Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Développement et caractérisation de Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/54014
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University
* These authors contributed equally

Abstract

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire. Bien que le développement de dispositifs microfluidiques a été adopté par les ingénieurs plus de deux décennies, leurs applications biologiques restent limitées. Un modèle in vitro plus physiologiquement pertinents dans des microvaisseaux validées par des applications biologiques est important pour faire avancer le terrain et combler les lacunes entre in vivo et in vitro des études. Ici, nous présentons des procédures détaillées pour le développement du réseau de microvaisseaux cultivées en utilisant un dispositif microfluidique avec une capacité de perfusion à long terme. Nous démontrons également ses applications pour des mesures quantitatives de changements induits par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et de l' oxyde nitrique (NO) la production en temps réel en utilisant la microscopie confocale et de fluorescence conventionnelle. Le filet de microvaisseaux formétravail avec perfusion continue a montré des jonctions bien développées entre CEs. la distribution VE-cadhérine était plus proche de celle observée dans les microvaisseaux intacts que monocouches CE statiquement cultivées. ATP-induit des augmentations transitoires CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été quantitativement mesurée à des niveaux de cellules individuelles, qui a validé la fonctionnalité des microvaisseaux de culture. Ce dispositif microfluidique permet ECs de croître sous un flux physiologiquement pertinente bien contrôlée, ce qui rend l'environnement de culture cellulaire plus proche de in vivo que dans les cultures, 2D statiques classiques. La conception du réseau de microcanaux est très polyvalent, et le processus de fabrication est simple et reproductible. Le dispositif peut être facilement intégré au système microscopique confocale ou conventionnelle permettant l'imagerie haute résolution. Plus important encore, parce que le réseau de microvaisseaux de culture peut être formé par CEs humaines primaires, cette approche servira comme un outil utile pour étudier commentpathologiquement modifiés composants sanguins à partir d'échantillons de patients affectent CEs humaines et permettent de mieux comprendre les problèmes cliniques. Il peut également être mis au point en tant que plate-forme pour le criblage de médicaments.

Introduction

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire 1,2. La technologie microfluidique permet à un fluide régulé avec précision à travers un micro - géométrie contrainte (inférieure au millimètre) , les canaux 3, ce qui offre la possibilité aux cellules mises en culture, en particulier pour vasculaires endothéliales, de croître sous des conditions d'écoulement désirées. Ces caractéristiques rendent les conditions de culture cellulaire plus proche in vivo que les cultures classiques, des cellules 2D statique. Ils sont extrêmement importants lorsque les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour modéliser différents types de systèmes vasculaires et d'étudier les réponses des CE aux stimulations mécaniques et / ou chimiques.

En dépit des avantages démontrés par le réseau de micro-canaux sur une culture cellulaire statique, l'adaptation et l'application de la microfluidique dans le f biomédicalield restent limitées. Rapporté par une récente étude, la majorité des publications de ce domaine (85%) sont encore dans des revues d'ingénierie 4. La performance des dispositifs microfluidiques n'a pas été assez convaincant pour la plupart des biologistes de passer de techniques actuelles, telles que le test Transwell et la glissière boîte de culture / verre macro-échelle à ce dispositif miniaturisé. La microfluidique est un domaine multidisciplinaire, ce qui nécessite des collaborations interdisciplinaires pour faire avancer ce domaine avant. L'objectif de cet article technique est de réduire les écarts de connaissances entre les disciplines et rendre les procédures de fabrication compréhensible par les biologistes, tout en assurant l'application biologique et la validation fonctionnelle des microvaisseaux microfluidiques. Les protocoles expérimentaux visualisés comprennent la fabrication des deux dispositifs microfluidiques et leurs utilitaires biologiques, ce qui représente une étroite collaboration entre les ingénieurs et les biologistes.

Nous avons récemment rapporté certainsapplications biologiques en utilisant le réseau de microvaisseaux in vitro avec dispositif microfluidique 5. Afin de concevoir de manière appropriée les dimensions du réseau de microcanaux et d'appliquer la contrainte de cisaillement souhaitée, un modèle numérique a été construit avec le logiciel de dynamique des fluides computationnelle pour estimer étroitement le profil d'écoulement. Les cellules primaires de la veine ombilicale humaines endotheliales (HUVEC) qui ont été ensemencés dans les microcanaux ont atteint la confluence, soit couvert l'ensemble des surfaces internes du micro - canal, en 3-4 jours avec une perfusion continue. La formation de la barrière adéquate a été démontrée par la VE-cadhérine et la coloration par rapport à ceux formés dans des conditions de culture cellulaire statiques et dans les microvaisseaux intactes. En appliquant les protocoles expérimentaux développés en microvaisseaux intacts perfusés individuellement 6-8, nous quantitativement mesuré les changements dans la CE [Ca2 +] i et de l'oxyde nitrique (NO) en réponse à l' adénosine triphosphate (ATP) avec fluorescent dansindicateurs et confocale et la microscopie par fluorescence conventionnelle. Les augmentations induites par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été rapportés en tant que signaux intracellulaires nécessaires pour inflammatoires augmentations induites médiateur-en microvaisseaux perméabilité 6-15. Bien que certaines études antérieures ont montré des images de dispositifs microfluidiques DAF-2 DA chargés 16,17, la résolution et des données appropriées analyse n'a pas encore atteint 18 ans. À notre connaissance, cette étude démontre les premières mesures quantitatives de changement dynamique induite par l' agoniste en endothéliales [Ca 2+] i et la production de NO en utilisant microfluidique système basé.

