Abstract
La découverte de biomarqueurs roman joue un rôle crucial dans la fourniture de la détection de la maladie plus sensible et spécifique. Malheureusement, de nombreux biomarqueurs faible abondance qui existent dans les fluides biologiques ne peuvent pas être facilement détectés par spectrométrie ou immuno-essais, car ils sont présents en très faible concentration, sont labiles, et sont souvent masqués par des protéines de haute abondance comme l'albumine ou immunoglobulines masse. Appât contenant du poly (N-isopropylacrylamide) (NiPAM) des nanoparticules à base sont en mesure de surmonter ces barrières physiologiques. En une seule étape, ils sont capables de capturer, de se concentrer et de préserver les biomarqueurs de fluides corporels. Analytes de faible masse moléculaire pénètrent dans le noyau de la nanoparticule et sont capturés par différents colorants chimiques organiques, qui agissent comme des appâts de haute affinité de la protéine. Les nanoparticules sont capables de concentrer les protéines d'intérêt par plusieurs ordres de grandeur. Ce facteur de concentration est suffisante pour augmenter le niveau de protéine de telle sorte que les protéines sont dans l'la limite de détection de courant de spectromètres de masse, un transfert de Western, et les dosages immunologiques. Les nanoparticules peuvent être incubées avec une grande variété de fluides biologiques et qu'ils sont capables d'enrichir considérablement la concentration de protéines et de peptides de faible poids moléculaire tout en excluant l'albumine et d'autres protéines de haut poids moléculaire. Nos données montrent que 10 000 fois l'amplification de la concentration d'un analyte particulier peut être réalisé, ce qui permet la spectrométrie de masse et des analyses immunologiques pour détecter les marqueurs précédemment indétectables.
Introduction
Malgré l'achèvement du séquençage du génome humain, des progrès significatifs ont pas été réalisés dans l'identification des biomarqueurs prédictifs de la maladie à un stade précoce, ou qui en corrélation avec le résultat thérapeutique, ou le pronostic 1. Une des raisons de cette absence de progrès est que de nombreux biomarqueurs potentiellement importantes existent à une concentration inférieure à la limite de détection de la spectrométrie de masse conventionnelle et d'autres plates-formes de découverte de biomarqueurs. La spectrométrie de masse (MS) et la sclérose en surveillance de réaction (MRM) ont une sensibilité de détection typiquement supérieure à 50 ng / ml alors que la majorité des analytes mesurés par des dosages immunologiques à une chute en laboratoire clinique dans la plage comprise entre 50 pg / ml et 10 ng / ml . Cela signifie que de nombreux biomarqueurs, en particulier dans les premiers stades d'une maladie ne peuvent pas être détectés par MS conventionnelle et MRM 2. En outre, la présence de protéines de grande abondance telles que l'albumine et les immunoglobulines dans des fluides biologiques complexes masquent souvent par milliard de fois excess faible abondance, des protéines de faible poids moléculaire et les peptides 3, 4. Pour cette raison, plusieurs étapes de préparation d'échantillon sont nécessaires avant le séquençage par spectrométrie de masse et identification. Une telle étape préparatoire emploie l'épuisement des protéines de haute abondance de commerce colonnes d'épuisement 5-8. Malheureusement, cette étape conduit à la réduction du rendement des biomarqueurs candidats car elles sont souvent associées de manière non covalente avec des protéines de transport qui sont éliminés. Une autre difficulté est représenté par la stabilité de biomarqueurs candidats ex-vivo une fois que les échantillons sont prélevés. Les protéines sont soumises à une dégradation par des protéases endogènes ou exogènes 9. Des nanoparticules d'hydrogel peuvent dépasser ces problèmes critiques en amplifiant la concentration des biomarqueurs putatif à un niveau dans l'intervalle de l'essai, tout en protégeant de la dégradation de la protéine de 10 à 13.
Il est important de noter èmeprotéines à bas poids moléculaire dans le sang sont un mélange de petites protéines intactes ainsi que des fragments de protéines de grande taille. les protéines dérivées du tissu de plus de 60 kDa sont trop grands pour entrer passivement le flux sanguin à travers la membrane basale vasculaire, mais ils peuvent être représentés dans le sang en tant que peptides ou fragments de protéines 14. Notre objectif est de mesurer de nouveaux biomarqueurs circulants qui peuvent être candidats pour la détection précoce de la maladie, la stratification des patients pour le traitement et le suivi de la réponse au traitement. Les nanoparticules sont créés afin d'exclure de manière sélective des immunoglobulines haut de l'abondance de l'albumine et, en même temps, tout en capturant les petites protéines et les peptides et les concentrer jusqu'à 100 fois en fonction du volume de départ.
