Introduction
布氏锥虫是原生动物寄生虫引起牛非洲人类trypanosomasis和那加那T。布氏是蛋白质功能的分析的理想生物体由于高品质的基因组，众多蛋白质组学和转录数据集和发达分子工具1-3的组合。蛋白质组学和测序的进步导致了突出潜在的有趣的基因4-6大型数据集;然而，许多基因都与他们现有的数据库相关联的最少信息。因此，有需要一种高通量方法，以帮助蛋白质功能表征。
一个标签蛋白的表达能给见解的多样性成蛋白质的功能。例如，标记有荧光蛋白或表位的蛋白质可以通过荧光显微镜，其中给出了关于其中PROT信息进行本地化EIN可能会发挥其生物效应。另外，贴上了TAP 7的蛋白质，HaloTag 8或他的标签可以用于生化分析及其合作伙伴的互动鉴定纯化。
我们最近开发出一种强大的标注方法为T.布氏 9。这在过去很长的引物PCR生成转染DNA，并允许数十种蛋白质并行的标记 - 一个重大改进现有的协议。现在，我们已经通过了一个数量级提高该协议在procyclic形式的可扩展性。这里，我们提出我们的方法，其中，我们执行PCR和转染到96-孔板，以恢复和选择在24孔板中发生。数百蛋白质现在可以在并行进行标记该方法提供用于标记整个锥虫基因组中的具有成本效益的，可行的方法。
Protocol
1，96孔龙引物PCR
- 预冷冻96孔PCR冷却器在-80℃冷冻机中。
- 在一个10毫升管，准备预混一个：2.100微升的DDH 2 O，105微升PCR级DMSO，105微升10毫米的dNTP，105微升PPOT模板（25毫微克/微升）9，每盘2415微升总体积。
- 等分试样23微升到96孔PCR板的每个孔中。
- 加入2微升100μM汇集引到每个加载以及使用P20 12通道多道移液器的。用膜，代替板密封在预冷的PCR冷却器并允许冻结在-80℃至少20分钟。
- 在10ml的管中，制备主混合物A：2048微升DDH 2 O的，525微升10×缓冲液，52.5每板2626微升的总体积微升聚合酶。
- 从-80℃冰箱中取出板和PCR凉爽。
- 随着板块仍然在PCR冷却器，在冻结的顶部加入25微升主混合物BN主控一个混合的50微升反应总体积。这是时间关键的，并且应完成之前混合物A可以解冻。封板与薄膜。
- 设定热循环如下：94℃10分钟，然后94℃30个循环持续15秒，65℃，30秒，72℃2分钟，然后72℃7分钟的最后延伸期间。
- 加载PCR板的块已到达94℃后。
2. 96-龙引物的PCR验证
- 投大1％（重量/体积）在Tris醋酸EDTA（TAE）琼脂糖凝胶用4×28孔的梳子运行缓冲液，得到一种凝胶具有4行孔中。对准一12信道多道移液器的尖端的梳子的交替齿。仔细淹没在TAE凝胶电泳缓冲液的车道加载后。
- 负载1 kb的DNA梯到1 次和28 次良好的每一行。
- 使用P20 12通道多道移液器，转移2微升PCR产物迪尔ectly到凝胶（ 图1A）的各泳道。为此迅速减少污染扩增子的可能性。
- 装载从PCR板的行A中的PCR产物到凝胶的第1行的奇数泳道（A1 - 泳道3，A 2 - 泳道5 ...... A11 - 车道23，A12 - 泳道25）和加载PCR产物从PCR板的列B到凝胶的1行的偶数道（B1 -泳道4，A 2 -泳道6 ...... B11 -车道24，B12 -泳道26）。
- 如上所述，与C行到奇数通道及D行到偶数泳道加载来自使用相同的图案的PCR板的行C和D的PCR产物。直到PCR板的每个孔中装载到凝胶继续这个装载模式。 DNA的加样缓冲液不需要加载此凝胶。
- 将凝胶进入运行罐和TAE加满油箱运行缓冲液直至凝胶被淹没。在100V进行30分钟运行，并可视化使用UV透照。参见图1B的例子凝胶。
注意：PCR产物可被储存在-20℃下几个星期转染前
3. 96孔转
- 使用T.布氏 procyclic形式的细胞系SMOXP9 10此过程和生长在含有10％FCS 10的SDM-79的介质。
- 使用1×10 7个细胞每转上的C末端标记时（总共1.1×10 9个细胞）的蛋白质的N末端 和每转染2×10 7个细胞标记时（总共2.2×10 9个细胞）的蛋白质。保持在对数中期（1.2×10 6 -1×10 7细胞/ ml）的细胞在转染前几天和收获转染的细胞以5-8×10 6细胞/ ml的密度。
- 允许冷冻PCR产物进行转染，在室温下解冻。
- 使用血红素细胞计数ocytometer或自动细胞计数。
- 在800 XG 10分钟多50ml试管颗粒所需数量的细胞。
