde o sobrenadante em um, 1,5 ml tubo de microcentrífuga limpo. Não perturbar o pellet de nanopartículas. Descarte a pelota no lixo de risco biológico.
- Colocar as amostras em um rack em um exaustor química. Abra as tampas e incUbaté à TA durante 30 min. Em alternativa, colocar as amostras de acordo com o fluxo de azoto a 40 ° C até secar (1 - 2 horas).
- Adicionar 15 ul de tampão de amostra de Tris-glicina SDS (2x) para as amostras. Aquece-se a 100 ° C num bloco de aquecimento a seco durante 5 minutos com as tampas abertas, ou até que o volume deixado no tubo não é mais de 20 ul. Nota: não use um banho de água fervente. A humidade do banho de água irá evitar a evaporação do tampão.
- Coloque a tampa sobre os tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C ou usado imediatamente para a análise de Western blot a jusante.
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Representative Results
Hidrogel nanopartículas tamanho e uniformidade
Poli (NiPAM-AAC) partículas foram produzidas com um rendimento extremamente elevado e reprodutibilidade entre e dentro dos grupos. As partículas têm muito boa estabilidade coloidal à TA durante o tempo necessário para a recolha, o armazenamento, e a eluição das proteínas (pelo menos 48 horas), e precipitação das nanopartículas não foi observado (Figura 1) 11. A estabilidade coloidal pode ser muito importante para uma rápida absorção de proteínas / péptidos por as nanopartículas.
Potenciais Biomarcadores baixa abundância colhida de Plasma
A incorporação do corante isca conduz a absorção de moléculas em solução e assegura que as moléculas de capturados são preservados de degradação 13, 15, 18, 25. Por este motivo, os inibidores da protease não são necessários durante o pré-tratamento da amostra. Este atributo das nanopartículas torna suitable como uma tecnologia de preservação para coleta de amostras no campo e para o transporte de fluidos biológicos em temperatura ambiente.
A molécula de isca pode ser incorporada na partícula de hidrogel por copolimerização ou ligação covalente de grupos funcionais presentes no nanopartícula. Como um exemplo, poli (NiPAM-co-AAc) nanopartículas foram construídos com aminoácidos contendo corantes via comprimento zero reacções de reticulação de amidação, enquanto nanopartículas com uma casca exterior contendo ácido copolímero vinilsulfónico (VSA) foram criadas por uma segunda reacção de polimerização 10-13. Diferentes tipos de nanopartículas podem ser produzidos por incorporação de um corante no produto químico diferente de nanopartículas e, assim, aumentar a colheita de classes específicas de proteínas. Um importante conceito da tecnologia é que os diferentes iscos pode mostrar uma afinidade preferencial para as proteínas diferentes porque a interacção proteína-corante depende principalmente de uma combinação de interacções hidrofóbicas, 3-D interacções e forças eletrostáticas. Observou-se que alguns analitos pode ser capturado com uma alta afinidade por corantes quimicamente diferentes, devido à complexidade das forças de ligação. Veja Tamburro et al., Para uma extensa explicação e exemplos deste princípio 13. Por exemplo, foram utilizados quatro tipos diferentes de captura de isca (nanopartículas) para a colheita de TNFa a partir de plasma, utilizando 200 ul de partículas e de 200 ul de plasma para cada tipo de nanopartículas. Em todos os casos, após o tratamento com as nanopartículas, TNF não foi detectável no sobrenadante por SDS-PAGE com coloração de prata, enquanto que o TNFa foi detectada no eluato de nanopartículas (Figura 1C). (Pista 1 = TNF recombinante (MW 17.000 Da), as faixas 2 e 3, 4 e 5, 6 e 7 e 8 e 9 representam os resultados para quatro diferentes tipos de iscas de nanopartículas, respectivamente, C = controle, S = sobrenadante, P = nanopartícula eluato).