Notre groupe a identifié un ensemble de petits colorants organiques qui peuvent agir avec succès comme appâts moléculaire élevé d'affinité pour les protéines et les peptides. Liaison protéine-colorant est vraisemblablement due à une combinaison d'interactions hydrophobes et électrostatiquess. Les noyaux aromatiques sur le colorant s'intercalent avec des protéines par l'intermédiaire des poches hydrophobes sur la surface de la protéine 11.
Les appâts, en fonction de leur composition chimique, présentent une affinité particulière pour les classes d'analytes sélectionnés. Les appâts sont en concurrence avec les protéines de transport, telles que l'albumine, des protéines ou des peptides. Les protéines / peptides de poids moléculaire bas deviennent piégés dans la particule. Les protéines de haut poids moléculaire telles que l'albumine et les immunoglobulines sont empêchés de pénétrer dans la particule en raison de la capacité de tamisage du fait de la porosité restrictive de l'hydrogel 11 (figure 1).
Hydrogel nanoparticules sont synthétisées par polymérisation par précipitation initiée par le persulfate d'ammonium 11. AMsopropylacrylamide (NiPAM), co-monomères d'acide acrylique (AAC) et allylamine (AA) et l'agent de réticulation N, N'-méthylène-(BRI) sont mis à réagir à 70 ° C pendant 6 heures dans des conditions diluées 11, 13. L'affinité de liaison élevée en protéines de poly (N-isopropylacrylamide-co-acide acrylique) (poly (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis obtenue en incorporant de manière covalente des colorants contenant des groupes amino (par exemple., Les colorants sulfonatedanthraquinonetriazine) dans les nanoparticules par l'intermédiaire une réaction d'amidation réalisée dans des solvants aqueux ou organiques, selon les caractéristiques hydrophiles / hydrophobes des colorants 11, 13. substitution nucléophile des groupes amine dans la nanoparticule avec l'atome de chlorure d'un colorant anthraquinonetriazine est utilisé pour créer poly contenant un colorant (NIPAM -CO-allylamine) (AA) des nanoparticules 11, 12. Procédé de polymérisation en deux étapes est utilisée pour créer des nanoparticules d'hydrogel contenant une coque extérieure de l'acide vinylsulfonique (VSA) 11, 13.
Des nanoparticules d'hydrogel peuvent être appliqués à divers fluides biologiques, notamment le sang total, le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, de la sueur et l'urine. En une seule étape, en solution, le nanoparticles effectuer un rapide (quelques minutes), la séquestration et la concentration de bas poids moléculaire analytes 10, 11, 13, 15-18. Les protéines sont ensuite éluées à partir de nanoparticules et détectés en utilisant un transfert de Western 19 à 21, la spectrométrie de 10, 11, 13, 15, 18, 22 masse, 23, des analyses immunologiques / ELISA 10, 11, 15, 18, ou protéine en phase inverse 16 microréseaux, 24 dosages. Les nanoparticules fonctionnalisées avec des appâts chimique, et présentant un noyau ou noyau architecture de coquille, la capture et concentrer les protéines en fonction des propriétés physico-chimiques de l'appât / enveloppe. Différents colorants incorporés dans les nanoparticules seront donc capturer différents sous-ensembles de protéines avec efficacité sur la base de l'affinité tinctoriale, le pH de la solution, et la présence / absence de protéines hautement abondante 13 concurrentes variable. En outre, la quantité de nanoparticules par rapport au volume de la solution aura une incidence sur le rendement de la protéine à partir des nanoparticules. Ces aspects de l'Nanoparticule hydrogel récolte sont illustrés à l'aide de nanoparticules trois appâts pour des protéines différentes de récolte à partir d'échantillons de plasma qui contiennent des quantités élevées de protéines, et à partir d'échantillons d'urine, qui ne contiennent généralement pas de grandes quantités de protéine. Dans ce protocole, nous démontrons la récolte et la concentration de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) à partir des échantillons de plasma en utilisant le poly (NIPAM-co-AAC), le poly (NIPAM / colorant), et des nanoparticules d'enveloppe core-(poly (NIPAM-co-VSA)) . Le poly (NIPAM / colorant) des nanoparticules sont présentés à concentrer l'antigène de Mycobacterium espèce qui a été ajouté à des échantillons d'urine humaine, pour imiter Mycobacterium tuberculosis individus infectés.