Techniques de microfabrication ont la possibilité de fabriquer des microcanaux jusqu'à quelques microns et permettre le développement de modèles complexes pour imiter les géométries de microvascularisation in vivo. Ici, nous avons présenté un réseau de microcanaux typique avec trois niveaux de ramification. Cele réseau est fabriqué par la combinaison de la photolithographie, qui est réalisé dans une salle blanche de microfabrication et la lithographie molle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfluidique Fabrication de périphériques

  1. Photolithographie standard Fabrication d'un moule SU-8 50 Maître
    1. Nettoyer la tranche de silicium avant centrifugation. Rincez nue tranche de silicium de 2 pouces avec de l'acétone pendant 15 min suivi par l'alcool isopropylique (IPA) pour 15 min. Déshydrater la plaquette en la plaçant sur une plaque chauffante à 150 ° C pendant 1 heure. Après séchage, refroidir la plaquette à température ambiante.
    2. Spin-coat la plaquette de silicium avec SU-8. Ajouter 2 ml SU-8 sur la plaquette. Rampe de la plaquette à 500 tours par minute à une accélération / s 100 rpm pendant 10 s, suivie de 1000 tours par minute à une accélération / s 300 rpm pendant 30 s. (Voir la vidéo supplémentaire 1)
    3. Pré-cuire la galette sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10 min, cuire ensuite douce à 95 ° C pendant 30 min.
    4. Utiliser l'exposition aux UV pour transformer le modèle conçu à partir d'un masque de film à la photoréserve enduite par centrifugation. Imprimez le motif sur un film transparent mince comme un masque de film. Placer le masque de film sur la partie supérieure de laenduction centrifuge résine photosensible et exposer aux UV avec une dose de 300 mJ / cm2. (Voir la vidéo supplémentaire 2)
      Remarque: Dans ce protocole, le modèle de réseau de microcanaux (159 um canaux mères larges ramifications en quatre 100 um canaux fille large) est conçu avec le logiciel de CAO. Le motif sur le film montre comme un champ libre et le reste du film est couvert par l'encre noire. Parce que SU-8 est une résine photosensible négative, la partie de la résine photosensible qui est exposée aux rayons UV sera réticulé et deviennent insolubles dans le solvant au cours du développement de moisissures (étape 1.1.6). Après le développement, cette portion insoluble va reproduire le motif de réseau conçu et servir en tant que moule maître.
    5. Post-cuisson de la tranche exposée sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min.
    6. Développer le moule maître. Utilisez SU-8 développeur comme solvant pour enlever la résine photosensible de non-réticulé. Immerger la plaquette dans SU-8 développeur pendant 3 minutes et rincer avec de l'IPApendant 1 min.
    7. Répétez ce cycle de développement 2-3 fois jusqu'à ce qu'il n'y a pas de formation de bande blanche (résidu de résine photosensible non durcie) après le rinçage IPA. Séchez délicatement la tranche avec de l'azote gazeux et d'examiner les petits éléments du modèle sous un microscope. Répéter les cycles de développement supplémentaires si nécessaire.
    8. Dur cuire la galette sur une plaque chaude à 150 ° C pendant 15 min.
  2. Lithography souple
    1. Manuellement mélanger les deux parties (base et durcisseur) de polydiméthylsiloxane (PDMS) élastomère à un poids. rapport de 10: 1.
    2. De gaz, le mélange PDMS avec un dessiccateur relié à un vide de la maison pendant 15 min. Cast la solution PDMS sur le moule maître de résine photosensible. L'épaisseur du PDMS doit être supérieure à 3 mm pour fournir un maintien stable de la tubulure d'entrée / sortie. De gaz PDMS à nouveau pendant 15 minutes, et éliminer les bulles d'air restantes avec de l'azote gazeux si nécessaire. Cure PDMS casted dans un four à 65 ° C pendant 3 heures.
    3. Nettoyer la surface dela lamelle de verre avec un ruban adhésif et un nettoyeur à plasma (de traitement par plasma 30 sec). PDMS Spin-manteau un-durci (0,5 ml) sur la lamelle de verre par rampe à 4000 tours par minute à un taux d'accélération / sec 500 rpm pendant 30 secondes. Traiter le PDMS lamelle couvre-objet revêtu par centrifugation dans un four à 65 ° C pendant au moins 30 min.
    4. Couper et libérer les PDMS durcis du moule maître. Ensuite, créer une entrée et une sortie avec un 1 mm perforatrice de diamètre à l'extrémité distale des canaux mères.
    5. Bond du dispositif à la lamelle de verre PDMS spin-enduit. Oxyder les surfaces des PDMS et Coverslip avec un nettoyeur à plasma pendant 1 min. Après le traitement par plasma d'oxygène, déposer une goutte d'eau déminéralisée (DI eau) à la surface de collage, et de placer les deux parties ensemble. Cuire au four le dispositif dans un four à 65 ° C pendant 30 min pour obtenir une liaison permanente.

