Introduction
현재 부교감 악안면 (CMF) 골 결손 치료의 황금 표준으로 간주, 수확자가 이식의 이식은 복잡한 이식 절차, 공여부의 이환율과 제한된 가용성 (1)에 의해 방해된다. 특별한 어려움은 성형 및 골 유착을 얻고 그래프트 재 흡수를 방지하기 위해, 결함에 단단히 강성 자가골 고정된다. 조직 공학은 autografting하는 대안 전략 및 합성 골 대체물 (예를 들면 뼈 시멘트) 2,3로 조사되었다. 조직 공학 방법의 성공에 중요한 속성의 특정 세트 발판이다. 우선 골융합을 달성하기 위해, 지지체는 인접한 뼈 조직 (4)에 밀착 형성한다. 발판은 세포 이동, 영양 확산과 neotissue 증착 4,5 허용, osteoconductive해야한다. 이 동작은 일반적으로 생분해 SCA 달성된다ffolds는 고도로 상호 연결된 기공 형태를 나타내는. 뼈 조직 (5) 주변과의 통합 및 결합을 촉진하기 위해 마지막으로, 지지체는 생체 활성해야합니다.
여기, 우리는 이러한 특성을 가진 조직 공학 발판을 준비하는 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 지지체는 형상 기억 행동 6 불규칙한 CMF 결함에 "자기 끼움"할 수있는 능력을 나타낸다. Thermoresponsive 형상 기억 폴리머 장치 (SMPS)는 7,8 열에 노출시에 형상 변화를 겪는 것으로 알려져있다. SMP의 영구 형상 및 임시 형태를 유지하고, 영구 형상 복구 "스위칭 세그먼트"결정 "netpoints"(즉, 화학적 또는 물리적 가교)로 구성된다. 스위칭 세그먼트 중 유리 전이 (T의 g)에 대응하는 열 전이 온도 (T 트란스)를 나타낼 또는 중합체의 천이 (T의 m)을 용융. 으로결과는 SMP의 순차적 T <T 트랜스에서 임시 형태로 고정 T> T 트랜스에서 임시 모양으로 변형하고, T> T 트랜스의 영구적 인 형태로 회수 할 수있다. (6)을 다음과 같이 따라서, SMP의 발판은 CMF 결함에서 "셀프 피팅"달성 할 수있다. 노출 후 식염수 (T> T 트랜스), SMP의 발판이 모양 복구 결함 경계에 발판의 확장을 촉진하여, 손으로 누르면 불규칙한 결함에로 일반적으로 제조 된 원통형의 발판을 허용, 가단 될 것 따뜻하게. (T <T 트랜스)를 냉각시, 비계 모양의 정착이 결함 내 새 임시 형태를 유지하면서, 상대적으로 더 단단한 상태로 반환합니다. 이 프로토콜에서, SMP의 발판은 생분해 성 고분자는 조직 재생 및 기타 생물 의학 응용 프로그램에 9-11에 대한 광범위하게 연구, 폴리 카프로 락톤 (PCL)에서 제조된다. 형상 기억하십시오, 일PCL의 전자의 m T는 T 트랜스 역할 및 PCL (12)의 분자량에 따라, 43과 60 사이에서 변화 ºC. 이 프로토콜에서, 지지체의 T 트랜스 (즉 T의 m)은 56.6 ± 0.3 ºC 6입니다.
osteoconductivity을 달성하기 위해, 프로토콜은 용매 캐스팅 미립자 침출 (SCPL) 6,13,14 방법에 기초하여 고도로 상호 연결된 기공 PCL 기반 SMP 골격을 위해 개발되었다. 디 아크릴 레이트, 폴리 카프로 락톤 (PCL-DA) (M = N ~ 10,000g / mol)을 신속하게, 광 화학적 가교 결합을 허용하기 위해 이용하고, 염 템플리트 위에 용매 캐스팅을 허용하는 디클로로 메탄 (DCM)에 용해시켰다. 광화학 요법 및 용매 증발에 이어, 염 템플릿을 물에 침출하여 제거 하였다. 염 평균 크기는 골격의 기공 크기를 조절한다. 중요한 것은, 염 템플릿 전에 기공 interconnectivi을 달성 캐스팅 용매 물과 융합시켰다타이.