- 离心后弃上清，重悬在10毫升的细胞改性cytomix（0.8毫EGTA，24毫米氯化钾，0.15毫氯化钙 ，10mM磷酸钾缓冲液pH7.6的，25毫米的HEPES-KOH pH7.6的，2.6毫MgCl 2的， 0.5％（重量/体积）葡萄糖，每管100微克/毫升BSA，1mM的次黄嘌呤，144毫蔗糖）。传输所有细胞溶液到单个管中并在800 xg离心再次旋转10分钟。
- 离心后，弃去上清，重悬23毫升改性cytomix的细胞的5×10 7个细胞/ ml的终浓度。
- 而细胞被纺纱，加入1 ml的SDM-79的介质，以4×24孔组织培养板的各孔中。标签板AD，绘制出周围环以及A1在永久性标记每块板，以帮助板方向。
- 板处理程序连接到电穿孔。在electropora器单元设置的电压为1500伏，脉冲长度为100微秒和脉冲12的数目和脉冲的时间间隔为500毫秒。上盘处理，设定脉冲计数为1。这确保了电穿孔将应用于单个脉冲到各个电穿孔板的12列。
- 使用P200的12信道多道移液器，从PCR板转移PCR反应，以96孔一次性电穿孔板，4毫米间隙。
- 当细胞已被纺丝并重新悬浮于5×10 7个细胞/ ml（步骤3.7）的最终浓度，转移到试剂容器。吸移管200微升的细胞溶液进入使用P200的12信道多道移液器电穿孔板的各孔中，通过移液混合用的PCR产物。
- 采用组织从板块以避免短路的顶部移除任何液滴。
- 在板包装提供的密封膜适用于电板，POS机的顶部itioning它以便留下在每一列的顶部和底部露出的电极上的孔。避免覆盖用于指导电影提出的问题。
- 加载电板进入平板处理器，并盖上盖子。按电穿孔单位“脉冲”。
- 电穿孔后，迅速从96孔电穿孔板的4×24孔组织培养板转移的细胞。为了转移细胞中，使用P200 12通道多道移液器与所有其他尖端缺失，使得剩余的6个技巧排队与24孔培养板的6行。转移在96孔电穿孔板中的电穿孔细胞在预先定义的模式的24孔组织培养板中（ 图2A）。
- 准备P200枪头 - 每个96孔转染准备96提示2盒拆下隔列。
- 传递孔A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11的96孔电穿孔板板24孔培养板的排A，B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11成排B，C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11到C行和D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11进行D.每组6个孔从96孔板的24孔平板的转移后，在96孔板的孔中，然后用培养基洗涤从相应的孔中的24-孔板和洗涤，然后转移回至孔在24孔板中。
- 传递孔的E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11上的96孔电穿孔板24孔盘B行A，F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11成列B，G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11成在96 C行和H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11到行D.从96孔板每组6个孔的转移到24孔板后，将孔-Well板然后用培养基洗涤从相应的孔在24孔板中，然后在洗涤被传回至孔在24孔板中。
- 转让井A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12的96孔电穿孔板24孔板C列A，B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12成排B，C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12到C行和D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12成排D.从96每组6口井的转移后-Well板至24孔板，在96孔板的孔中，然后用培养基洗涤从相应的孔在24孔板中，然后在洗涤被传回至孔在24孔板中。