Vidéo supplémentaire 1 Supplemental Vidéo 1 (clic pour télécharger).

Supplemental Vidéo 2
Supplemental Vidéo 2 (clic pour télécharger).

2. Ensemencement des cellules endothéliales et de la culture

  1. Stérilisation de périphériques et fibronectine Coating
    1. Préserver la propriété hydrophobe de la surface PDMS autour de l'entrée / sortie de l'oxydation. Couvrez la surface PDMS autour de l'entrée et de sortie avec de petites bandes de ruban adhésif pour empêcher l'oxydation. Cette procédure permet d'éviter la propagation de l'eau déminéralisée sur toute la surface supérieure du dispositif pendant l'étape de remplissage (2.1.3).
    2. Traiter le dispositif PDMS avec un plasma d'oxygène for 5 min pour modifier la surface hydrophile, ce qui facilite l'écoulement de fluide à travers le canal et empêcher le piégeage de la bulle dans la procédure de remplissage (2.1.3).
    3. Utiliser une seringue avec une aiguille fixée ou une pipette pour remplir le dispositif avec de l'eau DI de l'entrée. Continuer le remplissage jusqu'à ce qu'une goutte d'eau déminéralisée (30 à 50 pi) à la sortie accumulée. Examiner l'appareil sous un microscope pour vérifier s'il y a des bulles emprisonnées à l'intérieur du microcanal. Enlever la goutte d'eau excessive à l'entrée et à la sortie avec un mouchoir en papier.
    4. Stériliser le dispositif dans une boîte de Pétri avec UV pour un minimum de 3 heures dans une hotte de biosécurité laminaire. Pour éviter l'évaporation, couvrir l'entrée / sortie avec un mince morceau de PDMS, mettre un mouchoir en papier humide à l'intérieur du plat, et envelopper le plat avec Parafilm.
    5. Enduire le dispositif avec la fibronectine. Rincer le premier dispositif avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis enduire de 100 pg / ml de fibronectine pendant une nuit dans un réfrigérateur (4 ° C). Placez une gouttelette de solution à l'entrée, puis créer une pression négative à la sortie avec un vide de la maison, une seringue avec une aiguille ou une pipette.
    6. Remplir le dispositif avec un milieu de culture cellulaire. Rincer l'appareil avec du PBS manuellement 3 fois avant de charger les milieux de culture cellulaire. Réchauffez l'appareil dans un incubateur à 37 ° C.
  2. CEs Semis et Perfusion à long terme
    Remarque: La comparaison avec la culture statique conventionnelle 2D CE, le modèle de réseau in vitro avec des microvaisseaux perfusion continue a fait le milieu de culture cellulaire plus proche des conditions in vivo. Le vitro réseau de microvaisseaux en évidence dans ce protocole peut être maintenu jusqu'à deux semaines. La perfusion bien contrôlée en permanence reconstituer les éléments nutritifs, éliminer les déchets et éviter une confluence de la monocouche CE. Par conséquent, il peut être étendu à une études à long terme, imitant l'environnement cellulaire et hémodynamique sous Physiologica différentel et états pathologiques.
    1. Mélanger HUVEC primaires dans HUVEC milieux de culture (MCDB 131) avec 8% de dextran (de poids moléculaire 70.000). Le dextrane est utilisé pour augmenter la viscosité du milieu de chargement et d'obtenir un meilleur résultat de l'ensemencement des cellules. La densité cellulaire recommandée est d' environ 2-4 x 10 6 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules dans le dispositif. Placez une goutte 10-20 ul de cellules sur l'entrée. Introduire un léger flux soit par l'inclinaison du dispositif, ou une action capillaire à l'aide d'une pipette Pasteur en verre à la sortie. La clé pour une charge de cellule couronnée de succès consiste à contrôler la vitesse d'écoulement inférieure à 1 mm / s dans les petits canaux.
    3. Vérifiez l'ensemencement des cellules. Après l'ensemencement initial, incuber le dispositif pendant 15-20 min (atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C) avant de vérifier l'état de semis sous le microscope. Si nécessaire, effectuer le chargement de la cellule supplémentaire pour atteindre une densité cellulaire souhaitée.
    4. Rincer délicatement le dispositif avec un milieu de culture cellulaire (37° C) pour éliminer le dextran. Culture du dispositif en l'absence d'écoulement pour les 6 premières heures dans un incubateur (5% de CO 2 à 37 ° C).
    5. Mettre en place la connexion de tubes pour perfusion à long terme. Tape le dispositif dans une boîte de Pétri pour empêcher le mouvement. Créer des petits trous sur le couvercle de la boîte de Petri pour l'entrée et la tubulure de sortie des insertions. Raccorder le tuyau d'entrée à une seringue avec une aiguille pour la perfusion de la culture cellulaire de support. Connecter le tuyau de sortie à un collecteur de déchets.
      Remarque: Placez l'appareil et le collecteur de déchets dans un incubateur de culture cellulaire, tout en plaçant une pompe à perfusion en dehors de l'incubateur et le connecter avec le dispositif par la longue tubulure d'admission. Le taux de perfusion est déterminé par la conception expérimentale. Dans le présent dispositif, utiliser un débit de perfusion de 0,35 pi / min et une plage de contrainte de cisaillement entre 1-2 dyne / cm 2. Sous cette condition de perfusion, les HUVEC atteignent la confluence dans environ 3-4 jours.