생체 활성은 기공 벽 (6)에 polydopamine 코팅의 현장 형성에 의한 SMP 지지체에 부여했다. 생체 활성은 종종 유리 또는 유리 - 세라믹 충전제 (15)의 포함으로 골격에 도입된다. 그러나, 이들 원치 않는 취성 기계적 특성을 야기 할 수있다. 도파민은 기판의 다양한 16-19에 부착, polydopamine 얇은 층을 형성하는 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서, SMP 지지체 모든 기공 벽 표면에 6 polydopamine nanothick의 피막을 형성하는 도파민 약간 염기성 용액 (PH = 8.5)를 실시 하였다. 개선 된 세포 접착을위한 표면의 친수성을 향상시키고 확산 외에 polydopamine는 모의 체액 (SBF) 18,20,21 노출시 하이드 록시 아파타이트의 형성 (HAP)의 관점에서 생물 것으로 밝혀졌다. 마지막 단계에서, 코팅 된 지지체를 85 ºC (T> T 트랜스) WH 열처리를 노출무형 문화 유산은 치밀화를 폴딩 할 이어집니다. 열처리는 이전 PCL 결정질 도메인 가까이 근접 14 재구성 아마도 인해, 골격 형상 기억 행동 필수적인 것으로 관찰되었다.
우리는 또한, 불규칙한 모델 결함 내에서 자체 맞는 행동을 특징 짓는 용어로 변형 제어 순환 열 기계 압축 테스트 메모리 동작을 형성 (즉, 형상 회복과 정착을 형성)하는 방법을 설명하는 형태 기공, 체외 생체 활성에. 발판의 특성을 조정하는 전략도 제공됩니다.
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Protocol
1. 합성 PCL-DA 로머
- 아크릴화 반응을 실행합니다.
- 테프론 피복 자기 교반 바가 장착 된 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 PCL 디올 (M에서 N = ~ 10,000g / 몰) 20g을 단다.
- DCM에서 PCL 디올을 녹인다.
- 플라스크에 120 mLlof DCM 추가 (농도 = 0.17 ㎍ / ㎖).
- 또한 DCM의 증발을 방지하면서 압력 빌드 업을 피하기 위해, 플라스크의 목에 느슨하게 고무 격막을 배치.
- ~ 250 rpm에서 30 분 ~ 동안 교반 솔루션은 완전히 폴리머를 용해한다.
- 용액에 4- 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP)의 ~ 6.6 ㎎을 추가하고, 교반하면서 용해.
- 플라스크의 목에 단단히 고무 격막을 놓습니다. 이 솔루션은 교반을 계속하도록 허용합니다.
- 고무 격막을 통해 조심스럽게 긍정적 인 N 2 압력 바늘 입구와 오픈 바늘을 사용하여 2 ~ 3 분 동안 N 2 플라스크를 제거출구로.
- N 2 입구와 출구를 분리합니다.
- 고무 셉텀을 통해 삽입 된 바늘이 장착 된 유리 주사기를 통해 트라이 에틸 아민 0.56 ㎖ (4.0 밀리몰) (N 잇 3) 적가.
- 고무 셉텀을 통해 삽입 된 바늘이 장착 된 유리 주사기를 통해 적가 아크릴로 일 클로라이드 0.65 ㎖ (8.0 밀리몰)을 추가한다.
- 플라스크에 N 2 입구를 돌아 내용이 ~에 대해 긍정적 인 N 2 압력을 받고 30 분을 자극 할 수 있습니다.
- 55 ºC로 오일 욕을 예열.
- 할당 ~ 30 분 후, N 2 입구를 제거하고 응축기 격벽을 대체.
- 예열 오일 배스에 플라스크를 담근다.
- 플라스크의 내용물을 20 시간 동안 교반한다.
- 할당 된 20 시간 후, 오일 조로부터 플라스크를 제거하고 내용물을 실온으로 냉각 할 수있다.
- 회전 증발기를 사용하여, 플라스크에 DCM에서 용매를 제거한다.
- 피원유 PCL-DA 제품을 urify.
- 플라스크에, 아세트산 에틸 ~ 135 mL를 추가하고, 조 PCL-DA를 녹인다.
- 중력은 깨끗한 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 여과지 용액을 필터. (참고 : 솔루션을 쉽게 통과하지, 필터 종이에 두껍게 할 수 있으므로,주의 깊게 가열 총으로 가벼운 열을 적용하면..)
- 회전 증발기를 사용하여, 용매를 플라스크로부터 에틸 아세테이트를 제거한다.