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Protocol
Le plasma humain et l'urine a été prélevé sur des donneurs volontaires sains, avec le consentement éclairé écrit, à la suite Institutional Review Board de l'Université George Mason protocoles approuvé. Les bailleurs de fonds ont été répartis de manière égale entre les hommes et les femmes de race blanche âgés de 25 et 42 échantillons ont été analysés individuellement et n'ont pas été regroupées.
1. nanoparticules traitement de sérum ou de plasma échantillons
Faible abondance de marqueurs biologiques potentiels dans le plasma sont capturés, en solution, avec des nanoparticules d'hydrogel. Les particules sont ajoutées au plasma, incubé, séparé par centrifugation, lavées, et les protéines capturées sont éluées. Les protéines éluées sont séchés sous un courant d'azote pour le séquençage par spectrométrie de masse et en aval identification.
- Diluer 500 ul de sérum de 1: 2 avec du Tris-HCl 50 mM pH 7 (500 ul de sérum de 500 ul de Tris-HCl +) dans un microtube de centrifugation.
- Ajouter 500 ul de poly (NiPAM / AAC) noyau nanoparticles. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
- Ajouter 500 ul de thiocyanate de sodium (25 mM) à la pastille. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois.
- Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
- Ajouter 500 ul d'eau MilliQ à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois.
- Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
- Préparer le tampon d'élution frais: ajouter 700 ul d'acétonitrile à 300 ul d'hydroxyde d'ammonium dans un tube propre. Attention: l'hydroxyde d'ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d'élution doit être préparationared immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d'élution.
- Ajouter 300 ul de tampon d'élution à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et mettre de l'éluat dans un tube à centrifuger propre, étiqueté.
- Répétez les étapes 1.9 à 1.10. Combinez les deux éluats dans un tube à centrifuger.
- Sécher les éluats sous flux d'azote dans un collecteur d'évaporateur d'azote à 42,1 ° C, avec un débit d'air fixé à 8 (Figure 2F).
- Stocker l'éluat séché à température ambiante pendant O / N stockage, ou à -20 ° C pour le stockage à long terme, avant la spectrométrie de masse, western blot ou dosages ELISA (en option).
2 Traitement des nanoparticules des échantillons d'urine
L'urine normale contient moins de 30 mg / dl de protéine etmoins de 1 + sang. Cependant, de nombreuses maladies / conditions peuvent modifier les niveaux normaux de protéines dans l'urine et le sang. Pour aider à déterminer le volume optimal de nanoparticules à ajouter à l'échantillon d'urine, une analyse d'urine est réalisée avant la récolte nanoparticule. biomarqueurs d'urine peuvent exister dans des concentrations extrêmement faibles, ce qui peut nécessiter l'optimisation du ratio de nanoparticules au volume d'urine. Cette procédure décrit nanoparticule récolte des échantillons d'urine pour analyse western blot en aval.
- Prélever des échantillons d'urine dans un endroit propre, sec gobelet en plastique. A 22 ml de volume minimum est nécessaire. urine de conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse.
- Décongeler l'urine congelés à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Mélanger brièvement sur un vortex. Verser au moins 22 ml d'urine dans un fond conique tube en polypropylene de 50 ml.
- Produit dérivé de l'urine dans une centrifugeuse à rotor pivotant à 3700 xg pendant 15 min. Décanter l'urine, sans perturber le culot, dans un polypr fond conique de 50 ml propreTube opylene. Éliminer le culot.
- Effectuer l'analyse d'urine en utilisant un multi-analyte "urine jauge" bandelette réactive. Remarque: stocker les bandelettes réactives dans un récipient hermétiquement fermé à l'abri des rayons du soleil et de l'humidité 17, 18 direct.
- Posez la bande de réactif, face vers le haut, sur une serviette en papier sec.
- Utiliser une pipette jetable de 1 ml d'aspirer l'urine préparé à l'étape 2.3.
- Réglez une minuterie pendant 2 min, mais ne commencez pas. Passer rapidement 1 - 2 gouttes d'urine sur chaque plot de test de la bandelette réactive. Commencer immédiatement la minuterie. Note: Ne pas plonger la bandelette réactive directement dans le récipient d'urine. Les indicateurs de colorant / chimiques de la bandelette réactive peuvent potentiellement s'écouler de la bandelette réactive dans le réservoir d'urine.
