Summary
نحن هنا توظيف منهجية FISH لتتبع الخط 1 retrotransposition على مستوى نواة واحدة في هوامش كروموسوم من خطوط الخلايا HepG2 التعبير عن ثابت خط 1 الاصطناعية.
Introduction
الإنسان طويل تتخللها النووية العنصر 1 (الخط 1 أو L1) هو عنصر المنتقلة والمستقلة التي تنتشر داخل الجينوم من خلال "نسخ ولصق" آلية retrotransposition. وL1 الإنسان النموذجي هو ~ 6 كيلو بايت طويلة ويتكون من 5'UTR (منطقة غير مترجمة) التي هي بمثابة المروج، إطارين القراءة المفتوحة (ORFS): L1 -ORF1 وL1 -ORF2، و3'UTR مع بوليا . ذيل L1 البروتين -ORF1 ثلاثة مجالات مختلفة هي: مجال لفائف لفائف، RNA الاعتراف الحافز ونطاق C-محطة، بينما بروتين L1 -ORF2 ديه نوكلياز داخلية، عكس الناسخ والسيستين المجالات الغنية 1،2،3،4،5. L1 -ORF1 يسلك أنشطة حمض كوصي النووية، في حين يوفر L1 -ORF2 الأنشطة الإنزيمية، مع كل من البروتينات اللازمة لretrotransposition 1،2،6.
دورة من L1 retrotransposition يبدأ النسخ من 5'UTR من L1 L1 -ORF1 المعارض إما -binding رابطة الدول المستقلة حيث حزم RNA الخاص بها أو -binding العابرة حيث حزم الرنا الأخرى (أي، جيب / SVAS / الكاذبة) لتشكيل الجسيمات بروتين نووي ريبوزي (RNP) مع L1 -ORF2p 7، 8. RNPs نقل من داخل النواة حيث النشاط نوكلياز داخلية من النكات L1 -ORF2p الحمض النووي الجيني (gDNA) للكشف على OH - مجموعة 9، التي هي بدورها تستخدم من قبل الناسخ العكسي لرئيس الوزراء وعكس توليف الحمض النووي الريبي على الحمض النووي من نهاية 3 '. خلال التوليف العكسي، ورصدت في الشق الثاني من الحمض النووي 7-20 سنة مضت من موقع نيك الأصلي لإنشاء فواصل متداخلة التي تمتلئ لتشكيل توقيع تسلسل L1 الإدراج (على سبيل المثال، TTTTAA) دعا الازدواجية الموقع المستهدف (TSD) 9،10. وتعرف هذه العملية باسم هدفا رئيسيا عكس النسخ (TPRT) ويؤدي إلى insertiعلى النسخ الكاملة أو اقتطاع من L1 / السلطات الوطنية المعينة الأخرى مع TSDs على طرفي تسلسل المدرجة. كما ثبت L1 retrotransposition أن تتم من خلال TPRT مثل غير المتجانسة نهاية الانضمام في بعض الخلايا أنواع 11.
متجه L1 retrotransposition العاملين في دراستنا هو غير episomal ويتكون من الموسومة L1 -ORF1 و2P يقودها المروجين-CMV L1-5'UTR جنبا إلى جنب (الشكل 1) 12. وقد وصفت الإصدارات السابقة من هذا البناء في الدراسات التي تستخدم الخميرة والثقافات الخلية البشرية 13،14،15. اثنين من المروجين CMV متميز يقع في 5 'و 3' تنتهي من ناقلات، مع نهاية 3 'وضعت في اتجاه عكسي لدفع التعبير من النيوميسين بعد الربط والتكامل. الكاسيت مؤشر retrotransposition في نهاية 3 'يتكون من الجين إدراج العقاقير بالنيوميسين إلى L1 -ORFs وتقديم نشط من فصل إلى نصفين بواسطة غلوبفي إنترون مع الجهات المانحة تقسم (SD) ومواقع تقسم متقبل (SA) (الشكل 1). على الاندماج في كروموسوم، وكتب L1 من المروج مشترك لإنتاج الرنا المرسال الذي يتكون من مرنا bicistronic ومرنا بالنيوميسين غير نشط. أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين لاستعادة جين بالنيوميسين تعمل بكامل طاقتها. يتم حزم مرنا الهجين في الأداء الملاحي المطلوب في رابطة الدول المستقلة وtranslocated الى نواة حيث يتم دمجها في الجينوم إما كامل طول أو اقتطاع الإدراج باستخدام TPRT.