- 转让井E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12的96孔电穿孔板24孔板d行A，F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12到B行，G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12的进行C和H 2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12到行D.从96孔板每组6个孔的转移到24孔板后，在96孔-Well板然后用培养基洗涤从相应的孔在24孔板中，然后在洗涤被传回至孔在24孔板中。
- 使用倒置显微镜，研究1井从每列检查细胞。会有活的和死的细胞用的混合物大量的细胞碎片。活细胞可以从死细胞区分开来，因为他们将在相差显微镜明亮，会动。
- 放置在一个干净的，塑料盒24孔板与形成紧密密封的盖。把盒子在28℃培养箱。
- 6-8之间小时后，加入1 ml SDM-79的含2倍选择性抗生素，每孔10％FCS。根据我们的经验，其中该基因的标签上的N末端细胞系是对较高浓度选择药物的抗性。因此，在使用杀稻瘟素作为一个例子，标记上的N末端要求20微克的终浓度/ ml的杀稻瘟素和标记在C末端需要10微克/ ml的杀稻瘟素的最终浓度。
注：转染后的转基因细胞系将成为可见的9-10天。 - 在新鲜的药物和媒体至少两次分析前通道。 图2B示出从一个典型的96孔transfe结果ction上的N末端标记96个不同的蛋白质。评估每孔用相差显微镜，以确定它是否包含健康，药物抗性细胞。健康以及主要包含（<95％）高活性的同相合同显微镜明亮细胞。通过荧光显微镜或免疫印迹随后的分析是必需的，以确定该蛋白已成功标记。
Representative Results
在这个代表转染的引物使用TagIt perl脚本9设计和商业合成。在96孔PCR进行和验证所描述（ 图1A）;在这个例子中，95/96的PCR成功（ 图1B）。在我们的经验，重复或者与原始引物或重新合成的引物失败的反应不会导致成功的PCR。
扩增子被转移到96孔电穿孔板电穿孔（ 图2A），然后转移到用于恢复和选择的24孔培养板中。后有足够的时间以允许发生的选择，各孔打进之前进一步分析存活。在这个例子中，九十六分之八十八井（92％）为15天之后选择阳性。
图2：96孔电穿孔和选择 （A）模式的电穿孔细胞从96孔电开发平台转移。E要24孔培养板。 （B）示意图，显示在后24孔板选择15天一个典型的活/死得分。绿色代表着成功转染，灰色代表也只有死细胞。在这个例子中，井九十六分之八十八（92％）含有成功转染寄生虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
Discussion
在蛋白质组学和转录方法在过去的5 - 10年的灵敏度显着改善提供了数以千计的基因及其产物的有价值的数据。然而，这些工具来解决这些蛋白质的功能没有跟上。
标记的蛋白质有利于无数次的实验，以确定其功能。例如，蛋白质可以在各种不同的颜色，以促进定位和共定位研究来融合于荧光蛋白。标签电子显微镜，如APEX2或miniSOG 11,12开发，使标签蛋白的超微结构定位。标签为生物化学，例如在TAP标记，并ProtC-TEV-PROTA（PTP）标记7,13允许与蛋白质的结合伙伴的身份或体外生物化学测定相关联配合物的纯化。
那些对protoc的成功至关重要的具体步骤醇有：二甲基亚砜掺入PCR主混合物1之前，在加入主混合物2中，在主混合物2中使用的商业聚合酶和cytomix电穿孔缓冲液的修饰的冻结PCR主要混合液1。在我们的经验，这是必要的，以便达到阳性孔的相似的比例使用细胞的双数为C末端标记的转染，作为N末端标记的转染。因此，如所描述，应执行的所有步骤。
这种技术只可能转染虫procyclic形式锥虫时获得成功。血液形式具有较低的转染效率14，而且他们很可能是由于这是无关的选择药物的密度依赖毒性选择过程中死亡。因此，我们以前的协议代表了血液形式锥虫9标记当前最先进的技术。它也可能是反式染效率会变化取决于特定的锥虫分离物。其他菌株可能需要额外的优化 - 这个协议使用927 SMOX procyclic形式进行了优化。可能增加成功的概率的措施包括：增加PCR扩增子的量，增加包括在转染细胞的数目。
我们提出了数百蛋白质可以并行标记的方法。这将有利于本地化和互动的大规模研究，补充现有大型数据集，并提供宝贵的信息社会。底漆模板可根据要求和质粒模板列表可以从：http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
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