Dose-resposta para difeAluguel Tipos de N anoparticles
A fim de realizar uma curva de calibração, e, assim, avaliar o rendimento ea precisão, as experiências devem ser realizadas com proteínas enriquecidas em de concentração conhecida. Os resultados publicados para uma variedade de fluidos corporais e analitos demonstrar como a nanopartícula pré-processamento mantém a linearidade do ensaio e determina uma curva de calibração enquanto aumentando o limite de eficácia de detecção 10, 16, 26. Também foram publicados estudos de precisão entre laboratório usando as nanopartículas de realizar multi-reacção monitorização espectrometria de massa com maior sensibilidade 27.
Para comparar a eficiência da IL-17 de colheita por diferentes tipos de nanopartículas, foi adicionada IL-17 recombinante (17,5 kDa), as amostras de plasma, para o qual tanto o poli (NiPAM-co-AAC) ou de poli (NiPAM-co-VSA) nanopartículas foram subsequentemente adicionados . Dois conjuntos de quatro diluições em série de 100 ng de recombinante IL-17 foram preparadas em 10081; l de plasma (100 ng / 100 mL, de 50 ng / mL de 100, 25 ng / mL e 100 ng de 12,5 / 100 ul). poli (NiPAM-co-AAC) ou de poli (NiPAM-co-VSA) partículas adicionadas às respectivas amostras de plasma de uma mistura 1: (v / v) de uma partícula: proporção de plasma. Um ensaio de proteína total espectrofotométrica foi realizada nas amostras de sobrenadante. Western blotting com anticorpo policlonal de coelho anti-IL-17 foi realizada em 20 ng de sobrenadante do plasma (S) após a colheita e as nanopartículas eluatos de nanopartículas (P) (Figura 4). Ambos os tipos de nanopartículas adequadamente recolhidas e concentradas de IL-17 em cada diluição. As bandas adicionais no western blot representam a albumina do soro humano e de imunoglobulina que reagem de forma cruzada com o anticorpo secundário. (partículas AAC: Pistas 1 e 2 = 1 ng / mL de IL-17, Lanes 3 e 4 = 0,50 ng / mL, pistas 5 e 6 = 0,25 ng / l, Lanes 7 e 8 = 0,125 ng / mL, pista 9 = IL-17; partículas VSA: Pistas 1 e 2 = 1 ng / ul IL-17, pistas 3 e 4 = 0,50 ng / mL,Lanes 5 e 6 = 0,25 ng / mL, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / l).
A detecção de proteínas na urina de diagnóstico potencialmente
Amostras de urina humana, obtidos a partir de doadores voluntários saudáveis, com consentimento informado, foram incrementadas com uma espécie de Mycobacterium antígeno da proteína recombinante Early Secretory Alvo Mycobacterium Tuberculosis (ESAT-6) para imitar indivíduos infectados pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis. 1 ug cada de ESAT-6 (15 kDa) e IL-2 (15,5 kDa) foram adicionados a alíquotas de 1 ml de urina humana, recolhidos a partir de dadores voluntários saudáveis. A análise da urina foi realizada em amostras de urina de uma fita reagente para determinar a relação óptima de nanopartículas de urina, que se baseia na presença / ausência de proteínas urinárias. Poli (NiPAM / corante) nanopartículas foram utilizados para a colheita de amostras de urina, as proteínas tratadas e não tratadas. Electroforese em gel unidimensional dos eluatos foi realizada f nanopartículasollowed por coloração com prata. Amostras em U4 e U6 pistas representam eluatos a partir de nanopartículas de IL-2 as amostras de urina tratadas ESAT-6 e, mostrando claramente bandas predominantes a 15 kDa (Figura 5). Espectrometria de massa dos extratos identificados ESAT-6 (UniProt POA567 adesão, 84,0 cobertura, 9 peptídeos) e IL-2 (P60568 UniProt adesão, 38,56 cobertura, 3 peptídeos). Urina sem colheita nanopartículas é mostrado na pista marcada "bruto".