نحن هنا وصف المنهجية التي تستخدم مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات موجهة تحديدا في الجين بالنيوميسين تقسم (SNeo) لتتبع أنماط -retrotransposiition L1 ومعدلات الإدراج في مستوى نواة واحدة. وأكد كفاءة وخصوصية كشف باستخدام retrotransposition المختصة وبنيات غير كفء وتحقيقات لديتإلخ SNeo أو النيومايسين وغلوبين إنترون تقاطع 16. حسابات هذه المنهجية لبعض من أوجه القصور في المقايسات retrotransposition ثقافة خلية مقرها، مثل الإدراج متعددة، ومقاومة مستعمرة والتوسع استنساخ مواتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يرجى الرجوع إلى قسم الكواشف حصول على تفاصيل حول كيفية تحضير الكواشف الفردية.
1. التعريف L1 تحقيقات
ملاحظة: المسابر يمكن أن توصف بوصف الكيميائي أو PCR.
- وضع العلامات الكيميائية
- جعل جل الاغاروز 0،7-1٪ في تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، الحرارة في الميكروويف حتى يذوب، والسماح للهلام لتبرد ثم قم بإضافة إيثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام / مل). تصب في صينية هلام، إضافة أمشاط، والسماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة.
- تسمية التحقيق SNeo (1-2 ميكروغرام) مع CY3 أو FITC عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: SNeo يدل على S pliced الجدد الجينات mycin أعرب بعد دورة كاملة من retrotransposition. وهذا التحقيق هو ~ 1000 BP في الحجم. SNeo يمكن PCR تضخيمها من أي ناقل أو من genomجيم الحمض النووي. انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن Streptavidin-CY3 / FITC الكواشف وضع العلامات. - خلط SNeo حل المسبار المسمى العازلة مع 1X الحمض النووي تحميل، تحميل في كل بئر وتشغيلها في 75-100 فولت لمدة 15-20 دقيقة.
- تصور الفرقة التحقيق باستخدام-الأشعة فوق البنفسجية (UV) المنور. لاحظ أن حجم التحقيق SNeo يمكن تعديلها وقفل نوى حمض (LNA) ويمكن أيضا أن تضاف (الشكل 2).
- قطع صفت SNeo المسبار من هلام بشفرة نظيفة، إذابة وتنقية التحقيق SNeo من الجل باستخدام مجموعة PCR تنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
تنبيه: تغطية كل جزء المكشوفة من الجسم مع الدروع الواقية (أي، معاطف المختبر والأشعة فوق البنفسجية واضح قناع الوجه) عند عرض وقطع هلام. انظر الجدول من المواد والكواشف للمعلومات إلى هلام تنقية المنتجات PCR. - إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع SNeo التحقيق وصفت الامم المتحدة على هلام الاغاروز 0.7٪ (انظر 1.1.1) لخداعزيادة حجم الشركة وفقدان كثافة إشارة (الشكل 2).
- تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر، وتمييع التحقيق SNeo إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
- PCR وصفها (طريقة بديلة لوضع العلامات التحقيق)
- الجمع بين SNeo الاشعال محددة (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 "و 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3 ') مع الكواشف PCR في أنبوب واحد: 13.6 ميكرولتر نوكلياز مجانا H 2 O؛ 0.1 dATP ميكرولتر، dCTP، dGTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dTTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dUTP البيوتين / dUTP-FITC / CY3 (10 نانومتر)؛ 4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية 5X العازلة؛ 0.4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية البلمرة. قالب SNeo 1 ميكرولتر (10 نانوغرام). انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن الكواشف PCR.