3. Jemmunofluorescent coloration

  1. Fixer CEs dans le dispositif par perfusion de paraformaldehyde à 2% pendant 30 min à 4 ° C, puis 1 x PBS rinçage à température ambiante pendant 15 min et 1% de BSA blocage pendant 30 min. Utiliser un débit de perfusion qui est le même que celui utilisé pour la culture cellulaire.
  2. Perméabiliser CEs fixée pour la coloration d'anticorps avec 0,1% de Triton X-100. Perfuser l'appareil avec du Triton pour 5-7 min à l'étiquette VE-cadhérine, et 3 min à l'étiquette F-actine.
  3. Chargez les anticorps dans le dispositif. Perfuser l'appareil avec 1x PBS pendant 15 minutes pour se laver les solutions précédentes. Chargez manuellement l'anticorps primaire contre VE-cadhérine (anti-chèvre) dans le dispositif à la concentration de 2 pg / ml (le volume total est de 20-50 pi). Gardez l'appareil dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. Perfuser l'anticorps secondaire (âne anti-chèvre) par une pompe à seringue à la concentration de 7 ug / ml pendant 45 à 60 min.
  4. Étiquette CE F-actine avec phalloïdine. Perfuser l'appareil avec fo 1x PBSr 15 min avant de le charger manuellement phalloïdine (10 pg / ml) pendant 7 à 10 min.
  5. Étiquette noyaux CE (voir liste des matières).
  6. Rincer l'appareil avec PBS 1x et le maintenir à 4 ° C jusqu'à formation d'image.

4. Fluorescence Imaging de endothéliale [Ca 2+] i

  1. Perfuser le dispositif avec de l'albumine (10 mg / ml), la solution de -Ringer pendant 15 min à 37 ° C. Utiliser le même débit de perfusion comme celui utilisé pour la culture cellulaire. Les concentrations de tous les composants de la solution de l' albumine-Ringer sont décrites dans la liste des matières.
  2. Mettre en place le système confocal pour CE [Ca2 +] i imagerie avec Fluo-quatre heures. Utiliser un système microscopique confocale pour Ca l'imagerie. Utilisez un laser à argon (488 nm) pour l'excitation et fixer la bande d'émission comme 510-530 nm. Recueillir les images avec un objectif 25X (immersion dans l'eau, NA: 0,95) à 512 x 512 format de balayage. Z utiliser une étape de 2 pm et un intervalle de balayage pour chaque pile d'images de 20 sec.
  3. Perfuser l'appareil avec Fluo-4 AM (5 uM) pendant 40 min à 37 ° C, puis laver la lumière fluo-4 AM avec la solution de l'albumine-Ringer.
  4. Acquérir les images de microvaisseaux FLUO-4 chargé. Recueillir les images de base pendant 10 min. Perfuser le dispositif avec de l'ATP (10 uM) et enregistrer les changements d'intensité de fluorescence (FI) pendant 20 min.