Figura 1 Nanopartículas colheita e concentrar proteínas abundância baixa de fluidos biológicos complexos. (A) Fluxo de trabalho para proteínas de colheita. O tempo total de processamento é de aproximadamente 1,5 h. As proteínas presentes na solução são concentradas a partir do sangue, soro, plasma, urina, suor, saliva ou outros fluidos corporais (concentração 1000 vezes representado). (B)Lote para lote que mostra a comparação de tamanho uniforme de nanopartículas. Microscopia de Força Atômica em mica mostra uniformidade de tamanho (0,7 mM de diâmetro) e ausência de aglutinação em dois lotes de nanopartículas. Eletroforese em gel (C) 1-D, com coloração de prata subseqüente, de Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF) seqüestrado de plasma. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. nanopartículas procedimento de colheita de plasma / soro para análise por espectrometria de massa a jusante. (A) Nanopartículas permanecem suspensas em solução (poli (NiPAM / corante) mostrado). (B) As nanopartículas são adicionados à amostra de plasma diluído. (C) A i suspensão de nanopartículas de plasmas girou em uma centrífuga para separar as nanopartículas do sobrenadante. (D) Pós centrifugação, as nanopartículas de formar um pelete distinta na parte inferior do tubo. de (E) Depois da lavagem das nanopartículas, o eluato contendo as proteínas colhidas é removido e guardado . para análise a jusante (F) O fluido é seco sob fluxo de nitrogênio em um evaporador a 42,1 ° C, fluxo de ar 8, por 1 -. 2 horas antes da espectrometria de massa por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 urinálise usando tiras reagentes multi-analitos para controle de qualidade da amostra. (A) Cada almofada sobre a tira reagente é impregnado com produtos químicos corantes, enzimas, e / ou indicadores que reagem com um diferement analito na urina (p.ex.., glicose, bilirrubina, cetona, gravidade específica, sangue, pH, proteínas, urobilinogénio, nitrito e / ou leucocitoesterase). A urina é clarificada por centrifugação. Uma gota de urina é adicionado a cada almofada na tira reagente. (B) A cor de cada bloco é comparado visualmente para os blocos de cores no recipiente, no horário especificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Colher IL-17 a partir de plasma usando core-shell (VSA) nanopartículas núcleo (AAC) ou. Electroforese em gel de 1-D e western blotting com anti-IL-17, demonstra a capacidade de Ácido Acrílico (AAC) e VSA nanopartículas shell núcleo para colher vários concentrations de IL-17 a partir de plasma. (S = sobrenadante após a colheita de nanopartículas, partículas P = nanopartícula eluato AAC:. Faixas 1 e 2 = 1 ng / mL de IL-17, Lanes 3 e 4 = 0,50 ng / mL, Lanes 5 e 6 = 0.25ng / l, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL, a pista 9 = IL-17; partículas VSA: Pistas 1 e 2 = 1 ng / mL de IL-17, pistas 3 e 4 = 0,50 ng / mL, As pistas 5 & 6 = 0,25 ng / il, Lanes 7 e 8 = 0,125 ng / mL) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Recuperação de antigénio de Mycobacterium tuberculosis e citocinas IL-2 a partir de urina utilizando nanopartículas de hidrogel. Coloração de prata após 1-D gel eletroforese das amostras de urina. As amostras nas pistas U4 e U6 representa eluatos a partir de amostras de urina contendo recombinante ESAT-6 e IL-2, mostrando claramente bandas predominantes a 15 kDa. Espectrometria de massa dos extratos identificados ESAT-6 (UniProt POA567 adesão, 84,0 cobertura, 9 peptídeos) e IL-2 (P60568 UniProt adesão, 38,56 cobertura, 3 peptídeos). (RAW = urina sem colheita de nanopartículas; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urina falta recombinante ESAT-6 e IL-2 após a colheita de nanopartículas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome Protein | Número proteína GI | A concentração no soro / plasma [ng / ml] | Referência |