- ضبط كمية من كل كاشف عن طريق ضرب من قبل عدد من العينات.
- استخدام المعلمة الدراجات PCR التاليةالصورة لتضخيم والتسمية SNeo تحقيقات: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
ملاحظة: درجة الحرارة الصلب يمكن تعديلها أو يمكن الانتهاء التدرج PCR لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى لتحقيقات أخرى. - جعل جل 0،7-1٪ كما في القسم 1.1.1، تحميل ووضع تصور لفرقة التحقيق كما هو الحال في القسم 1.1.4.
- قطع وتنقية SNeo التحقيق المسمى كما هو الحال في القسم 1.1.5.
- إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع المسمى الامم المتحدة SNeo التحقيق لتأكيد زيادة حجم وفقدان كثافة إشارة (انظر الشكل 2).
- تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo التي كتبها الامتصاصية قياس في 260 نانومتر، وتمييع SNeo التحقيق إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O.
2. إعداد ينتشر كروموسوم
- توليد الحيوانات المستنسخة مستقرة التعبير عن ناقلات العمود الفقري (كنترولل) أو retrotransposition L1 المختصة باستخدام منهجيات اختيار القياسية. 12،16 بينما استخدمت للصحفيين غير episomal لربط النتائج مع دراسات من النسخ، ويمكن أيضا أن تستخدم ناقلات episomal. تنمو الخلايا معربا عن ستابلي السيطرة أو ناقل L1 (1 × 10 6 خلايا في 10 سم لوحة، مع تعديلات في حجم لوحة مصنوعة حسب الحاجة) في وسائل الاعلام النمو الكامل. لخلايا HepG2، استخدم RPMI-1600، و 10٪ FBS و 200 ميكروغرام / مل من هيغروميسين. تنمو الثقافات إلى 70٪ التقاء عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
ملاحظة: إن اختيار المتوسطة النمو يعتمد على نوع من الخلايا. وبالنظر إلى أن البلازميدات المستخدمة هنا تحمل أشرطة اختيار كل من هيغروميسين والنيوميسين، ويمكن أيضا أن يتم اختيار مستقرة من الحيوانات المستنسخة مع النيومايسين بعد اختيارهم على هيغروميسين، ولكن المبلغ من النيوميسين يحتاج إلى أن يكون الأمثل لتحديد مستويات التسامح مع كل نوع من الخلايا. - إضافة colcemid (0.4 ميكروغرام / مل) إلى مستنبت واحتضان لمدة 90 دقيقة لاعتقال الخلايا في metaphبورصة عمان. في حالة استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، تحديد تركيز الأمثل للcolcemid ووقت التعرض (60، 90، و 120 دقيقة) لاعتقال الطورية الأمثل تجريبيا.
- غسل الخلايا 2X مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و(DPBS)، ويعرض للتريبسين بإضافة 3-5 مل من 0.25٪ التربسين حل للخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا. تعطيل التربسين مع مبلغ مساو من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونضح المتوسطة من الخلية بيليه وغسل الخلايا مع DPBS. نضح كل DPBS، وترك 200 ميكرولتر من DPBS لاعادة تعليق الخلايا. يتم خلط ضمان الخلايا بشكل جيد وأن جميع كتل متفرقة. استخدام الخفقان أو pipetting لطيف لخلط وتفريق كتل وتجنب vortexing ل.
- إضافة 5 مل من محلول منخفض التوتر (أي 75 ملي بوكل) التي هي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية قطرة من الحكمة في حين تناوب أنبوب 15 مل أفقيا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انظر الجدول المواد وReagenالخبر للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل حل ناقص التوتر.
- خلايا الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وكرر الخطوات من 2،4-2،5 3X ترك ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول منخفض التوتر لاعادة تعليق الخلايا بعد كل غسل. ضمان أنه في نهاية 3 يغسل، بيليه الأبيض بشكل واضح ومنتفخة.
- إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من حل Carnoy تثبيتي، وجعل 1: 2، 1: 4، 1: 8، 01:16 التخفيفات في حل Carnoy مثبت. إسقاط 10 ميكرولتر من كل تخفيف على شريحة نظيفة وجافة من حوالي 1 سم فوق وفضح فورا الجانب خالية من انتشار لالبخار الساخن من الماء المغلي لمدة 30 ثانية. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل Carnoy مثبت.
- تجفيف فروق في درجة حرارة الغرفة، وصمة عار مع 0.1 ميكروغرام / مل هويشت-33342 عن طريق الغمر لمدة 15-20 دقيقة في Coplin جرة وغسل 3X مع DPBS. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل هويشت-33342. <لى> مشاهدة ينتشر في مضان المجهر / المرحلة على النقيض في 40X التكبير. بعد تحسين إعداد انتشار، ليس من الضروري أن تكون ملطخة ينتشر مع هويشت-33342. رأي ينتشر على المجهر مرحلة التباين في 10X التكبير لتحديد نوعية انتشار والانفصال كما هو موضح في قسم النتائج (انظر الشكل 3).
- اختيار ودائرة هوامش جيدة مع نقطة علامة الماس على الجانب الآخر من الشريحة (أي نشر خالية من الجانب).
- متجر ينتشر في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد. تجنب التعرض للرطوبة.
3. الإسفار في الموقع التهجين (FISH)
- استقرار والتجفيف ينتشر
ينتشر يوازن الطورية كروموسوم إلى درجة حرارة الغرفة إذا المخزنة في -20 ° C: ملاحظة. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.- ينتشر احتضان كروموسوم الطورية مع 200 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف ل1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- غسل الشرائح العازلة-2X SSC مرتين لمدة 5 دقائق كل تليها الشطف مع 10 ملي حل حمض الهيدروكلوريك.
- احتضان ينتشر بنسبة 1٪ البيبسين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف مع H 2 O منزوع الأيونات ويغسل مرتين مع العازلة-2X SSC لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان ينتشر مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة ويغسل العازلة في SSC 2X مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- يذوى ينتشر عن طريق احتضان لمدة 2 دقيقة في سلسلة الايثانول: 70٪، 80٪، و 95٪ من الإيثانول.
- الشرائح الهواء الجاف.
- التهجين ينتشر مع L1 تحقيقات retrotransposition -labeled (أي SNeo)
تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.- إضافة 30 نانوغرام من SNeo إلى عازلة التهجين، الحرارة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 30 ميكرولتر من SNeo حل التحقيق إلى البريدانتشار منظمة العمل ضد الجوع، وتغطي مع ساترة وختم حواف مع الاسمنت والمطاط. ضمان عدم تشكيل فقاعة.
- حرارة الشريحة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة، وانخفاض تدريجي في درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة ترطيب المظلمة عند 37 درجة مئوية.
- غسل وعرضها (أو إضافة الجسم المضاد الثانوي)
تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات.
ملاحظة: انظر جدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية إعداد. يوصى باستخدام كمية كافية لتغطية انتشار كروموسوم كامل. تذكر أن حجم الفائض سوف تضيع عند إضافة ساترة.- تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لإزالة coverslips.
- غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن-2X SSC في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- غسل الشرائح عن طريق الغمر في غسل العازلة في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 2X.
- غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 0.1X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 2X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: ضع جرة Coplin تحتوي عازلة الموصى بها في حمام مائي، وضبط درجة الحرارة إلى 45 درجة مئوية. - الشرائح باردة لدرجة حرارة الغرفة ويوازن الشرائح العازلة في الكشف.
- لتحقيقات المسمى مباشرة، انتقل إلى الخطوة 3.4.10.
- لتحقيقات المسمى غير المباشرة، كتلة في عرقلة العازلة لمدة 20-30 دقيقة ويغسل 3X في DPBS.
- احتضان مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام / مل streptavidin-FITC، أو αCY3 في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة.
- غسل الشرائح في 2X SSC لمدة 5 دقائق مرتين.
- مباين مع هويشت-33342 حل (0.1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يتم ذلك تلطيخ وصمة عار الكروموسومات للمشاركة في توطين مع التحقيق. - يغسل في DPBS 3X، إضافة قطرة من المتوسطة المتزايدة، وضع ساترة وختم حواف مع طلاء الأظافر.
- تحليل L1 retrotransposition باستخدام المجهر مضان في 40X أماهgnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد رسم تخطيطي للناقلات retrotransposition L1 في الشكل 1. ويتكون ناقل الجين بالنيوميسين في اتجاه مضاد لL1 ORFS التي تقطعها إنترون الغلوبين في توجيه معنى وتقع بواسطة SD والمواقع SA. عند دمجها بشكل مستقر في كروموسوم، وكتب L1 مرنا من CMV جنبا إلى جنب والمروج L1-5'UTR (الشكل 1). أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين. يتم حزم الجدد L1 RNA، translocated ودمجها في الجينوم إما بالطول أو الإدراج اقتطاع. كما هو مبين، يمكن تتبع L1 retrotransposition بواسطة FISH باستخدام تحقيقات محددة لالنيوميسين تقسم (الشكل 1).
ويبين الشكل 2 تمثيل تخطيطي لجنة التحقيق بالنيوميسين، مع labeleسبرت د الذي هو أكبر حجما ومضان ناقص بسبب الاختلافات في موجات الإثارة. لاحظ أن CY3 وFITC تثير في أطوال موجية مختلفة من بروميد إيثيديوم الحمض النووي الملون.
تم تحديد كثافة ينتشر كروموسوم الطورية عن طريق تمييع الحل المخزون الأصلي إلى 1: 2، 1: 4، 1: 8 و 01:16 التخفيفات ولكل انتشار تقييمها لكثافة وتوزيع ومسافة ينتشر من النواة في 10X التكبير ( الشكل 3A). أظهرت النتائج كثافة عالية، ملتف وتفجرت ينتشر (الشكل 3A-ط-ب)، وكذلك موزعة على النحو بالتساوي وينتشر متباعدة بشكل جيد (الشكل 3A-ج-د). ينتشر منخفض الكثافة مع اختيرت حتى توزيع لتحليلها لاحقا.
كانت ملطخة ينتشر كروموسوم مع هويشت صبغ وانتشار نوعية تقييمها على أساس طول الكروموسومات، استدارة الصورةpreads والمسافة بين كروموسوم (الشكل 3B). تأثرت هذه المؤشرات التي كتبها طول الوقت تم علاج الخلايا مع colcemid، حل ناقص التوتر، حل Carnoy تثبيتي و / أو الطريقة التي تم ضبطت خلايا لاطلاق سراح الكروموسومات. إذا كانت الخلايا المحتضنة لفترة قصيرة في محلول ناقص التوتر، أصبح ينتشر كروموسوم معقود بإحكام وكان من الصعب تصور (الشكل 3B-ط) الكروموسومات الفردية. من جهة أخرى، أسفرت حضانة أطول في حل ناقص التوتر في تمزق نوى، نثر من الكروموسومات، و / أو خسارة من الكروموسومات (الشكل 3B-II). حضانات أطول في colcemid زيادة عدد الخلايا في الطورية، ولكن تؤدي إلى التكثيف من الكروموسومات (الشكل 3B-ج). على هذا النحو، جيدة انتشار جودة كروموسوم يتطلب فترات الحضانة المثالية في كل colcemid وحل بوكل منخفض التوتر. في أيدينا، وحضانة 90 دقيقة في colcemid، 20 في محلول منخفض التوتر على 37 تم العثور درجة مئوية، واستخدام البخار الساخن لتفجير الخلايا لتكون الظروف المثلى لتوليد ينتشر جودة عالية (الشكل 3B-IV).