- À l'heure indiquée sur le contenant de bandelettes réactives, enregistrer les résultats qualitatifs pour les différents analytes sur la bandelette réactive en comparant la couleur des bandelettes réactives individuelles à l'indica code couleur correspondantteurs sur le conteneur de réactif. Les résultats d'urine normales typiques sont: (normal ou négatif) pour le sang, les protéines, les leucocytes, nitrite, glucose, cétone, la bilirubine, et urobilinogen; PH de l'urine (5,5 à 7,0); densité (1,001 à 1,020). Remarque: Les niveaux élevés de protéines dans un échantillon d'urine peuvent rivaliser avec la protéine d'intérêt pour les sites sur les nanoparticules de liaison. Afin de maximiser la récolte des protéines avec des nanoparticules, l'/ volume volume d'urine nanoparticule peut être ajustée soit à concurrence de fin de course à partir de protéines de grande abondance, ou peut être optimisé pour la récolte des protéines qui existent dans de très faibles concentrations. Si la valeur de la protéine de l'urine est 1 + ou plus, ajouter des volumes 2x de nanoparticules dans l'étape 2.5 ci-dessous. Si l'analyte d'intérêt est une protéine très abondante faible, il peut être nécessaire d'augmenter le volume de nanoparticules jusqu'à 2 ml (figure 3).
- Transférer 20 ml de l'urine clarifiée provenant de l'étape 2.3 dans 50 ml d'un fond conique propre tube en polypropylène. Needs a contextperturber les débris / granulés qui peuvent être dans le fond du tube d'urine. Ajouter 200 ul de nanoparticules à la 20 ml d'échantillon d'urine. Mélanger brièvement sur un vortex. Remarque: si la valeur de la protéine de l'urine est 1 + ou plus, ajouter 400 pl de nanoparticules de 20 ml d'urine.
- Incuber le mélange urine / nanoparticule pendant 30 min à température ambiante, sans balancement / mélange.
- Faites tourner la suspension urine / nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d'un rotor swing-out à 3700 g pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n'est pas visible de centrifugation suivant, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min.
- Retirer et jeter le surnageant. Ajouter l'eau de 500 pi au culot de nanoparticules.
- Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Transférer la solution de nanoparticules à un 1,5 ml microtube propre.
- Tourner les nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à angle fixe à 16 100 xg pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n'est pas fol visibleLowing centrifugation, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min.
- Retirer et jeter le surnageant.
- Répétez les étapes 2,8 et 2,11 (deux fois) avec 200 ul 18 MilliQ eau pour se laver les nanoparticules.
- Préparer tampon d'élution frais: Ajouter 970 ul d'acétonitrile à 30 l'hydroxyde d'ammonium ul dans un tube propre. Attention: l'hydroxyde d'ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d'élution doit être préparée immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d'élution.
- Ajouter du tampon d'élution de 20 ul de la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Faites tourner les échantillons de nanoparticules à 16 100 g pendant 10 min. Retirer et conserver le surnageant dans un, 1,5 ml microtube propre. Ne pas perturber le culot de nanoparticules. Jeter le culot dans la poubelle de risque biologique.
- Placer les échantillons dans un rack dans une hotte chimique. Ouvrir les bouchons et augmenterUbate à température ambiante pendant 30 min. Sinon, placez les échantillons sous flux d'azote à 40 ° C jusqu'à ce que sec (1 - 2 heures).
- Ajouter 15 ul de Tris-glycine SDS tampon d'échantillon (2x) pour les échantillons. Chauffer à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 5 minutes avec les couvercles ouverts ou jusqu'à ce que le volume laissé dans le tube n'est pas supérieure à 20 pl. Remarque: ne pas utiliser un bain d'eau bouillante. L'humidité du bain d'eau permet d'éviter l'évaporation du tampon.
- Placez le capuchon sur les tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage. L'échantillon peut être conservé à -80 ° C ou utilisé immédiatement pour l'analyse western blot en aval.
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Representative Results
Hydrogel nanoparticules Taille et uniformité
Particules de poly (NiPAM-AAC) ont été produits à très haut rendement et la reproductibilité entre et au sein des lots. Les particules ont une très bonne stabilité colloïdale à température ambiante pendant le temps nécessaire à la capture, le stockage, et l'élution des protéines (au moins 48 heures), et la précipitation de nanoparticules n'a pas été observée (figure 1) 11. La stabilité colloïdale peut être très important pour l'absorption rapide de protéine / peptide par les nanoparticules.