- 플라스크에, DCM ~ 140 mL로 추가 조질 PCL-DA를 녹인다.
- 500 mL의 분액 깔때기에 내용을 전송합니다.
- 깔때기에, 2 M 탄산 칼륨 (K 2 CO 3)의 13.5를 가하여.
- 깔때기를 모자. 조심스럽게 마개를 통해 압력을 해제 돌보는, 깔때기를 반전 부드럽게 한 번 또는 두 번 소용돌이에 의해 두 개의 층을 섞는다. 3 번 반복합니다.
- 파라 필름의 층으로 뚜껑을 교체하고, 혼합물 O / N (~ 12 시간)을 분리 할 수 있습니다.
- 저부를 수집하거나250 mL의 삼각 플라스크에 ganic 층.
- 플라스크에 무수 황산 마그네슘 5g ~ (황산)를 첨가하고, 가볍게 소용돌이.
- 중력은 둥근 바닥 플라스크 정성 여과지 및 깨끗한 250 ㎖ 중에 혼합물을 필터.
- 회전 증발기를 사용하여, 플라스크에 DCM에서 용매를 제거한다.
- 높은 진공 하에서 건조 잔류 DCM을 제거합니다. (참고 : PCL-DA는 빛으로부터 멀리 보관해야합니다.)
- 1 H NMR (22, 23)와 아크릴화를 확인합니다.
SMP 비계를 준비 (2) (그림 1)
- 용융 소금 템플릿을 준비합니다.
- 직경이 70 ~ 460 μm의 ± 염화나트륨 입자를 얻기 위해 425 ㎛의 체를 사용한다. (주 : 평균 입경은 ImageJ에 소프트웨어를 주사 전자 현미경 [SEM] 이미지에서 확인 될 수있다.) 14
- 3 ㎖의 유리 바이알 (ID = 12.9 mm)에, 이전에 체질 염화나트륨 1.8 g을 추가한다.
- 천천히 유리 병에 네 부분, 7.5 중량 % (소금의 중량을 기준으로) 탈 이온수 (0.146 g)에 추가 할 수 있습니다. 물의 각 부의 첨가 후 금속 주걱으로 혼합한다.
- , 유리 병 캡 조직 포장 및 원심 분리 관에 수직으로 배치합니다. 3,220 X g에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 뚜껑을 제거하고 자연 건조 O / N (~ 12 시간)을 할 수 있습니다.
- 새로운 유리 바이알에서, DCM 1 ㎖ 당 PCL-DA 0.15 g을 조합함으로써 "로머 용액"을 준비한다. (주 :. 한 지지체를 들어, ~ 용액 1 ㎖를 제조한다)과 캡은 ~ 1 분 동안 와동 믹서 고속으로 용액을 혼합한다.
- 새로운 3 mL 유리 바이알에, 10 중량 %, 2,2- 디메 톡시 -2- 페닐 아세토 페논 1- 비닐 -2- 피 롤리 디논 (DMP) (NVP)에 기초하여 "광개시제 용액"을 준비한다. NVP의 1 ml의 DMP의 0.115 g을 결합합니다. (빛을 차단하기 위해) 알루미늄 호일에 포장, 모자 및 와류 믹서에 빠른 속도로 솔루션을 혼합 : (180 μL가 필요합니다 ~, 하나의 발판은. 참고)~ 1 분. (참고 : 고급에서 제조하는 경우, 용액을 냉각하고 빛으로부터 보호되어야한다.)
- 알루미늄 호일 (캡 제외) 거대 단량체 용액을 함유하는 바이알을 랩 (빛을 차단하는) 피펫을 통해 15 부피 %를 추가 개시제 용액 (거대 단량체 용액의 총 부피를 기준으로). 캡 ~ 1 분 동안 와동 믹서 고속으로 용액을 혼합한다.
- 알루미늄 호일 (캡 제외) 용융 염 템플릿을 함유 바이알을 랩 (빛을 차단하기 위해) 및 피펫을 통해 미리 제조 로머 / 광개시제 용액을 추가 (~ 0.6 ㎖에 또는 템플릿까지 완전히 피복).
- , 유리 병 캡 조직 포장 및 원심 분리 관에 수직으로 배치합니다. 템플릿 전반 로머 용액을 분배 1,260 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 알루미늄 호일을 제거 병을 뚜껑을 벗기다, 3 분 동안 자외선 (365 nm의 25 승)에 노출. 공기 건조 O / N.
