Abstract
新型生物标志物的发现在提供更多的敏感性和特异性疾病检测至关重要的作用。不幸的是许多存在于生物流体中低丰度生物标记物不能容易地与质谱法或免疫测定法,因为它们存在于非常低的浓度,是不稳定的,并且往往是由高丰度蛋白质,如白蛋白或免疫球蛋白掩蔽检测。诱饵含聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)基于纳米颗粒是能够克服这些生理屏障。在一个步骤中,他们能够捕捉,集中和保持体液的生物标记物。低分子量的分析物进入所述纳米颗粒的核心,由不同的有机的化学染料,它作为高亲和力蛋白诱饵被捕获。该纳米颗粒可以由几个数量级集中感兴趣的蛋白质。这个浓度因子是足以增加蛋白质水平,使得蛋白质内的目前质谱仪,免疫印迹和免疫检测限。纳米颗粒可以一起孵育过多的生物体液和它们能够极大丰富的低分子量蛋白质和肽的浓度,同时排除白蛋白和其它高分子量的蛋白质。我们的数据表明,在特定分析物的浓度的10,000倍放大,可以实现,使质谱和免疫检测以前无法检测的生物标志物。
Introduction
尽管完成了人类基因组测序,显著进展尚未作出确定的生物标志物预测的早期阶段的疾病,或与治疗结果,或预测1相关。其中一个原因缺乏进展是,很多潜在的生物标志物显著以低于传统质谱和其他生物标志物发现平台的检测极限浓度存在。质谱(MS)和多反应监测(MRM)具有典型的检测灵敏度大于50纳克/毫升,而在50 pg / ml和10毫微克/毫升在临床实验室下降了免疫测定的范围广大的分析物的。这意味着许多生物标志物,特别是在疾病的早期阶段无法通过常规的MS和MRM 2被检测到。除了高丰度蛋白质,如白蛋白和免疫球蛋白的复合物的生物流体的存在往往掩盖由十亿倍货存ESS的低丰度,低分子量蛋白质和肽3,4。为此几个样品的准备步骤之前所需要质谱测序和鉴定。一个这样的预备步骤中采用的高丰度蛋白质的与市售的耗尽列5-8的耗尽。不幸的是这一步骤导致候选生物标志物的产率的降低,因为它们通常是非共价地与该被除去的载体蛋白相关联。另一个挑战是候选生物标志物前体的稳定性表示,一旦样品的采集。蛋白质是发生降解内源性或外源性蛋白酶9。水凝胶的纳米颗粒可以通过扩增推定的生物标志物的浓度,以测定的范围内的电平超越这些关键的挑战,同时保护蛋白免受降解10-13。
要注意个很重要在LMW在血液中的蛋白质是小完整蛋白质以及大蛋白的片段的混合物。组织来源的蛋白质比60 kDa的较大的过大而不能穿过血管基底膜被动地进入血流,但它们可以在血液中作为肽或蛋白质片段14来表示。我们的目标是测量新颖循环生物标志物,可以是候选疾病的早期发现,患者分层为治疗,并监测对治疗的反应。在创建了纳米颗粒选择性地排除高丰度的免疫球蛋白和白蛋白,同时捕获较小的蛋白质和肽,并根据初始体积上集中起来,以100倍。
我们的团队确定了一套小的有机染料,可成功地用作高亲和力的分子饵料蛋白质和多肽。蛋白质 - 染料的结合被认为是由于疏水性和静电相互作用的结合第对染料的芳环交织经由蛋白质上的表面11的疏水口袋的蛋白质。
的毒饵,这取决于它们的化学性质,表现出分析物的选择的类的特定亲和力。诱饵与载体蛋白竞争,如白蛋白,用于蛋白质或肽。低分子量蛋白/肽被截留在颗粒中。高分子量的蛋白质,如白蛋白和球蛋白是从进入的,因为筛分能力的粒子可防止因水凝胶11(图1)的限制孔。
水凝胶粒子是通过由过硫酸铵11开始沉淀聚合合成。异丙基丙烯酰胺(NIPAM),丙烯酸(AAC)和烯丙基胺(AA)和交联剂N,N'-亚甲基双(BIS)的共聚单体被允许在70℃下反应6小时,在稀释条件11,13。聚的高蛋白结合亲和性(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)(聚(NIPAM-CO-AAC)nanoparticlesis通过共价掺入含氨基的染料( 即 ,sulfonatedanthraquinonetriazine染料)在纳米粒子,通过实现在这取决于染料的亲水/疏水特性的水性或有机溶剂中进行的酰胺化反应如图11所示,用一个anthraquinonetriazine染料的氯原子在纳米颗粒中的胺基团的13。亲核取代被用于创建聚含染料(NIPAM -共聚-丙烯胺)(AA)的纳米颗粒11,12。的两步聚合方法被用来创建含有乙烯基磺酸(VSA)11,13的外壳的水凝胶粒子。