Biomarqueurs faible abondance potentiels récoltées à partir de plasma
L'incorporation de l'amorce de colorant entraîne l'absorption de molécules en solution et assure que les molécules capturées sont préservés de dégradation 13, 15, 18, 25. Pour cette raison, les inhibiteurs de protéase sont pas nécessaires au cours de l'échantillon de pré-traitement. Cet attribut des nanoparticules rend suitable en tant que technologie de conservation pour la collecte de l'échantillon dans le domaine et à l'expédition de fluides biologiques à la température ambiante.
La molécule d'appât peut être incorporé dans les particules d'hydrogel par copolymérisation ou liaison covalente à des groupes fonctionnels présents dans la nanoparticule. A titre d'exemple, le poly (NIPAM-co-AAC) des nanoparticules ont été construits avec des acides contenant des colorants au moyen des réactions de reticulation de longueur zéro d'amidation, tandis que les nanoparticules avec une enveloppe extérieure contenant de l'acide (VSA) un copolymère vinyl sulfonique ont été créés par une seconde réaction de polymérisation de 10 à 13. Différents types de nanoparticules peuvent être produites en incorporant un colorant chimique différente à l'intérieur de la nanoparticule et ainsi d'améliorer la récolte des classes spécifiques de protéines. Un concept important de notre technologie est que les différents appâts peuvent montrer une affinité préférentielle pour des protéines différentes en raison de l'interaction protéine-colorant dépend principalement d'une combinaison d'interactions hydrophobes, la 3-D interactions, et les forces électrostatiques. Nous avons observé que certains analytes peuvent être capturés avec une haute affinité par chimiquement différents colorants en raison de la complexité des forces de liaison. Voir Tamburro et al. Pour une explication détaillée et des exemples de ce principe 13. Par exemple, les quatre types de capture appât (nanoparticules) différents ont été utilisés pour récolter le TNFa à partir de plasma en utilisant 200 ul de particules de 200 ul de plasma et pour chaque type de nanoparticules. Dans tous les cas, après le traitement avec les nanoparticules, TNFa n'était pas détectable dans le surnageant par SDS-PAGE avec coloration à l'argent, tandis que le TNFa était détectable dans la nanoparticule éluat (Figure 1C). (Piste 1 = TNF recombinant (MW 17.000 Da), lignes 2 et 3, 4 et 5, 6 et 7 et 8 et 9 représentent les résultats pour quatre types d'appâts de nanoparticules différentes, respectivement; C = contrôle, S = surnageant, P = nanoparticules éluat).
Dose-réponse pour Diffielouer Types de N anoparticles
Afin de réaliser une courbe d'étalonnage, et ainsi évaluer le rendement et la précision, les expériences doivent être effectuées avec des protéines enrichis dans de concentration connue. Les résultats publiés pour une variété de fluides corporels et les analytes montrent comment la nanoparticule de prétraitement maintient la linéarité du dosage et établit une courbe d'étalonnage, tout en améliorant la limite effective de détection 10, 16, 26. Nous avons également publié des études d'inter-laboratoires précision en utilisant des nanoparticules d'effectuer la réaction de suivi multi-spectrométrie de masse avec une sensibilité accrue 27.
Pour comparer l'IL-17 l'efficacité de la récolte par les différents types de nanoparticules, on a ajouté l'IL-17 (17,5 kDa) pour des échantillons de plasma pour laquelle soit le poly (NIPAM-co-AAC) ou le poly (NIPAM-co-VSA) des nanoparticules ont été ensuite ajoutées . Deux jeux de quatre dilutions en série de 100 ng de IL-17 recombinante ont été préparés dans 10081; plasma l (100 ng / 100 ul, 50 ng / 100 ul, 25 ng / pl et 100 ng 12,5 / 100 pi). des particules de poly (NIPAM-co-AAC) ou le poly (NIPAM-co-VSA) ont été ajoutés à des échantillons de plasma respectifs dans un rapport 1: (v / v) une particule: rapport de plasma. Une analyse des protéines totales spectrophotométrique a été effectuée sur les échantillons de surnageant. Western blot avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-IL-17 a été réalisé sur 20 pg de surnageant de plasma (S) après la récolte nanoparticule et les éluats de nanoparticules (P) (figure 4). Les deux types de nanoparticules récoltées de manière adéquate et concentrées IL-17 à chaque dilution. Les bandes supplémentaires sur le transfert de western représentent l'albumine sérique humaine et de l'immunoglobuline qui réagissent avec l'anticorps secondaire. (particules de AAC: Les pistes 1 et 2 = 1 ng / ul IL-17, lignes 3 et 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17; particules VSA: Les pistes 1 et 2 = 1 ng / ul IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / ul,Voies 5 et 6 = 0,25 ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul).