كانت ملطخة ينتشر كروموسوم لL1 retrotransposition باستخدام المجسات التي تستهدف SNeo. وصفت لجنة التحقيق مع كل من FITC وCY3 لإظهار أنه في كلتا الحالتين يعتبر L1 retrotransposition فقط في الخلايا معربا عن النوع البري L1 (الشكل 4). واعتبر أي تلطيخ في الخلايا معربا عن العمود الفقري ناقلات وحدها (الشكل 4؛ مقارنة أعلى وأسفل لوحات لكل fluorophore). في أيدينا، تم الكشف عن إشارة التحقيق في 80-90٪ من النوى، والغالبية الساحقة من إشارة تمثيل الأحداث retrotransposition واحدة. سجلنا فقط retrotransposition في نوى مع إدراج أكثر من واحد وانتشار نوعية تم فحص دائما قبل FISH.
هين الصفحات = "1"> 
الشكل 1. رسم تخطيطي من ناقلات retrotransposition L1. رسم بياني يصور عملية هدفا رئيسيا النسخ العكس مما يؤدي إلى الإدراج L1 الكامل أو اقتطاع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إعتبر SNeo وتحقيقات النيوميسين غير المسماة. يسلك التحقيق المسمى أقل مضان وأكبر في الحجم بالمقارنة مع لجنة التحقيق الخالي من الملصقات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هين الصفحات = "1"> 
الرقم 3. المرحلة على النقيض (حقل مشرق) وهويشت ينتشر صمة عار كروموسوم. أ) يظهر تخفيف من هوامش للحصول على الاستعدادات متباعدة بشكل جيد. شريط النطاق هو 50 ميكرون. ب) هويشت صمة عار كروموسوم يظهر تأثير colcemid، حل ناقص التوتر، حل Carnoy تثبيتي وانفجار على نوعية انتشار. شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم تحليل 4. FISH من L1 retrotransposition. تلون SNeo غائب التحكم في الخلايا، ولكن موجودة في الخلايا معربا عن L1 ناقلات wildtype. شريط النطاق هو 10 ميكرون.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم توظيف منهجيات مثل تسلسل الجينوم بأكمله، معكوس PCR والنشاف جنوب لدراسة L1 retrotransposition. على الرغم من أن هذه المنهجيات هي قيمة للغاية في تحديد مكان وقوع الإدراج L1 داخل الجينوم، تحديا الخلط لجميع من لهم هو الحاجة إلى برمجة في سيليكون لإعادة تجميع متواليات. تم تصميم منهجية الأسماك وصفها هنا لتكمل هذه الطرق، خاصة في حالة الدراسات التي تتطلب تحليلات خارج الرحم retrotransposition L1 في الخلايا المستزرعة. النهج يمكن أن تستخدم في كل من التقييم الكمي والنوعي للأحداث retrotransposition وتطبيقها على البيني نوى. هذه المنهجية تفتخر دقة أساليب تسلسل المحاذاة اللاحقة في سيليكون المستخدمة في تحديد المواقع الإدراج L1 خارج الرحم 16. محاذاة تسلسل المتكررة يمكن أن يكون غامضا بسبب تشكيل homopolymers، في حين sequen المتكررةالمجال الاقتصادي الموحد يمكن أن تضيع خلال التضخيم التمهيدي من القالب مما أدى إلى نقص تمثيل تسلسل المتكررة. منهجية FISH يمكن التغلب على هذه المشاكل بسبب تحقيقات الأسماك يمكن أن يصلب لhomopolymers ومن غير المرجح أن يكون متحيزا ضد تكرار تسلسل سليمة 16. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع المقايسات retrotransposition القائمة على الثقافة الخلية، يمكن FISH تحديد معدلات retrotransposition على مستوى نواة واحدة. على هذا النحو، ويمنع هذا النهج تحت وفوق تقدير معدلات retrotransposition يمكن أن يحدث الإدراج كما متعددة في نواة واحدة 16 على حد سواء. وقد أكدت بيانات حديثة تم الحصول عليها من خ ع أن المنهجيات القائمة على الثقافة خلية تقلل الترددات retrotransposition 25.