| abl interactor uma isoforma um | 61743942 | Desconhecido | |
| Ativada por AMP proteína quinase gama2 subunidade isoforma um | 33186925 | Desconhecido | |
| Cas-Br-M (murino) ecotr�ico retroviral transformadora seqüência | 52426745 | Desconhecido | |
| quimiocinas (CC motif) ligando 18 (pulmonar e ativação regulamentado) | 4506831 | 30 | 34 |
| quimiocinas (CC padrão) ligando 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Desconhecido | |
| cromossomo 16 grelha de leitura aberta 80 | 8392875 | Desconhecido | |
| Consortin | 213021160 | Desconhecido | |
| defensina, alfa 4, corticostatin | 4503303 | Desconhecido | |
| 20149675 | Desconhecido | ||
| glicoproteína Ib (plaquetas), polipéptido de beta | 4504073 | Desconhecido | |
| proteína de ligação ao nucleótido guanina (proteínas G), q polipeptídeo | 40254462 | Desconhecido | |
| Heparanase | 148746204 | Desconhecido | |
| factor de crescimento tipo insulina 2 (somatomedina A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Desconhecido | |
| leucócito-célula derivada quimiotaxina 2 | 59806345 | 200000 | 33 |
| lipocalina 2 (24p3 oncogene) | 38455402 | 0,05 | 28 |
| Monoglicérido lipase, CRA_b isoforma | 6005786 | Desconhecido | |
| -N-etilmaleimida sensível proteína factor de fixação, alphuma | 47933379 | Desconhecido | |
| um homeobox corte 2 | 119220564 | Desconhecido | |
| fibra exterior densa das caudas do esperma 4 | 171184433 | Desconhecido | |
| palato, pulmão e nasal epitélio associado | 18765705 | Desconhecido | |
| proteína reconhecimento peptidoglycan 2 | 156616294 | Desconhecido | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| CASC3 Protein | 15721939 | Desconhecido | |
| RAB27B, RAS membros oncogene família | 5729997 | Desconhecido | |
| Associação Ras (RalGDS / AF-6) familiares domain 6 isoforma um | 29789443 | Desconhecido | |
| relacionado-ras RAB10 proteína de ligação GTP | 33695095 Desconhecido | ||
| anel de proteína de dedo 166 | 30520320 | Desconhecido | |
| resposta de privação de soro (a proteína de ligação a fosfatidilserina) | 4759082 | Desconhecido | |
| família portadora de soluto 33 (acetil-CoA transportador), membro 1 | 4757708 | Desconhecido | |
| ST6 beta-galactosamide alfa-2,6-sialyltranferase uma isoforma de um | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosin-like 3 | 34013530 | Desconhecido | |
| transducina-como potenciador de separação 3 (E (sp135) homólogo, Drosophila) | 157384982 | Desconhecido | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | Desconhecido | |
| WD domínio repetição 1 | 9257257 | Desconhecido | |
| WD domínio repetição 91 | 222080092 | px; "> Unknown||
| repetição contendo 2 xin actina-binding | 119372317 | Desconhecido |
1 Exemplo de proteínas de baixa abundância de mesa colhidas por nanopartículas de soro / plasma. (PeptideAtlas peptidoma espectrometria de massa) 28-34 Adaptado com referência permissionfrom 13 (Tamburro, D. et al nanopartículas de núcleo-revestimento multi-funcional:... Descoberta de biomarcadores anteriormente invisíveis J Am Chem Soe, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
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Discussion
Relevância Clínica
Uma amostra de soro ou plasma é pensado para conter baixa abundância de proteínas e peptídeos que podem proporcionar uma fonte rica de informações sobre o estado do organismo como um todo em circulação. Apesar da promessa de proteômica de soro, há três barreiras fisiológicas fundamentais e graves dificultando a descoberta de biomarcadores e tradução para o benefício clínico 10, 11, 16, 25.