水凝胶纳米粒子可用于各种生物流体,包括全血,血浆,血清,脑脊液,汗液,尿等。在一个步骤中,在溶液中,nanoparticles进行快速(几分钟内)封存和低分子量的分析物浓度10,11,13,15-18。蛋白质随后从纳米颗粒洗脱和检测用蛋白质印迹19-21,质谱法10,11,13,15,18,22,23,免疫/ ELISA 10,11,15,18,或反相蛋白质微阵列16, 24测定。纳米功能化化学饵料,并提出核或核 - 壳结构,捕捉和集中的基础上饵/壳的物理化学性质的蛋白质。因此,掺入纳米颗粒不同的染料将捕获的蛋白质的不同亚群具有不同的基础上,染料亲和效率,溶液的pH,并且存在/不存在竞争的高丰度蛋白13。此外,纳米颗粒的相对量,以将溶液的体积将影响从纳米颗粒中的蛋白质的产率。这些方面水凝胶的纳米粒子的收获是使用三种不同的纳米颗粒饵收割蛋白是由含有高含量的蛋白质的血浆样品显示出,并从尿样品通常不包含大量的蛋白质。在这个协议中,我们证明收获和浓缩使用聚(NIPAM-CO-的AAc),聚(NIPAM /染料),以及核 - 壳纳米颗粒的血浆样品的肿瘤坏死因子α(TNFα)(聚(NIPAM-CO-VSA)) 。聚(NIPAM /染料)的纳米颗粒被示为集中于加入人尿样品分枝杆菌抗原,以模仿结核分枝杆菌感染的个体。
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Protocol
人血浆和尿液是从健康志愿捐献者采集,并以书面的知情同意书,下面的乔治·梅森大学机构审查委员会批准的协议。捐助者平均分配白人男性和女性之间的25和42样品进行单独分析岁之间,并没有合并。
血清或血浆样品1纳米工艺
在等离子体电势低丰度生物标记物被捕获,在溶液中,用凝胶粒子。将粒子加入到等离子体中,温育,通过离心分离,洗涤,和所捕获的蛋白被洗脱。将洗脱的蛋白质根据用于下游质谱测序和鉴定的氮气流中干燥。
- 在离心管2与50毫米TrisHCl pH值为7(500微升血+500微升TrisHCl)的稀释:500微升血清1。
- 加入500μl聚(异丙基丙烯酰胺/ AAC)核心nanop的文章。孵育15分钟,在室温。
- 在装有固定角转子的离心旋转的样品在16,100 XG,25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
- 加入500μl加入硫氰酸钠(25毫摩尔)的粒料。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
- 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG,25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
- 加入500微升的MilliQ水的纳米颗粒沉淀。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
- 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG,25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
- 准备新鲜的洗脱缓冲液:加入700μL乙腈300μL氢氧化铵在一个干净的试管中。注意:氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当的通风。注意:洗脱缓冲液必须准备ARED即将使用前。请勿将洗脱缓冲液。
- 加入300微升的洗脱缓冲液中的纳米颗粒。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。孵育15分钟,在室温。