5. Fluorescence Imaging de production d'oxyde nitrique

  1. Perfuser le dispositif avec la solution de l'albumine-Ringer pendant 15 min. Utiliser un débit de perfusion qui est le même que celui utilisé pour la culture cellulaire.
  2. Mettre en place le système d'imagerie de fluorescence pour mesurer la production d'oxyde nitrique ATP-induite. Utiliser un microscope équipé d'une caméra CCD numérique de 12 bits et un obturateur commandé par ordinateur pour la mesure de l'oxyde nitrique. Utiliser une lampe au xénon de 75 W comme source de lumière.
    Remarque: Sélectionner la longueur d'onde d'excitation et d'émission pour le DAF-2 DA par un filtre d'interférence (480/40 nm) et un miroir dichroïque(505 nm) avec une barrière de bande passante (535/50 nm). Utilisez un objectif 20X (NA: 0,75) pour recueillir les images. Pour réduire au minimum le photoblanchiment, placer un filtre de densité neutre (0,5 N) devant le filtre d'interférence et de limiter le temps d'exposition de 0,12 seconde.
  3. Chargez les cellules avec DAF-2 DA (5 uM). Perfuser l'appareil avec DAF-2 DA pour environ 35-40 min à 37 ° C. Notez la ligne de base DAF-2 intensité de fluorescence (FI DAF) après le chargement initial.
    Note: DAF-2 DA est continuellement présent dans le perfusat pendant toute l'expérience 7.
  4. Collecter DAF-2 images. Notez la ligne de base FI DAF pendant 5 min. Perfuser le dispositif avec de l'ATP (10 uM) et de recueillir les images pendant 30 minutes avec des intervalles de 1 min. Recueillir toutes les images à partir du même groupe de cellules dans le même plan focal.

Analyse 6. Données

  1. Sélectionnez manuellement la région d'intérêts (ROI) à partir des images recueillies au niveau de la cellule individuelle. ChaqueROI couvre la zone d'une cellule individuelle, qui peut être indiquée par le contour de la fluorescence.
  2. Soustraire fluorescence de fond et calculer la FI moyenne de chaque ROIs.
  3. Mesurer les changements ATP-induits dans CE [Ca2 +] i et la production de NO. Quantifier changements ATP-induits dans CE [Ca2 +] i en calculant les variations de Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, où FI 0 est la FI base moyenne pendant la perfusion d' albumine-Ringer avant d' ajouter ATP) moins la mesure Contexte. Quantifier NO taux de production en effectuant la première conversion différentielle de la FI DAF au fil du temps.
    Note: Le cours du temps de FI DAF représente une production de NO cumulatif avec le temps. Par conséquent, aucun taux de production est calculée sur la base du profil de FI DAF sous basale et stimulée ATP conditions. Les détails de l' analyse des données et les procédures expérimentales ont été décrites dans une publication antérieure 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cette section présente quelques-uns des résultats obtenus avec le réseau de microvaisseaux culture développée avec ce protocole. Le motif de micro - canaux est un réseau de dérivation à trois niveaux (figure 1A). Dans cette conception, un 159 m de large branches en deux 126 um canaux larges, et les branches de canal mère à nouveau en quatre 100 um canaux filles larges. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour évaluer les distributions de contraintes de cisaillement dans le cadre du débit de 0,35 ul / min (figure 1B), ce qui indique trois différents niveaux de contrainte de cisaillement au sein de ce réseau de microcanaux. L'écoulement laminaire dans les microcanaux est prévu pour être hydrodynamiquement stable sans la présence de flux perturbé ou secondaire. Après un moule maître SU-8 a été fabriqué avec un procédé de photolithographie standard (figure 1C), un dispositif de PDMS a été fabriqué par lithographie douce pour reproduire le nec microcanauxdesign twork dans un air échafaudage perméable transparent (figure 1D - E). CE après l' ensemencement (figure 1F - G) et 3-4 jours de perfusion continue, CEs atteint la confluence et couvert avec succès les surfaces intérieures des microcanaux.

CE F-actine et de noyaux ont été marquées par fluorescence au sein du réseau et illustrés par des images confocales. Sous la contrainte de cisaillement de 1,0 dyne / cm 2, environ 30% de la HUVEC allongée le long de la direction d'écoulement avec une augmentation des fibres de stress centrales, alors que le reste de 70% a maintenu son modèle de pavé avec dominé périphérique F-actine 5. Le changement de forme cellulaire induite par cisaillement apparaît moins important que celui généralement observé dans des cultures de cellules 2D statique. En fait , dans des conditions in vivo, la COCOM ont des formes différentes de cellules dans différents types de navires, mais pas facilement changer la forme des cellules en réponse à la cha de débitnges. D' autres études sont nécessaires pour déterminer si cette différence était les résultats de la géométrie du canal et de l' environnement de perfusion qui sont plus proches des conditions in vivo.

Nous avons également mesuré avec succès les changements ATP-induits dans CE [Ca2 +] i et la production de NO (figures 4 et 5). Augmente l' ATP induits transitoires dans CE [Ca2 +] i et la production de NO. La moyenne FI pic fluo-4 était de 187 ± 22% de la ligne de base, qui a eu lieu à 35 ± 10 secondes après le début de l' ATP perfusion. Le taux NO de production a été augmentée à partir d'un niveau de base de 0,15 ± 0,05 UA par minute à 1,18 ± 0,37 UA par minute dans les cinq premières minutes d'exposition de l'ATP. Tous les résultats ont été rapportés comme moyenne ± erreur standard (SE). Ils sont comparables aux résultats obtenus à partir des veinules intacts perfusés individuellement 6,9,14,19.