1. biomarcadores de diagnóstico importantes podem existir em abundância extremamente baixa (concentração) no sangue. Estágio tecido doente cedo, como lesões de câncer de pré-metastáticos, podem constituir menos de alguns mm 3. Biomarkers derramado para a circulação de tal volume de tecido pequena ficará muito diluído em todo o volume de sangue. Podem existir analitos relevantes abaixo dos limites de detecção de espectrometria de massa e os imunoensaios convencionais.
2. biomarcadores baixa abundância /proteínas são mascaradas pela presença de proteínas abundantes elevados, tais como albumina e imunoglobulina, que representam até 90% do proteoma do plasma 14.
3. proteínas e peptídeos são suscetíveis à degradação por proteases endógenas e exógenas seguinte punção venosa e amostra de transporte / armazenagem. Degradação de proteínas pode levar a resultados negativos falsos positivos ou falsos 35.
Nanopartículas de hidrogel foram desenvolvidos como porosas, dinamismo, polímeros contendo corantes anthraquinonetriazine e / ou conchas de ácido vinilsulfónico de proteínas e peptídeos colheita e preservação em fluidos corporais 11, 13. Nosso grupo sintetizados e testados nanopartículas de hidrogel funcionalizados com uma infinidade de corantes orgânicos (ie. , sulfonados e corantes não-sulfonatedanthraquinonetriazine) e mostrou as afinidades preferenciais para vários proteína analitos 11, 13. Também estabelecemos protocolos de descoberta de biomarcadores que usarnanopartículas de hidrogel com linfa, saliva, líquido cefalorraquidiano, suor, urina, plasma, sangue, soro ou amostras 11, 13, 23, 24, 26.
Otimizar os parâmetros de colheita de nanopartículas antes de proteínas de colheita de preciosas amostras clínicas / de pesquisa é necessário para obter resultados ideais. A quantidade de proteína nas amostras devem ser quantificado para determinar a razão óptima de nanopartículas de volume da amostra. Para analitos de concentração desconhecida, uma curva dose-resposta utilizando as proteínas recombinantes fornece informações sobre os limites de detecção. Se houver amostra adequado, vários tipos de nanopartículas podem ser usadas para determinar a nanopartícula ideal para o analito e espécime.
O exame de urina antes da colheita de nanopartículas proporciona um controlo de qualidade da amostra de urina. A afinidade do corante isca nanopartícula depende do ponto isoeléctrico da proteína de interesse e o pH do meio circundante. O pH urinário sertre 5,5 e 7,0 é o ideal para a colheita de proteína com os poli (NiPAM / corante) nanopartículas. A presença de glóbulos vermelhos ou hemolisadas intactas (1 + de sangue na tira de reagente) não interfere com a colheita de nanopartículas.
Neste protocolo, focada na aplicação das nanopartículas de hidrogel para colher proteínas do plasma e na urina. As aplicações futuras poderão incluir outros fluidos corporais, tais como vítreo do olho, ou fluido sinovial. Potencial em aplicações in vivo pode ser vislumbrada para o futuro em que as nanopartículas são injetadas em tecido doente para coletar biomoléculas. Trabalho futuro também ser focada no desenvolvimento de novos dispositivos para a captura e preservação de biomarcadores, tais como um adesivo para a pele à base de nanopartículas para a análise do proteoma transudado pele.
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Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, gentilmente ajudou na coleta e análise de dados mostrado na Figura 5. Este trabalho foi financiado parcialmente por (1) George Mason University, (2) o italiano IstitutoSuperiore di Sanita », no âmbito da Itália / EUA acordo de cooperação entre o Departamento de Saúde e Serviços Humanos, George Mason University, e do Ministério da Saúde Pública italiano, (3) NIH, bolsas do programa IMAT 1R21CA137706-01 e 1R33CA173359-01 a LAL, e (4) Ceres Nanociências, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
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