- 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG,25℃下进行10分钟。取出并保存洗脱液在干净,标记的离心管。
- 重复步骤1.9 - 1.10。二者结合起来洗脱液为一体的离心管。
- 干燥下,在氮气蒸发器歧管的氮气流的洗脱液在42.1℃,用空气流设置为8( 图2F)。
- 储存在室温下干燥洗脱液为O / N个存储,或在-20℃下长期贮存,前质谱法,免疫印迹,或酶联免疫吸附试验(可选)。
尿液样本2纳米工艺
正常尿液中含有低于30毫克/分升的蛋白质和比1 +血少。然而,很多疾病/状况可能改变尿蛋白和血液的正常水平。为了帮助确定纳米颗粒的最佳量添加到尿样,尿分析之前进行纳米粒子的收获进行。尿液生物标志物可以存在于非常低的浓度,这可能需要优化的纳米颗粒的比对尿量。此过程说明了下游Western blot分析尿液样本的纳米粒子收获。
- 收集尿液样本中的清洁,干燥的塑料杯。 à22毫升最小的体积是必需的。商店尿液标本在-80°C,直到准备分析。
- 解冻的冷冻尿液在室温或4°CO / N。在旋涡混合器简要组合。倾至少22毫升尿入50毫升的锥形底聚丙烯管中。
- 旋尿中有水平转子离心机在3700 XG 15分钟。倒出尿液,而不会干扰颗粒,放入干净的50ml锥形底polypropylene管。弃沉淀。
- 使用多分析物“尿液试纸”的试剂条进行尿检。注意事项:避免阳光直射,湿度17,18的试纸存放在密闭的容器了。
- 莱试剂条,面朝上,放在干净,干燥的纸巾。
- 使用一次性吸管吸1毫升步骤2.3准备的尿液。
- 2分钟设置一个计时器,但不启动它。快速分配1 - 在试剂条的每个测试点2滴尿。立即启动定时器。注意:不要直接在尿液的容器浸入试剂条。在试剂条上的染料/化学指标可以潜在浸出试剂条的进入尿液的容器中。
- 在使用的试剂条容器所指示的时间,由单独的试剂条的颜色进行比较,对相应的颜色编码的籼稻记录定性结果的试剂条上的各种分析物器试剂容器上。典型的正常尿的结果是:(正常的或负的)的血液,蛋白质,白细胞,亚硝酸盐,葡萄糖,酮,胆红素和尿胆素原;尿pH值(5.5 - 7.0);比重(1.001 - 1.020)。注意:高蛋白质水平在尿液样本可以与感兴趣的蛋白质竞争结合于所述纳米颗粒的站点。为了最大限度地提高蛋白质的收获与纳米颗粒,该纳米颗粒体积/尿体积比率可以调整为从高丰度蛋白质或者限制竞争,或者可以被优化到收获中存在的浓度非常低的蛋白质。如果尿蛋白值是1 +或更高,在下面的步骤中添加2.5纳米的2倍量。如果感兴趣的分析物是非常低丰度蛋白质,它可能是必要的,以增加纳米颗粒的量最多至2ml(图3)。
- 将20毫升的尿液澄清步骤2.3到一个干净的50ml锥形底聚丙烯管。别扰乱任何碎片/丸粒可能在尿液管的底部。加入200μl纳米颗粒的20毫升尿样。在旋涡混合器简要组合。注意:如果尿蛋白值是1 +或更高,加入400μl的纳米颗粒到20ml的尿液。
- 30分钟,在室温下孵育尿/纳米颗粒的混合物,无摆动/混合。
- 旋尿/纳米颗粒悬浮液在配备水平转子在3700离心10 min的离心机。注意:如果粒料是不可见的离心后,旋转试样进行一个额外的2 - 7分钟。
- 拆下并丢弃上清液。加入500μl的MilliQ水的纳米颗粒沉淀。
- 通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。纳米粒子溶液转移到一个干净的1.5 ml离心管。
- 纺纳米颗粒在装备有固定角度转子以16,100 xg离心10分钟,离心。注意:如果小球是不可见的甲级降脂离心,旋转试样进行一个额外的2 - 7分钟。
- 拆下并丢弃上清液。
- 重复步骤2.8和2.11(两次),用200μl18的MilliQ水冲洗该纳米颗粒。
- 准备新鲜的洗脱缓冲液:加入970μL乙腈至30微升氢氧化铵在一个干净的试管中。注意:氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当的通风。注意:洗脱缓冲液必须临用前制备。请勿将洗脱缓冲液。