- "소금 함유 scaffol 제거득점과 유리 병의 상단을 골절 후 핀셋으로 유리 병에서 D ".
- (1 부피 : 부피 1) 400 ㎖의 비이커에, ~ 용매를 물 / 에탄올 200 ㎖를 준비한다.
- 매일 용매 변경 4 일 동안 용매 물 / 에탄올에 빠져들 골격을 유지한다.
- 용매 및 자연 건조 O / N에서 비계를 제거합니다.
3. SMP 비계에 Polydopamine 코팅을 적용 (그림 1)
- 테프론 피복 교반 바가 장착 된 400 ml의 비이커에, 도파민 염산염 용액 ~ 200 ㎖ (10 mM 트리스 완충액에 2 ㎎ / ㎖, pH는 8.5, 25 ºC)를 준비한다. ~ 150 rpm으로 저어.
- 거리의 절반 발판을 발판으로, ~, 일회용 바늘 (게이지 = 20 길이 = 40 mm)를 놓습니다. 바늘 허브 주위에 와이어를 감 쌉니다.
- 비이커의 림에 와이어를 고정함으로써 도파민 교반 용액에 (솔루션면 위에 바늘 허브)와 발판을 담근다.
- 바늘 허브에 주사기를두고 지지체의 공기를 끌어을 사용하여 발판을 탈기. (주 : 더 많은 공기가 제거 될 수 없으며 용액이 완전히 지지체에 침투되면 탈기 완료).
- 16 시간 동안 교반 도파민 솔루션에 빠져들 골격을 유지한다.
- 솔루션에서 비계를 제거하고 바늘을 제거합니다. 24 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 탈 이온수로 세정하고 건조.
- 1 시간 동안 85 ºC 오븐에서 비계를 놓습니다.
- 발판은 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 마지막 원통형 비계 ~ 6mm 직경 X ~ 5mm 높이됩니다.
4. 평가 "셀프 피팅"행동
- 두께 ~ 5mm 인 경질 플라스틱 시트를 이용한 "CMF 요철 결함 모델"을 준비한다. 그림 2A에서 입증 된 바와 같이, ~ 6mm보다 약간 적은 평균 직경 플라스틱 시트 내의 빈 공간을 만들기 위해 드릴을 사용합니다.
- AB에서eaker ~ 60 ºC의 온도 (식염수 임상 사용을 나타내는) 열 DI 물.
- 의 비커 ~ 60 ºC 물에 비계를 놓습니다. 물에 모든 영역을 노출, 수면 아래의 발판을 밀어 핀셋을 사용합니다. 1 ~ 2 분 동안 또는 발판이 눈에 띄게 (그림 2B)을 부드럽게 될 때까지 계속합니다.
- 비커에서 비계를 제거하고 즉시 모델의 결함으로 (손으로) 키를 누릅니다.
- RT (~ 5 ~ 10 분) (그림 2C)을 식 힙니다.
- 새로운 고정 임시 모양과 상대적으로 단단한 상태 (그림 2D)의 반환을 관찰하기 위해 결함에서 제거합니다.
5. 시험 형상 기억 동작
- 동적 기계 분석기를 사용하여 (DMA 본원에서 사용 된 바와 같이, 예를 들면 TA 인스트루먼트 Q800)를, 2 사이클 (N) 형상으로 고정 인 (R의 F)를 결정하기 위해 이상 지지체에 변형 제어형 환상 열적 기계적 압축 시험을 실행할복구 (R의 R) (그림 3) 모양입니다.
- 5 분 60 ° C (T 높은) 평형.
- 50 % / 분에서 최대 변형 (ε 분 = 50 %)에 압축.
- ε 분 (5 분)에서 잡으십시오.
- 25 ° C (T 낮음)으로 냉각시키고, 10 분 임시 모양을 수정하는 유지한다.
- 부하를 제거합니다.
- (U ε) 스트레스없는 상태에서 궁극의 변형을 측정합니다.
- 60 ° C (T 높음)로 재가열하고 10 분 영구 형상을 회복하기 위해 유지한다.
- 복구 된 변형 (ε의 p)를 측정한다.
- 아직 (T 높음) 60 ℃에서, 2 차 사이클을 시작 (N = 2) 1 차 사이클 후에 회수 높이 (N = 1)의 50 %로 압축하여 발판을한다.