Figure 1: microfluidique Fabrication de périphériques et CE chargement (A) La vue schématique du réseau de microcanaux.. L'angle des microcanaux largeur et bifurcation sont indiquées à chaque niveau de ramification. (B) La simulation numérique de la distribution de la contrainte de cisaillement. Le débit est de 0,35 pi / min. La hauteur du microcanal après le développement est de 80 um. Ces deux chiffres ont été modifiés depuis la publication précédente avec des détails supplémentaires 5. (C) Le développement du moule maître. Le moule maître du réseau de microcanaux est fabriqué avec SU-8 sur la plaquette de silicium. (D) Le processus de lithographie douce. PDMS mélange est coulé sur le moule maître et durci dans un four. (E) Collage PDMS canal sur le substrat. Le substrat utilisé pour cet appareil est un spi de lamellen revêtu d'une mince couche de PDMS. L'entrée et la sortie sont créés avec un trou-perforateur. (F et G) CE chargement. Environ 10 pi de solution de cellule est placée à l'entrée. Un léger flux est ensuite induite en plaçant une pipette Pasteur à la sortie via l' écoulement capillaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Les images confocales de CE F-actine dans le réseau de microcanaux de culture (A) Une vue schématique de la conception du réseau.. Les régions sélectionnées indiquées dans B - D sont indiqués dans le graphique. (B - D) images confocale de CE F-actine (rouge) et les noyaux (bleu) du réseau de microvaisseaux in vitro B 1. C 1 et D 1 sont les images projetées à partir de la moitié supérieure des empilements d'image à microcanaux, et B 2, C 2 et D 2 sont les projections d'images de la moitié inférieure des piles d'images. E. La vue en coupe transversale indiquée comme 1-1 ', 2-2' et 3-3 'dans B 1 - D 1, Barre d' échelle = 100 um. Ces images sont adaptées de publication précédente 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Les comparaisons de VE-cadhérine la distribution dans le réseau de microvaisseaux cultivées avec statiquement culture monocouche CE et intact mésentérique de rat veinule (. B - D. (B - D) , VE-cadhérine (vert) et des noyaux cellulaires (bleu) , la coloration des in vitro microvaisseaux réseau D 1 et D 2 sont les parties supérieure et inférieure des images projetées collectées à partir de la même région de la bifurcation, respectivement.. (E) VE-cadhérine coloration des statiquement cultivées CEs. (F) VE-cadhérine coloration de veinule de rat intact perfusé individuellement. Ce chiffre publié précédemment 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: ATP induite par l' augmentation des CE [Ca 2+ p>] i. Des expériences ont été réalisées à partir de 4 appareils et 7 à 12 ROIs (individuel EC) par appareil ont été sélectionnés pour l' analyse des données. (A) Le cours du temps de l' ATP (10 uM) induite par les changements dans la CE [Ca2 +] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) d'une expérience représentative. (B) Les images de l'expérience représentative ( les données sont représentées en A). Ce chiffre est déjà publié 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: ATP induite par la production de NO Les expériences ont été menées dans 3 appareils et 11 à 12 ROIs (individuel EC) par appareil ont été sélectionnés pour l' analyse des données.. (A DAF ± SE, gauche axe Y) en CEs dans des conditions basales et après l' exposition à l' ATP. Le NO taux de production (df / dt, ligne pointillée), est dérivée de la première conversion différentielle de la FI DAF accumulée (axe Y à droite). (B) images représentatives d'une expérience. L'IF DAF augmente encore la suite d' un donneur de NO, le nitroprussiate de sodium (SNP), a été ajouté à la solution de perfusion, ce qui indique une quantité suffisante du DAF-2 intracellulaire à réagir avec le NO. Ce chiffre est déjà publié 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour le développement du réseau de microvaisseaux culture, la caractérisation des jonctions CE et cytosquelette distribution F-actine, et les mesures quantitatives des CE [Ca2 +] i et la production de NO en utilisant un dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique perfusé fournit un modèle in vitro qui permet une simulation proche des in vivo géométries de microvasculaires et des conditions d'écoulement de cisaillement. Étant donné que le réseau de microvaisseaux de culture peut être formé par CEs humain primaire, cette approche peut servir comme un outil utile pour étudier comment pathologiquement modifiés composants sanguins à partir d'échantillons de patients affectent CEs humains par perfusion directe d'échantillons de sang des patients pour les microvaisseaux de culture et fournir un aperçu clinique problèmes. Les CEs humains microvaisseaux développés peuvent également être utilisés pour le criblage de médicaments pour éviter les écarts potentiels dans les réponses de la drogue entre les tissus humains et animaux.