- 加入20微升的洗脱缓冲液的纳米颗粒沉淀。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。孵育15分钟,在室温。
- 纺纳米颗粒样品在16100×g离心10分钟。取出并保存在上清干净,1.5 ml离心管。不破坏纳米颗粒。丢弃在生物危害的垃圾沉淀。
- 将样品在通风橱机架。打开瓶盖和公司ubate在室温30分钟。或者,将下在40℃的氮气流中的样品直至干燥(1 - 2小时)。
- 加入15微升的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2×)的样品。热火100 ℃,在5分钟的盖子,直至留在管内的体积的干热块是不超过20微升。注意:不要用沸水浴中。从水浴中的湿度会防止缓冲器的蒸发。
- 广场上的管帽。从加热块中取出试管。可将样品保存在-80℃下或立即用于下游免疫印迹分析。
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Representative Results
水凝胶纳米粒子大小和均匀度
聚(NIPAM-AAC)颗粒已产生极高的收益率和可重复性的和批次内。所述颗粒具有在RT非常好的胶体稳定性期间需要用于捕获,存储,和蛋白质的洗脱(至少48小时)的时间,以及纳米颗粒沉淀没有被观察到( 图1)11。胶体稳定性可能是由该纳米颗粒快速蛋白质/肽的摄取很重要。
从血浆中收获潜在的低丰度生物标志物
染料诱饵的掺入驱动在溶液分子的吸收和保证了捕获分子被降解13,15,18,25保留。出于这个原因,样品前处理过程中不需要蛋白酶抑制剂。纳米粒子的这种属性使得它们Šuitable作为一种保鲜技术在该领域的样品采集和生物液体在室温发货。
诱饵分子可以通过共聚合或共价结合至存在于纳米粒子的官能团的水凝胶颗粒掺入。作为一个例子,聚(NIPAM-CO-的AAc)纳米粒子被构造有通过零长度的交联酰胺化反应的含氨基的染料,而纳米颗粒与含有乙烯基磺酸(VSA)的共聚物的外壳是由一第二聚合反应10-13创建。不同类型的纳米粒子可以通过在纳米粒子中掺入不同的化学染料,从而提高收获蛋白质的特定类的制备。我们的技术的一个重要概念是不同的诱饵可以显示为不同的蛋白质的优先亲和力,因为染料 - 蛋白质相互作用是主要依赖于疏水性相互作用的组合,三维INTERAC系统蒸发散,且静电力。我们已经观察到,一些分析物可以与因结合力的复杂化学上不同的染料具有高亲和力捕获。见Tamburro 等人对这一原则13广泛的说明和例子。例如,四种不同类型的捕获诱饵(纳米颗粒)被用来从用200μl的颗粒与200μl的血浆为每种类型的纳米粒子的等离子体收获TNFα。在用纳米颗粒处理后的所有情况下,TNFα是不可检测上清液中通过SDS-PAGE和银染,而TNFα是可检测的纳米颗粒洗脱物( 图1C)。 (巷1 =重组肿瘤坏死因子α(分子量17000道尔顿),泳道2和3,4和5,6和7和8和9分别代表结果为四种不同类型的纳米颗粒毒饵C =控制,S =上清液,P =纳米粒子洗脱液)。
剂量-反应的迪菲Ñanoparticles租类型
为了执行校准曲线,并由此评估产率和精确度,实验需要用已知浓度的尖刺,在蛋白上进行。发表的结果,适用于各种体液和分析物的示范如何纳米颗粒预处理保持测定的线性度,并建立在提高检测10,16,26的有效极限的校准曲线。我们还公布的实验室间精密度研究使用纳米粒子进行多反应监测质谱具有增强的灵敏度27。
以由不同类型的纳米粒子的比较IL-17的收获效率,重组IL-17(17.5 kDa)的加入到其中任一聚(NIPAM-CO-AAC)或聚(NIPAM-CO-VSA)纳米颗粒随后加入的血浆样品。两组的100纳克重组IL-17的4系列稀释液制备10081,L等离子(100毫微克/ 100微升,50毫微克/ 100微升,25毫微克/ 100微升至12.5纳克/ 100微升)。聚(NIPAM-CO-AAC)或聚(NIPAM-CO-VSA)的颗粒加入到各自的血浆样品中的1:1(体积/体积)的粒子:血浆比率。分光光度法总蛋白测定法对上清液样品进行。后的纳米粒子的收获和纳米颗粒洗脱物(P)( 图4)上的20微克血浆上清液(S)的混合物进行用抗兔多克隆IL-17的蛋白质印迹。两个纳米颗粒的类型适当地收集和浓缩IL-17在每个稀释度。在免疫印迹实验的额外条带代表的人血清白蛋白和免疫球蛋白,与二级抗体交叉反应。 (AAC颗粒:泳道1&2 = 1毫微克/微升,IL-17,泳道3和4 = 0.50毫微克/微升,泳道5和6 = 0.25毫微克/微升,泳道7和8 = 0.125纳克/微升,泳道9 = IL-17; VSA颗粒:泳道1&2 = 1毫微克/微升,IL-17,泳道3和4 = 0.50毫微克/微升,泳道5&6 = 0.25纳克/微升,泳道7和8 = 0.125纳克/微升)。
检测尿中潜在的诊断蛋白
人尿样品中,从健康志愿者供体与书面的知情同意书获得,被掺入的重组分枝杆菌抗原早期分泌靶结核分枝杆菌蛋白(ESAT-6),以模仿结核分枝杆菌感染的个体。 1微克每ESAT-6(15 kDa的)和IL-2(15.5 kDa)的加入到1ml等份人尿从健康志愿者供体收集。尿分析是对样品进行了尿液试剂条,以确定纳米颗粒以尿液,这是基于存在/不存在的尿蛋白质量的最佳比例。保利(NIPAM /染料)纳米颗粒被用来收获的处理和未经处理的尿液样本的蛋白质。被˚F执行的纳米颗粒洗脱物的一维凝胶电泳银染ollowed。在U4和U6泳道样品代表由ESAT-6和IL-2处理的尿液样品的纳米颗粒洗脱,清楚地显示出,在15 kDa的( 图5)突出的频带。确定ESAT-6(UniProt登录POA567,84.0覆盖,9肽)和IL-2(UniProt登录P60568,38.56覆盖,3肽)的洗脱液的质谱。无尿纳米收割显示在带有“原始”的车道。
图1纳米粒子的收获,集中从复杂生物液体低丰度蛋白(A)工作流程收获蛋白质。总的处理时间约为1.5小时。在溶液中的蛋白质浓缩从血液,血清,血浆,尿液,汗液,唾液或其他体液(1,000倍浓度的描绘)(B)批与批之间的比较表明纳米粒子的大小均匀。原子力显微镜在云母显示尺寸(0.7微米直径)和不存在结块的分两批纳米颗粒的均匀性(℃)1-D凝胶电泳,随后银染的肿瘤坏死因子α(TNFα)螯合从等离子体。 请点击这里查看该图的放大版本。
从血浆/血清下游质谱分析图2纳米粒子的收获步骤:(A)纳米颗粒保持悬浮在溶液中(聚(NIPAM /染料)示出),(B)纳米粒子加入到稀释的血浆样品(C)的纳米粒子的等离子体悬浮íš纺丝在离心机中,以纳米粒子从上清液分离(D)后离心分离,将纳米颗粒形成明显的沉淀在试管底部(E)洗涤该纳米颗粒后,将含有所收集的蛋白质的洗脱物被除去,并保存对于下游分析(F)的洗脱液在42.1℃,空气流量8,1在氮气流中干燥蒸发器- 2小时前质谱请点击这里查看该图的放大版本。
图3:采用尿多分析物试剂条的样品的质量控制。 (A)中的试剂条上的每个垫含浸,其与不同的反应的化学物质,酶和/或指示剂染料耳鼻喉科尿液分析物( 例如 ,葡萄糖,胆红素,酮,比重,血,pH值,蛋白质,尿胆素原,亚硝酸盐,和/或白细胞酯酶)。尿通过离心澄清。一滴尿液加入到试剂条上的每个垫(B)每个打击垫的颜色是视觉的容器上的色块对比,在指定的时间, 请点击这里查看该图的放大版本。
图4。 从血浆中使用的核心(AAC)或核-壳(VSA)纳米粒子收获的IL-17。 1-D凝胶电泳和Western用抗IL-17的印迹表明丙烯酸(AAC)和VSA芯壳纳米颗粒的收获各种conce的能力IL-17的血浆ntrations。后的纳米粒子的收获(S =上清液,P =纳米颗粒的洗脱液的AAc颗粒:泳道1&2 = 1毫微克/微升,IL-17,泳道3和4 = 0.50毫微克/微升,泳道5和6 = 0.25ng /微升,泳道7&8 = 0.125纳克/微升,泳道9 = IL-17; VSA颗粒:泳道1&2 = 1毫微克/微升,IL-17,泳道3和4 = 0.50毫微克/微升,泳道5和6 = 0.25纳克/微升,泳道7和8 = 0.125纳克/微升), 请点击这里查看该图的放大版本。
恢复的结核分枝杆菌抗原和细胞因子IL-2从尿使用的水凝胶粒子的图5。 银染下1-D GEL电泳尿液样本。在泳道U4和U6样品代表从含有重组ESAT-6和IL-2,清楚地显示出,在15 kDa的突出带的尿样洗脱液。确定ESAT-6(UniProt登录POA567,84.0覆盖,9肽)和IL-2(UniProt登录P60568,38.56覆盖,3肽)的洗脱液的质谱。 (RAW =无尿纳米收获; U1,U2,U3,U5,U7,U8 =尿缺乏重组ESAT-6和IL-2纳米以下的收获)。 请点击这里查看该图的放大版本。
蛋白质名称 | 胃肠道蛋白质数量 | 在血药浓度/血浆[毫微克/毫升] | 参考 |
ABL-交互器1素相关的 | 61743942 | 未知 | |
AMP激活的蛋白激酶GAMMA2亚素相关的 | 33186925 | 未知 | |
CAS-BR-M(鼠)亲嗜性逆转录病毒序列转化 | 52426745 | 未知 | |
趋化因子(CC基序)配体18(肺和活化调节) | 4506831 | 30 | 34 |
趋化因子 (CC基序)配体5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
chondroadherin | 153251229 | 未知 | |
16号染色体的开放阅读框80 | 8392875 | 未知 | |
Consortin | 213021160 | 未知 | |
防御素,阿尔法4,corticostatin | 4503303 | 未知 | |
20149675 | 未知 | ||
糖蛋白IB(血小板),β多肽 | 4504073 | 未知 | |
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),Q多肽 | 40254462 | 未知 | |
乙酰肝素酶 | 148746204 | 未知 | |
胰岛素样生长因子2(促生长因子A) | 189083846 | 115px;“> 10030 | |
催泪蛋白 | 15187164 | 未知 | |
白血球细胞衍生的趋化2 | 59806345 | 200000 | 33 |
脂质运载蛋白2(癌基因24p3的) | 38455402 | 0.05 | 28 |
单甘酯脂肪酶,异构型CRA_b | 6005786 | 未知 | |
N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白,ALPHá | 47933379 | 未知 | |
1切2同源 | 119220564 | 未知 | |
外致密的纤维精子尾部4 | 171184433 | 未知 | |
腭,肺和鼻腔上皮细胞有关 | 18765705 | 未知 | |
肽聚糖识别蛋白2 | 156616294 | 未知 | |
77695917 | 4 | 29 | |
蛋白质CASC3 | 15721939 | 未知 | |
RAB27B,成员ras癌基因家族 | 5729997 | 未知 | |
Ras相关(RALGDS / AF-6)结构域家族6素相关的 | 29789443 | 未知 | |
Ras相关GTP结合蛋白RAB10 | 33695095 | 未知||
环指蛋白166 | 30520320 | 未知 | |
血清剥夺反应(磷脂结合蛋白) | 4759082 | 未知 | |
溶质载体家族33(乙酰CoA转运),成员1 | 4757708 | 未知 | |
ST6中的β-galactosamide字母2,6-sialyltranferase 1素相关的 | 27765091 | 15 | 32 |
胸腺肽类3 | 34013530 | 未知 | |
分体式3转导般增强剂(E(SP135)同源,果蝇) | 157384982 | 未知 | |
转谷氨酰胺酶1 | 4507475 | 未知 | |
WD重复结构域1 | 9257257 | 未知 | |
WD重复结构域91 | 222080092 | PX;“>未知||
新肌动蛋白结合含2重复 | 119372317 | 未知 |
表1实施例的低丰度蛋白的纳米颗粒从血清/血浆收集。 (PeptideAtlas多肽组质谱)28-34适于与permissionfrom参考图13(Tamburro,D. 等多官能的核-壳纳米颗粒:。以前看不见的生物标记物的发现J上午化学学会杂志 ,133,19178-19188,(2011年)。)版权所有2011美国化学学会。
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Discussion
临床意义
血清或血浆样品被认为含有低丰度循环的蛋白质和多肽可提供的信息有关的生物体作为一个整体的国家的丰富来源。尽管血清蛋白质组学的承诺,有三个基本的和严重的生理障碍,阻碍生物标志物的发现和翻译临床获益10,11,16,25。
一,重要诊断标志物可能存在于非常低丰度(浓度)在血液中。早期病变组织,例如预转移性癌症病灶,可以构成小于几个毫米3。生物标志物从这样一个小的组织体积脱落到循环会变得高度稀释在整个血液量。相关分析物可能存在以下质谱和常规免疫测定的检测限。
2,低丰度生物标志物/蛋白质是由高丰度蛋白质,如白蛋白和免疫球蛋白,它们代表最高达90%的血浆蛋白质组14的存在掩蔽。
3,蛋白质和肽是由内源性和外源性蛋白酶容易退化下列静脉穿刺和样品运输/储存。蛋白质降解可能导致假阳性或假阴性结果35。
水凝胶纳米粒子开发为多孔,浮力,含有人体anthraquinonetriazine染料和/或乙烯磺酸壳蛋白质和多肽的收获和保护聚合物体液11,13,我们的小组合成和测试功能化与大量的有机染料( 即水凝胶纳米粒子。 ,磺化和非sulfonatedanthraquinonetriazine染料),并显示优惠亲和力几种蛋白质分析物11,13,我们还建立了使用生物标志物的发现协议水凝胶纳米粒子与淋巴,唾液,脑脊液,汗液,尿液,血浆,血液或血清样本11,13,23,24,26。
从珍贵的临床/科研标本优化纳米粒子参数收获收获前的蛋白质是必要的理想效果。蛋白质的样品中的量应加以量化,以确定纳米颗粒对样品体积的最佳比例。对于未知浓度的分析物,利用重组蛋白的剂量 - 反应曲线提供了关于检测限的信息。如果有足够的样品,不同类型的纳米粒子可以被用来确定理想的纳米颗粒对分析物和样品。
之前的纳米粒子收获尿检提供尿液样本的质量控制检查。该纳米颗粒染料诱饵的亲和力取决于所感兴趣的蛋白和周围介质的pH值的等电点。尿液pH值是吐温5.5和7.0是最佳的蛋白质收获与聚(NIPAM /染料)的纳米颗粒。溶血的或完整的红血细胞的存在(1 +血试剂条上)不干扰的纳米粒子的收获。
在这个协议中,我们集中在水凝胶粒子中的应用来收集从血浆和尿蛋白。未来的应用可以包括其它体液如玻璃体眼,或滑液。潜在的体内应用,可以设想为,其中纳米颗粒被注入到病变组织,收集生物分子的未来。今后的工作也将集中在用于捕获和保存的生物标志物,新设备的开发,如纳米粒子为基础的皮肤贴剂,为肌肤漏出蛋白质组的分析。
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Acknowledgments
迈克尔·亨利,都柏林城市大学,请协助与图5所示的数据收集和分析,这项工作得到了部分支持(1)乔治·梅森大学,(2)意大利IstitutoSuperiore二SANITA“在意大利/美国框架健康的乔治·梅森大学的美国能源部和人类服务部,以及公共卫生意大利外交部,(3)美国国立卫生研究院,IMAT计划资助1R21CA137706-01和1R33CA173359-01对上湖人,以及(4)谷神星纳米科学公司之间的合作协议。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
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