- 5.1 반복.3-5.1.8 N = 2.
- 다음 식을 이용하여 N = 1, R 2의 F 및 R의 R을 계산한다 :
R의 F (N) = [U ε (N) / ε 분] R의 R (N) = ε 분 - ε의 P (N)] / [ε M - ε의 P (N-1)]
6. 떠올리 기공 크기와 기공 상호 접속
- 주사 전자 현미경을 사용하여 (SEM, 예를 들면 본원에서 사용 FEI 콴타 SEM)을, 공극 크기를 관찰하고 상호 기공.
- 핀셋을 사용하면, SMP의 발판을 개최 1 분 동안 액체 N 2에 잠수함합니다.
- 깨끗한 면도날과 발판의 중앙을 따라 액체 N 2, 골절에서 제거합니다.
- 카본 테이프를 사용하여, 시료에 SMP 골격 반쪽들 중 하나를 부착골절면이 위를 향하게하여 무대.
- 금-PT (~ 4 ㎚)와 코트를 스퍼터.
- 10 ~ 15 kV의 (그림 4A)의 권장 가속 전압의 SEM 이미지를 캡처합니다.
체외에서 생체 활성 7. 테스트
- 50 ㎖ 원심 분리 튜브로, 24 ~ 1X SBF 30ml의 추가.
- 원래, 원통형 성형 영구 모양의 발판을 얻습니다. 깨끗한 블레이드를 사용하여 (원형 모서리에서) 반 비계를 잘라.
- 준비된 원심 분리기 튜브와 캡으로 개별 발판 절반을 놓습니다.
- SBF 변경없이 정적 조건 하에서 수조에서 37 ℃에서 튜브를 유지한다.
- 십사일 후, 24 시간 동안 SBF 공기 건조에서 비계를 제거합니다.
- 탄소 테이프를 사용하여, 골절면이 위를 향하도록하여 샘플 무대에 발판을 부착합니다.
- 금-PT (~ 4 ㎚)와 코트를 스퍼터.
- 재에서 SEM 이미지를 캡처10 ~ 15 kV의 (그림 4B)의 가속 전압을 칭찬.
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Representative Results
그 결과 PCL 기반 SMP 골격 자체 피팅 모델 CMF 결함으로 (그림 2) 할 수있다. 짧은 노광 후 염수 (~ 60 ° C)을 가온, 원통형 지지체는 지지체가 수동으로 가압 모델 결함 내에 확장 될 수 있도록 연화. RT로 냉각시킨 후, 지지체는 결함으로부터 제거시에 유지되어 새로운 임시 형상으로 고정된다.
SMP 지지체의 형상 기억 거동 형상 고정 인 (R의 F)와 형상 복구 (R의 R) (도 3)의 관점에서 변형 제어형 환상 열적 기계적 압축 시험에 의해 정량화된다. 이 PCL 기반 SMP 비계를 들어, 사이클 값 (%) N = 1, 2는 다음과 같습니다 R의 F (1) = 102.5 0.7, R f를 (2) = 101.8 0.3, R의 R (1) 95.3 0.9 및 R R (2) 99.8 0.2 = 6.
관찰 SMP의 발판이 높은 상호 연결된 기공 형태를 표시SEM 촬상하여 (도 4A). 이것은 체질 염에 소량의 물 (도 1)의 첨가에 의해 형성된 용융 염 템플릿의 사용에 의해 달성되었다.
모의 체액에 노출 된 후 14 일 동안 (SBF 1X), SEM 촬상하여 골격 생체 활성을 나타내는 HAP (도 4b)의 형성을 확인한다.
polydopamine. ASMP 지지체로 코팅 SMP 발판의 준비를위한 그림 1. 도식은 소금 템플릿을 융합 채용하는 폴리 카프로 락톤 아크릴 레이트 (PCL-DA) 용매 캐스팅 분진 침출 (SCPL) 방식을 사용하는 광 화학적 치료를 기반으로 기술 된 프로토콜을 통해 제작된다 및 생리 활성 polydopamine 코팅의 응용 프로그램입니다. 85 ° C (T> T 트랜스)에서 최종 열처리는 발판 덴을 유도sification. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자기 피팅 동작도 2 관측. SMP 원통형 지지체 (~ X ~ 5mm 높이 6mm 직경) "요철 결함 모델"내에 끼워 (A)으로는 다음과 같다. 물에 가열시 ~ 60 ºC (T> T 트랜스), 비계가 부드럽게하고 모델의 결함 (C) 내에서 ( "장착") 기계적으로 누를 수 있습니다 따라서 (B) 전성 및된다. RT로 냉각시킨 다음, SMP 지지체를 제거하고, 새로운, 고정 임시 형태 (D)를 유지한다. ~ 60 ° C에서 후속 가열시, 지지체는 일본어, 일반적인 원통형 형상으로 복구를 겪는다. 
형상 기억 동작 그림 3. 측정. SMP 지지체의 형상 기억 동작은 모양 정착 (R의 F)에 기초하여 모양 복구 (R의 R)을 결정하기 위해 비계에 부담 제어 순환 열 기계 압축 시험을 통해 정량화 ε (M)의 측정, ε U 및 ε P. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
포 4. 관측도전자 상호 및 하이드 록시 아파타이트 (HAP)의 형성. 코팅, 열처리 SMP 발판의 대표 SEM 이미지 (스케일 바 = 200 μm의) (A) 및 코팅, 14 일 동안 SBF (1X)에 노출 된 후 열처리 발판 (스케일 바 = 50 μm의) (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은, 자기 피팅 동작 polydopamine 코팅, PCL 계 지지체의 제조뿐만 아니라, 생체 활성 및 osteoinductivity 설명 불규칙한 CMF 뼈 결함의 치료에서 관심을 만든다. 프로토콜의 측면은 다양한 비계 기능을 변경하는 변경 될 수있다.
이 프로토콜은 UV 경화를 허용하는 PCL 디올의 아크릴화로 시작합니다. 보고 된 예에서, PCL 디올 M n을 ~ 10,000g / 몰이다. 그러나, 적절 PCL-DA, 각각 증가, 가교 밀도를 감소 시키거나하는 데에 이용 될 수있다 높거나 낮은 M n 인 PCL 디올의 합성 중에 사용 염화 아크릴 양과 잇 3 N를 조정함으로써.
용융 염 템플릿 프로토콜 (도 1)에 중요한 요소이다. 염 평균 크기는 결과적인 골격의 기공 크기를 결정한다. 설명 된 예에서, 평균 크기 염이었다 ~ 460 ± 70# 181; m. 작은 크기의 염이 이용 될 수 있지만, 이는 지지체는 공극 크기를 줄일 최종 열처리 공정 동안 수축을 겪는다 명심해야한다. 염 체질 따라서, 기공 크기 분포를 염 크기 분포를 감소하기 위해 이용하고있다. 고도로 상호 연결된 기공을 갖는 지지체를 제조하기 위해 염 융합체는 소량의 물을 첨가하여 유도 하였다 (7.5 중량 %, 염 중량 기준). 이것은 부분적으로 연속 poragen 템플릿 25,26으로 절연 된 염화나트륨 입자를 용해하는 것으로 알려져있다. 염 평균 크기에 따라, 물 첨가량은 14으로 조정되어야한다. 또한, 염 융합시, 물은 점차 기계적 혼합 마침내 고른 분포뿐만 아니라, 염 입자의 포장을 위해 원심 추가되어야한다.
용융 소금 템플릿을 형성하는 데, PCL-DA 용매 캐스팅에 대한 DCM에 용해된다. 설명 프로토콜, concentratioDCM 1 ㎖ 당 PCL-DA 0.15 g을 N을 사용 하였다. 이는 농도가 증가 또는 감소 될 수있다. 증가하는 농도를 골격 모듈러스 증가 할 것으로 예상되는 반면 그러나, 이것은 또한 낮은 기공 상호 접속 (14)와 발판을 생산할 수있다.
전구체 용액을 몰드에 염을 첨가 한 후, 원심 분리는 템플릿으로의 확산의 측근에 도움이된다. 신속한 UV 경화 후, 공기 건조 DCM 용매의 증발을 허용한다. 소금 템플릿을 제거하기 위해 4 일 동안 (권 : 1 권 1) 금형에서 제거 후, 골격은 물 / 에탄올에 배어있다. SEM 영상은 고도로 상호 연결된 기공 모폴로지 (도 4a)의 형성을 확인한다.
polydopamine 코팅은 생체 활성을 부여하기 위해 지지체의 기공 벽에 적용된다. 인해 생성 된 골격 수축률은 최종 열처리 공정 6 전 코팅을 적용하는 것이 최상이다. 또한, 탈 가스수성 도파민 용액에 잠긴 상태에서 발판이 침투를 지원합니다. 용액에 잠긴 탈기 발판 남아 균일 polydopamine 범위를 용이하게한다. 일단 도포하고, 충분히 세정 이전 백색 비계 polydopamine 21 브라운 색 특성을 나타낸다. 따라서, 발판에 걸쳐 범위는 polydopamine 확산을 확인하는 발판을 절반으로하여 육안 검사로 평가 될 수있다.
polydopamine 코팅의 도포 후, 최종 열처리는 (85 ºC, 1 시간)을 행한다. 언급 한 바와 같이,이 프로세스는 골격 수축을 초래한다. 그러나, 열처리는 가까운 근접 때문에 아마도 PCL 결정질 도메인 (즉, 스위칭 세그먼트)의 개편으로, 형상 기억 행동 (14)을 달성하기 위해 필수적이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, SMP 지지체 인해 저 모양 thermoresponsive 그 자체에 피팅 모델에서 결함을 달성mory 자연입니다. 노출은 식염수를 따뜻하게 (~ 60 ° C)가 연화 된 골격 모델 결함으로 가압 될 수 있도록 PCL 결정질 도메인의 유도 용융. 수동 압력이 해제되었을 때, 형상 회복은 불규칙한 경계를 채우도록 발판의 퍼짐을 촉진. RT로 냉각 한 후, PCL 결정질 도메인은 결함에서 분리 보관 하였다 새로운 임시 형상으로 지지체를 고정, 개질. 이전에, 우리는 제거 발판의 가장자리를 따라 구멍 금형 (6)과의 접촉에도 불구하고 매우 개방 남아 있음을 확인.
변형 제어형 환상 열적 기계적 압축 시험 (도 3)에 의해 측정 할 때 이상적인 형상 기억 동작이 100 %의 R의 F 및 R의 R 값을 특징으로한다. 설명 SMP 비계를 들어, 사이클 1과 2에 대한 R의 F 값은 약간> 100 % (6)이었다. R의 F는 이전 약간 GR 것으로 관찰되었다100 % 14,27 이상으로 인해 더 컴팩트 한 구조 (27)에 또는 PCL의 압축에 의한 재결정에서 PCL 세그먼트의 재결정에서 모양의 고정 동안 압축 변형에 약간의 증가에 먹는. 또한, R은 사이클이 6주기를 1 증가 r에. R의 R 값의 증가는 이전에 고체 28,29,22 다공성 SMP의 13,14,23에 대해 언급하고있다. 이는 첫 번째 사이클 동안 처리 유래 잔류 변형은 다음 사이클 (7)이되도록 형상 회복 증가 제거한 것으로 생각된다.
설명 된 조직 공학 골격은 CMF 뼈 결함의 성공적인 치료를위한 중요한 특성의 특정 세트를 달성한다. 지지체가 불규칙한 CMF 뼈 결함 내에있는 능력 "셀프 맞는"통해 골융합을 용이하게 할 것으로 예상된다. Osteoconductivity은 물론 달성 세공 상호 예측에 기초비계 생분해. 생체 외 실험 (도 4B) 중 HA의 형성에 의해 지시 된 바와 같이 마지막으로 인해 polydopamine 코팅에, 지지체는 생체 활성이다. 이 생체 활성은 뼈 조직을 둘러싼 통합 및 결합을 용이하게 예측된다. 따라서,이 비계는 CMF 뼈 결함 수리를 위해 autografting하는 다른 기존 뼈의 대체를 나타냅니다.
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Acknowledgments
저자는 텍사스 A & M 대학 공학을 감사하고이 연구의 금융 지원을 위해 역 (티) 실험. 린지 네일은 감사 소수 참가 텍사스 A & M 대학 루이스 스톡스 얼라이언스 (LSAMP)와 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 활동 프로그램 (GRFP)의 지원을 인정합니다. 웨이 장은 감사 텍사스 A & M 대학 논문 친목.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G.
- Hollister, S. J., et al.
- Albrektsson, T., Johansson, C.
- Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
- Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
- Lendlein, A., Kelch, S.
- Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
- Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
- Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
- Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
- Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
- Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
- Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
- Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
- Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
- Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
- Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
- Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
- Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
- Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
- Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
- Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
- Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
- Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
- Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).