ولم يتضح بعد حيث يفضل الشباب L1s لادخال وعما إذا كانت آلية تستهدف وجود توجيه هذه الإدراج داخل الجينوم. باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه أظهرنا أن L1 إدراج تفضيلي داخل الجين الفقيرة إعادةاملناطق من الجينوم 16. وأظهرت دراسات أخرى أن وفرة من متواليات L1 هي زيادة في الكروموسومات مع كثافة الجينات أقل 17،18. معا، وهذه النتائج تشير الى وضع المنظم للالإدراج حيث يتم الحد من التهديدات التي تتعرض لها الخلية عن طريق إدخال L1 إلى مناطق "أقل نشاطا" من الجينوم. فقد قدمت نمط حركة جين قافز في أقل الكائنات الدعم لهذا التفسير. على سبيل المثال، الانشطار الخميرة retrotransposon، TF1، يدمج 95٪ من الوقت المنبع من المروجين الجين وتشارك معظم هذه الجينات في تنظيم الضغط 19،20. في خلايا الخميرة التي تفتقر إلى الوصول إلى النيتروجين، Ty5 يدمج في ORFS بدلا من المناطق المغاير 21. وقد أظهرت التجارب في الذرة أن دمج الترانسبوزونات الحمض النووي يؤدي إلى التلون الظواهر لون الذرة وتكامل Hatvine1-RRM ينقول الحمض النووي في منطقة المروج من الجينات VvTFL1A وقد تبين أن influenم نمط المتفرعة وحجم ثمرة الكرمة 22،23.
الخطوات الحاسمة لنجاح منهجية FISH مفصلة هنا هي جيل من هوامش جيدة كروموسوم ووضع العلامات المناسبة وتنقية والتهجين من تحقيقات. إذا لم يتم تنظيفها تحقيقات بشكل صحيح، سوف ينتج عن ذلك من ارتفاع إشارة الخلفية تجعل من الصعب حل التحقيق ملزم لالكروموسومات. ويفضل أن تكون تحقيقات هلام تنقية للقضاء على مضان المتبقية من dNTPs. أيضا، وطول الفترة الزمنية التي يتم تحضين ينتشر في حل Carnoy مثبت مهم لإعداد ينتشر كروموسوم جيدة. إذا فترة طويلة جدا، وغشاء الخلية قد تنفجر قبل الأوان، ويسبب فقدان كروموسوم. إذا قصيرة جدا، قد يكون من الصعب الحصول على هوامش مناسبة بسبب تمزق غشاء ناقص. مبلغ / تركيز الفورماميد يحدد محور الصبغي، ولذا فمن المهم تحسين تجريبيا حصول على أفضل النتائج. يجب أن تكون جميع يغسل شامل لENSلدى عودتهم التي يتم غسلها عن تحقيقات غير منضم والأجسام المضادة الثانوية خارج.
في الختام، فإن منهجية FISH الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لكشف كل من كامل طول واقتطاع خارج الرحم الأحداث retrotransposition L1 ويمكن تطبيقها على ناقلات retrotransposition أخرى باستخدام البروتين مضان أخضر (GFP) كما الكاسيت مؤشر retrotransposition. وعلى الرغم من طول كامل الإدراج L1 يمكن تحديد باستخدام هذه المنهجية، فإنه لن تمييز الإدراج اقتطاع الذاتية الجديدة ويرجع ذلك إلى عدد من اقتطاع L1 الصورة داخل الجينوم. إمكانية الوصول إلى التحقيق يمكن أيضا مقيدة تشكيل زيادة المغاير 16،24. ومع ذلك، فإن إدراج LNA ضمن تحقيقات الأسماك يمكن أن تستخدم لتعزيز التحقيق الصلب. الكشف عن SNeo يتوقف على دورة كاملة من retrotransposition والإدراج أصغر من التحقيق يمكن تفويتها / الحذف.
لوصفا مفصلا للتجارب في حركتيح تتميز استخدام هذه النواقل والتعبير عن البروتينات L1 وretrotransposition، يرجى الرجوع إلى نشر يعمل 12،16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المحتملة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