La détection de protéines potentiellement diagnostiques dans l'urine
Échantillons d'urine humaine, obtenus à partir de donneurs volontaires en bonne santé, avec le consentement éclairé écrit, ont été mélangés avec une espèce de Mycobacterium recombinantes d'antigènes de la protéine sécrétoire précoce cible Mycobacterium Tuberculosis (ESAT-6) pour imiter Mycobacterium tuberculosis personnes infectées. 1 pg de chacun de ESAT-6 (15 kDa) et de l'IL-2 (15,5 kDa) ont été ajoutés à 1 ml d'urine humaine aliquotes recueillies à partir de donneurs volontaires en bonne santé. L'analyse d'urine a été effectuée sur les échantillons d'une bande de réactif d'urine pour déterminer le rapport optimal des nanoparticules à l'urine, qui était basé sur la présence / absence des protéines urinaires. Poly (NiPAM / colorant) nanoparticules ont été utilisés pour récolter des protéines à partir d'échantillons d'urine traités et non traités. Une dimension électrophorèse sur gel des éluats de nanoparticules a été réalisée followed par coloration à l'argent. Les échantillons de U4 et U6 voies représentent éluats de nanoparticules de ESAT-6 et IL-2 échantillons d'urine traités, montrant clairement de grandes bandes à 15 kDa (figure 5). La spectrométrie de masse des éluats identifiés ESAT-6 (UniProt adhésion POA567, 84,0 couverture, 9 peptides) et de l'IL-2 (UniProt adhésion P60568, 38,56 couverture, 3 peptides). Urine sans nanoparticules récolte est présentée dans le couloir marqué "Raw".
Figure 1: Les nanoparticules récolte et de se concentrer protéines de faible abondance des fluides biologiques complexes. (A) de workflow pour les protéines de la récolte. La durée totale du traitement est d'environ 1,5 heure. Les protéines sont concentrées dans une solution de sang, le sérum, le plasma, l'urine, la sueur, la salive, ou d'autres liquides biologiques (concentration 1000 fois représenté) (B).Lot à la comparaison des lots montrant la taille uniforme de nanoparticules. Microscopie à force atomique de mica montre uniformité de la taille (0,7 um de diamètre) et l'absence de l'agglomération en deux lots de nanoparticules. Électrophorèse sur gel (C) 1-D, avec la suite coloration à l'argent, du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF) séquestré à partir du plasma. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 nanoparticules procédure de récolte de plasma / sérum pour aval analyse par spectrométrie de masse. (A) nanoparticules restent en suspension dans une solution (Poly (NiPAM / colorant) représenté). (B) Les nanoparticules sont ajoutés à l'échantillon de plasma dilué. (C) L' nanoparticules plasma suspension is centrifugé dans une centrifugeuse pour séparer les nanoparticules à partir du surnageant. (D) post centrifugation, les nanoparticules forment un culot distinct dans la partie inférieure du tube. (E) Après lavage des nanoparticules, l'éluat contenant les protéines est éliminée et récoltées enregistré . pour l'analyse en aval (F) L'éluat est séché sous flux d'azote dans un évaporateur à 42,1 ° C, le débit d'air 8, 1 -. 2 h avant la spectrométrie de masse S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Analyse d'urine à l'aide d'analytes multiples bandelettes réactives pour le contrôle de la qualité de l'échantillon. (A) chaque plaquette sur la bandelette réactive est imprégnée avec les produits chimiques colorants, des enzymes, et / ou indicateurs qui réagissent avec une différerent urine à analyser (par exemple,., glucose, bilirubine, cétone, le poids spécifique, le sang, le pH, les protéines, l'urobilinogène, les nitrites et / ou estérase leucocytaire). L'urine est clarifié par centrifugation. Une goutte d'urine est ajouté à chaque pad sur la bandelette réactive. (B) La couleur de chaque pad est comparée visuellement les blocs de couleur sur le récipient, à l'heure indiquée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. La récolte de l'IL-17 à partir de plasma en utilisant noyau (AAC) ou core-shell (VSA) nanoparticules. Gel 1-D électrophorèse et Western blot avec des anticorps anti-IL-17 démontre la capacité de l'acide acrylique (AAC) et VSA nanoparticules shell de base de récolter diverses concentrations d'IL-17 à partir de plasma. (S = surnageant après la récolte nanoparticules, des