ve_content "> Le substrat des dispositifs microfluidiques indiqués dans ce protocole est un verre lamelle (150-180 um) spin-revêtu d'une fine couche de PDMS. Cette mince couche de PDMS est essentielle pour une grande résolution et de tissus en direct en temps réel imagerie, parce que les grands objectifs d'ouverture numérique a généralement courte distance de travail. l'écoulement laminaire dans le microcanal (plage submillimétrique) a un très faible nombre de Reynolds, et la différence de pression est linéairement liée à l'écoulement, ainsi la distribution de la contrainte de cisaillement dépend uniquement la géométrie du canal. par conséquent, il peut être bien contrôlée par une grande précision la pompe de perfusion 20. Dans notre étude, la contrainte de cisaillement appliquée au réseau de microvaisseaux cultivé des HUVEC était comprise entre 1 et 10 dynes / cm 2, ce qui est à l'intérieur de la gamme de contrainte de cisaillement mesurée dans le système veineux 21,22. les systèmes macro-fluidiques tels que la chambre d'écoulement parallèle manque modèles d'écoulement complexes. dans les grandes chambres d'écoulement d'échelle (gamme mm-cm) CEs ne sont généralement cultivés dans la surface inférieure (2D monocouche), dépourvue des similarités géométriques aux microvaisseaux in vivo. Lorsque la largeur de la chambre d'écoulement est supérieure à 2 mm, l'écoulement homogène est confiné dans une région qui est en général de quelques millimètres de distance de l'orifice de sortie / entrée, et quelques centaines de microns à l' extérieur de la paroi latérale 23. Lorsque la largeur de la chambre est augmentée à la gamme de centimètres, le débit se différencier en divers lignes de courant et les vitesses d'écoulement va changer dans l' ensemble de la zone 24. En outre, la chambre d'écoulement à plus grande échelle consomme au moins 100 fois plus perfusat pour obtenir la même contrainte de cisaillement que celle de microcanaux. La distribution de la contrainte de cisaillement au sein du réseau de microcanaux peut être simulée à l'aide d'un outil de modélisation numérique et les équations incompressibles stationnaires de Navier-Stokes peut être résolu par la plupart des logiciels d'éléments finis.

Le dispositif microfluidique peut être réalisé avec une tête du comprocessus masque de microfabrication e. Le succès du développement de microvaisseaux culture, cependant, exige des attentions particulières aux détails. Après le chargement de la solution dans les microcanaux, chaque appareil doit être vérifié pour la bulle piégeage sous le microscope avant le semis CE. Si une bulle se produit, il est toujours possible de le forcer à cette étape en appliquant une pression hydraulique à l'entrée d'une sortie fermée, comme le PDMS est un matériau perméable à l'air. Pour maintenir un taux de perfusion souhaité, ajustement serré sans une fuite est nécessaire pour toutes les connexions aiguille / tubes. Le trou-perforateur appariés et la taille du tube sont essentielles pour obtenir un ajustement serré. Pour assurer une livraison précise du débit, la seringue sur la pompe à perfusion et le dispositif doit être placé au même niveau. Pour changer le perfusat, le tube inséré devrait être légèrement déconnecté de l'appareil pour éviter tout étirement. Pour augmenter la contrainte de cisaillement, étape augmente (par exemple 10 étapes d'augmentation en 18 heures) sont recomded pour éviter un changement de flux soudain causé épluchage CE.

Des études antérieures effectuées sur des microvaisseaux intactes perfusés individuellement ont indiqué que l' augmentation induite par un agoniste de la CE [Ca2 +] i, et la synthase endothéliale de l' oxyde nitrique subséquente (eNOS) l' activation et la production de NO sont de signalisation nécessaires à une perméabilité accrue microvasculaire dans des conditions inflammatoires 6,7 , 9-13,25. Dans ce protocole, on sélectionne l' ATP comme agoniste représentatif, car il est généralement libéré par les globules rouges, les plaquettes agrégées et des tissus lésés ou dans des conditions inflammatoires in vivo. Un indicateur de calcium de fluorescence, Fluo-4 AM, a été utilisé pour mesurer les changements dans l' endothélium [Ca 2+] i après l' exposition à l' ATP. La CE [Ca2 +] i réponses dans les microvaisseaux cultivées sont similaires à ceux trouvés dans les microvaisseaux intactes 7,9. Mesure de la production communautaire NO a été techniquement difficile pour les biologistes.À ce jour, il n'y a pas d'indicateur fluorescent qui permet la détection de changements dynamiques de la concentration de NO d'une manière similaire aux indicateurs de calcium. DAF-2 DA a été largement utilisé pour évaluer la production de NO. Cependant, l'utilisation correcte, l'interprétation des données, et l'analyse des données doivent attirer l'attention des utilisateurs. Etant donné que la transformation chimique du DAF-2-2T à DAF en présence de NO est irréversible (conversion unidirectionnelle) 26, le DAF profile d'intensité de fluorescence détectée ne représente pas les variations de concentration de NO. Au lieu de cela, il indique la production DAF-2T accumulé avec le temps. Sur la base de cette DAF-2 fluorescence (FI DAF) courbe, le NO taux de production (df / dt) peut être obtenu par la première conversion différentielle de la FI DAF 7,11 cumulés. A savoir, la pente de la courbe FI indique le taux de production de NO et de la phase de plateau correspond à l'absence augmente encore la production de NO. Après la conversion, les données générées à partir de ce protocole presented tant basale NO taux de production et les variations de la production de NO en réponse à l'ATP avec une résolution spatiale et temporelle au niveau individuel CE au sein du réseau de microvaisseaux.