particules P = nanoparticules éluat AAC:. Lanes 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17; particules VSA: Les pistes 1 et 2 = 1 ng / ul IL-17, lignes 3 et 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / pl, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / pl) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Récupération de l'antigène de Mycobacterium tuberculosis et la cytokine IL-2 à partir d'urine en utilisant des nanoparticules d'hydrogel. Coloration à l'argent suivant 1-D gel électrophorèse des échantillons d'urine. Les échantillons dans les voies U4 et U6 représente éluats provenant des échantillons d'urine contenant recombinant ESAT-6 et d'IL-2, montrant clairement de grandes bandes à 15 kDa. La spectrométrie de masse des éluats identifiés ESAT-6 (UniProt adhésion POA567, 84,0 couverture, 9 peptides) et de l'IL-2 (UniProt adhésion P60568, 38,56 couverture, 3 peptides). (RAW = urine sans nanoparticules récolte; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urine manque recombinant ESAT-6 et IL-2 récolte de nanoparticules suivant). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| nom de protéine | GI nombre de protéines | Concentration dans le sérum / plasma [ng / ml] | Référence |
| abl-interacteur 1 isoforme une | 61743942 | Inconnu | |
| AMP-activated protein kinase sous-unité gamma2 une isoforme | 33186925 | Inconnu | |
| Cas-Br-M (murine) écotrope rétroviral transformation séquence | 52426745 | Inconnu | |
| chimiokine (CC motif) ligand 18 (pulmonaire et l'activation réglementé) | 4506831 | 30 | 34 |
| chimiokine (CC motif) ligand 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Inconnu | |
| chromosome cadre de lecture ouvert 16 80 | 8392875 | Inconnu | |
| Consortin | 213021160 | Inconnu | |
| défensines, alpha 4, corticostatine | 4503303 | Inconnu | |
| 20149675 | Inconnu | ||
| glycoprotéine Ib (plaquettes), polypeptide bêta | 4504073 | Inconnu | |
| guanine nucleotide protéine de liaison (protéine G), polypeptide q | 40254462 | Inconnu | |
| Héparanases | 148746204 | Inconnu | |
| insuline-like growth factor 2 (somatomédine A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritine | 15187164 | Inconnu | |
| leucocyte-cellule dérivée chimiotaxine 2 | 59806345 | 200000 | 33 |
| lipocaline 2 (oncogene 24p3) | 38455402 | 0,05 | 28 |
| Monoglyceride lipase, CRA_b isoforme | 6005786 | Inconnu | |
| N-éthylmaléimide sensible protéine de fixation de facteur, alphun | 47933379 | Inconnu | |
| un homéobox de coupe 2 | 119220564 | Inconnu | |
| fibre externe dense de queues de spermatozoïdes 4 | 171184433 | Inconnu | |
| bouche, les poumons et l'épithélium nasal associé | 18765705 | Inconnu | |
| peptidoglycane protéine de reconnaissance 2 | 156616294 | Inconnu | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protéines CASC3 | 15721939 | Inconnu | |
| Rab27b, RAS membres oncogène famille | 5729997 | Inconnu | |
| Association Ras (RalGDS / AF-6) domaine familial 6 isoforme une | 29789443 | Inconnu | |
| liées à ras GTP-binding protein Rab10 | 33695095 Inconnu | ||
| anneau protéine à doigt 166 | 30520320 | Inconnu | |
| réponse de la privation de sérum (phosphatidylsérine protéine de liaison) | 4759082 | Inconnu | |
| soluté famille de support 33 (acétyl-CoA transporteur), 1 membre | 4757708 | Inconnu | |
| ST6 bêta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1 isoforme une | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosin-like 3 | 34013530 | Inconnu | |
| transducine comme activateur de division 3 (E (sp135) homologue, chez la drosophile) | 157384982 | Inconnu | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | Inconnu | |
| WD domaine de répétition 1 | 9257257 | Inconnu | |
| WD domaine de répétition 91 | 222080092 | px; "> Inconnu||
| répétition contenant 2 xin liant l'actine | 119372317 | Inconnu |
Tableau 1: Exemple des protéines de faible abondance récoltés par des nanoparticules de sérum / plasma. (PeptideAtlas peptidome spectrométrie de masse) 28-34 Adapté avec la référence de permissionfrom 13 (Tamburro, D. et al multi-fonctionnels nanoparticules core-shell:... Découverte de biomarqueurs jusqu'alors invisibles J Am Chem Soc, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright © 2011 American Chemical Society.
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Discussion
Pertinence clinique
Un échantillon de sérum ou de plasma est censé contenir faible abondance des protéines et des peptides qui peuvent fournir une riche source d'information sur l'état de l'organisme dans son ensemble en circulation. Malgré la promesse de la protéomique sérique, il ya trois barrières physiologiques fondamentales et graves déjouant la découverte de biomarqueurs et de la traduction de bénéfice clinique 10, 11, 16, 25.
1. biomarqueurs diagnostiques importants peuvent exister en très faible abondance (concentration) dans le sang. Au début des tissus malades de stade, comme les lésions cancéreuses pré-métastatiques, peut constituer moins de quelques mm 3. Les biomarqueurs hangar dans la circulation à partir d'un tel petit volume de tissu deviendront très dilué dans le volume de sang entier. Analytes concernés peuvent exister au-dessous des limites de détection de la spectrométrie de masse et des dosages immunologiques classiques.
2.-Bas biomarqueurs d'abondance /les protéines sont masqués par la présence de protéines abondantes élevées telles que l'albumine et les immunoglobulines, qui représentent jusqu'à 90% du protéome de plasma 14.
3. protéines et les peptides sont sensibles à la dégradation par protéases endogènes et exogènes qui suit la ponction veineuse et l'échantillon transport / stockage. La dégradation des protéines peut conduire à des résultats positifs ou faussement négatifs faux 35.
Nanoparticules d'hydrogel ont été développés comme poreuses, porteurs, des polymères contenant des colorants anthraquinonetriazine et / ou des coquilles d'acide vinylsulfoniques pour des protéines et peptides récolte et la conservation dans les fluides corporels 11, 13. Notre groupe synthétisés et testés nanoparticules d'hydrogel fonctionnalisés avec une pléthore de colorants organiques (c'est à dire. , sulfonés et colorants non-sulfonatedanthraquinonetriazine) et ont montré les affinités préférentiels pour plusieurs protéines analytes 11, 13. Nous avons également établi des protocoles pour la découverte de biomarqueurs qui utilisentdes nanoparticules d'hydrogel avec la lymphe, la salive, le liquide céphalorachidien, la sueur, l'urine, le plasma, le sang, le sérum ou des spécimens 11, 13, 23, 24, 26.
Optimiser les paramètres nanoparticules de récolte avant aux protéines de la récolte de spécimens clinique / recherche précieux est nécessaire pour des résultats optimaux. La quantité de protéine dans les échantillons doivent être quantifiés afin de déterminer le rapport optimal de nanoparticules de volume de l'échantillon. Pour les analytes de concentration inconnue, une courbe dose-réponse en utilisant des protéines recombinantes comportent des informations relatives aux limites de détection. S'il n'y échantillon suffisant, les différents types de nanoparticules peuvent être utilisées pour déterminer la nanoparticule idéal pour l'analyte et l'échantillon.
L'analyse d'urine avant de nanoparticules récolte fournit un échantillon d'urine test de contrôle de la qualité. L'affinité de l'amorce de nanoparticules de colorant dépend du point de la protéine d'intérêt et le pH du milieu environnant isoélectrique. Le pH urinaire êtreentre 5,5 et 7,0 est optimal pour la protéine récolte avec les poly (NiPAM / colorant) nanoparticules. La présence de globules rouges hémolysés ou intacts (1 + du sang sur la bandelette réactive) n'interfère pas avec nanoparticules récolte.
Dans ce protocole, nous nous sommes concentrés sur l'application des nanoparticules d'hydrogel de récolter des protéines du plasma et l'urine. Les applications futures pourraient comprendre d'autres fluides corporels tels que le corps vitré de l'oeil, ou le liquide synovial. Potentiel dans les applications in vivo peut être envisagé pour l'avenir dans lequel les nanoparticules sont injectés dans les tissus malades de recueillir des biomolécules. Les travaux à venir sera également axée sur le développement de nouveaux dispositifs pour la capture et la conservation des biomarqueurs, comme un patch de la peau à base de nanoparticules pour l'analyse du protéome de transsudat de la peau.
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Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, veuillez contribué à la collecte de données et l'analyse de la figure 5. Ce travail a été soutenu en partie par (1) l'Université George Mason, (2) l'Italien IstitutoSuperiore di Sanita 'dans le cadre de l'Italie / Etats-Unis accord de coopération entre le ministère américain de la Santé et des Services sociaux, de l'Université George Mason, et le ministère italien de la Santé publique, (3) des NIH, les subventions du programme de IMAT 1R21CA137706-01 et 1R33CA173359-01 à LAL, et (4) Ceres Nanosciences, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
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