À l' heure actuelle PDMS a été largement utilisé pour des applications microfluidiques, car il est un élastomère souple perméable optiquement transparente, non toxique et 27-30 gaz. Cependant, depuis PDMS est pas perméable à l'eau, nous ne pouvions pas mesurer directement la perméabilité de monocouche CE. Pour contourner cette limitation, certaines applications ont modifié les structures de paroi de canal tels que l' intégration d' une membrane perméable dans le canal 31, ou la création d' une perméables "ouvertures de fenêtre" avec des micro-piliers ou des micro-trous 32,33, tandis que d' autres se sont concentrés sur la modification des matériaux de périphériques tels que l' utilisation des dispositifs d'hydrogel ou / dispositifs hybrides PDMS d'hydrogel 17,34-36. Les inconvénients de ces dispositifs sont leur nature vulnérable à la déshydratation et leur relativement faible mpropriétés écanique de se tenir le stress ou la pression. Le développement futur d'un matériau perméable à la résistance mécanique permettra d'améliorer encore le dispositif et son potentiel pour des applications biologiques plus larges.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ont aucun conflit d'intérêts ou des conflits d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL56237, Institut national du diabète et de l'appareil digestif et maladies rénales Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 et EPS-1003907).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Sigma-Aldrich A2383
Acetone Fisher Scientific A929
Biopsy punch Miltex 33-31 AA
Bovine Albumin MP Biomedicals 810014
Bovine Brain Extract (BBE) Lonza CC-4098
Cover-slip Fisher Scientific 12-542C
DAF-2 DA Calbiochem 251505
Dextran Sigma-Aldrich 31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody Life technologies A-11055
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-250
DRAQ5 (nuclei staining)  Cell Signaling Technology 4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) Sigma-Aldrich E2759-15MG
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Fibronectin Gibco PHE0023
Fluo-4 AM Life technologies F-14201
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-078
Glass coverslip Fisher Scientific 12-548B
Glass Pasteur pippette VWR 14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3393-10KU
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza CC-2517
Isopropyl alcohol (IPA) VWR 89125
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM) Fisher Scientific S671-3
KCl (4.6 mM) Fisher Scientific P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) Fisher Scientific C79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) Fisher Scientific M63-500
Glucose (5.5 mM) Fisher Scientific BP350-1
NaHCO3 (5.0 mM) Fisher Scientific S233-500
Hepes Salt (9.1 mM) Research Organics 6007H
Hepes Acid (10.9 mM) Research Organics 6003H
MCDB 131 Culture Medium Life technologies 10372-019
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phalloidin (F-actin staining) Sigma-Aldrich P1951
Phosphate Buffered Saline  Life technologies 14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation Sylgard 184
Scalpel Exel Int 29552
Scotch tape 3M 34-8711-3070-3
Silicon wafer VWR 14672
SU-8 photoresist MicroChem SU-8 2050 Y111072
SU-8 developer MicroChem Y020100
tissue culture flasks Sigma-Aldrich Z707503-100EA
Triton X-100 Chemical Book T6878
Trypsin Neutralizer solution Gibco R-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE) Gibco R-001-100
Tubing Cole-Parmer PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherin Santa Cruz Biotechnology SC-6458
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biosafety Laminar hood NuAire NU-425 Class II, Type A2
CCD camera Hamamatsu ORCA
Confocal microscope Leica TCS SL
Desiccator Bel-Art F42022
Hotplate Wenesco HP-1212
Incubator Forma Scientific 3110
Isotemp oven Barnstead 3608-5
Lithography bench Karl Suss MA6 Contact Lithography
Optical microscope Nikon L200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD camera Sutter Instrument Lambda 10-2
Plasma cleaner PVA TePla/Harrick plasma M4L/PDC-32G
Spin coater Brewer Science Cee 200X
Syringe pump system Harvard Apparatus 703005
Name of Software Company Catalog Number Comments/Description
CAD software Autodesk AutoCAD 2015
CFD simulation software COMSOL COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production  Universal Imaging Metafluor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Tags

Biologie cellulaire numéro 111 microvaisseaux cellules endothéliales le calcium intracellulaire l'oxyde nitrique VE-cadhérine F-actine microfluidique
Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P.… More

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P. Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production. J. Vis. Exp. (111), e54014, doi:10.3791/54014 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter