Introduction
Trypanosoma brucei er en protozo parasit, der forårsager human afrikansk trypanosomasis og nagana hos kvæg. T. brucei er et ideelt organisme til analyse af protein funktion på grund af kombinationen af en høj kvalitet genom, talrige proteomics og transcriptomics datasæt og veludviklede molekylære værktøjer 1-3. Fremskridt i proteomics og sekventering har resulteret i store datasæt, der fremhæver potentielt interessante gener 4-6; dog mange gener har minimal oplysninger i forbindelse med dem i de eksisterende databaser. Der er derfor et behov for en high-throughput metode til at hjælpe protein funktionel karakterisering.
Ekspression af et kodet protein kan give en flerhed af indsigt i et proteins funktion. For eksempel kan et protein mærket med et fluorescerende protein eller epitop være lokaliseret ved fluorescens mikroskopi, som giver oplysninger om, hvor protEin kan udøve dets biologiske virkning. Alternativt et protein mærket med en TAP 7, HaloTag 8 eller His-tag kan oprenses til biokemiske assays og identifikation af dets samspil partnere.
Vi har for nylig udviklet en robust tagging metode til T. brucei 9. Dette bruges lange primer PCR til at generere DNA til transfektion og tillod tagging af snesevis af proteiner i parallel - en væsentlig forbedring af eksisterende protokoller. Vi har nu forbedret skalerbarhed af denne protokol i procykliske former af en størrelsesorden. Her præsenteres vores metode, hvor vi udfører PCR og transfektion i 96-brønds plader, med genvinding og udvælgelse forekommer i 24-brønds plader. Hundredvis af proteiner nu kan mærkes parallelt denne fremgangsmåde tilvejebringer en omkostningseffektiv og gennemførlig metode til mærkning af hele trypanosominfektion genomet.
Protocol
1. 96-brønds Long Primer PCR
- Pre-freeze 96-brønds PCR køligere i -80 ° C fryser.
- I et 10 ml rør, forberede Master Mix A: 2.100 pi Hedeselskabet 2 O, 105 pi PCR-kvalitet DMSO, 105 pi 10 mM dNTP'er, 105 pi pPOT skabelon (25 ng / pl) 9, til et samlet volumen på 2,415 pi per plade .
- Aliquot 23 pi i hver brønd i en 96-brønds PCR-plade.
- Tilsæt 2 pi 100 pM poolede primere til hver indlæst brønd med en P20 12 kanals multikanalpipette. Seal med film, sted pladen på den præ-kølet PCR køler og lad det fryse i mindst 20 min ved -80 ° C.
- I et 10 ml rør, forberede Master Mix B: 2.048 pi Hedeselskabet 2 O, 525 pi 10x buffer, 52,5 pi polymerase til et samlet volumen på 2.626 pi per plade.
- Fjern pladen og PCR cooler fra -80 ° C fryser.
- Med pladen stadig på PCR køler, tilsættes 25 pi Master Mix B oven på frøsn Master Mix A til et samlet reaktionsvolumen på 50 pi. Det er tid kritisk, og bør være afsluttet inden Mix A kan tø. Forsegle pladen med folie.
- Sæt termisk cykliseringsapparat som følger: 94 ° C i 10 minutter, derefter 30 cyklusser ved 94 ° C i 15 sek, 65 ° C i 30 sek, 72 ° C i 2 min efterfulgt af en endelig forlængelsesperiode på 72 ° C i 7 min .
- Indlæse PCR plade efter blokken har nået 94 ° C.
2. Validering af 96 brønde Lang Primer PCR
- Kastet en stor 1% (vægt / volumen) agarosegel i Tris-acetat EDTA (TAE) løbebuffer med 4 x 28-brønds kamme til opnåelse af en gel med 4 rækker brønde. Juster alternative kammens tænder med spidserne af en 12 kanals multikanalpipette. nedsænkes forsigtigt gelen i TAE løbebuffer efter de baner er indlæst.
- Load 1 kb DNA-stige ind i 1. og 28. godt af hver række.
- Ved hjælp af en P20 12 kanals multikanal pipette 2 pi PCR-produkt dirrekte til hver bane af gelen (figur 1A). Gøre dette hurtigt at reducere muligheden for forurening af ampliconer.
- Læg PCR-produkterne fra række A i PCR-plade ind i de ulige nummererede baner af 1. p af gelen (A1 - bane 3, A2 - spor 5 ...... A11 - bane 23, A12 - bane 25) og indlæse PCR-produkterne fra række B i PCR-plade ind i de lige nummererede baner af 1. række i gel (B1 - bane 4, A2 - bane 6 ...... B11 - bane 24, B12 - bane 26).
- Indlæse PCR-produkter fra række C og D i PCR-plade under anvendelse af samme mønster som beskrevet ovenfor, med række C i de ulige nummererede baner og række D i banerne med lige numre. Fortsæt denne loading mønster indtil hver brønd i PCR-plade sættes på gelen. DNA lastning buffer er ikke påkrævet at indlæse denne gel.
- Placer gelen ind i kørende tank og fyld tanken med TAE kører buffer, indtil gelen er neddykket. Kørt ved 100 V i 30 minutter ogvisualisere anvendelse af en UV transilluminator. Se figur 1B for et eksempel gel.
Bemærk: PCR-produkter kan opbevares ved -20 ° C i flere uger før transfektion
3. 96-brønds Transfektion
- Brug T. brucei procyklisk formular cellelinie SMOXP9 10 for denne procedure og vokse i SDM-79 medium indeholdende 10% FCS 10.
- Bruge 1 x 10 7 celler pr transfektion (i alt 1,1 x 10 9 celler), når tagging på N-terminalen af proteinet og 2 x 10 7 celler pr transfektion (i alt 2,2 x 10 9 celler), når tagging på C-terminalen af proteinet. Opretholde cellerne i midten af log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 celler / ml) i flere dage forud for transfektion og høste cellerne til transfektion med en tæthed på 5-8 x 10 6 celler / ml.
- Tillad frosne PCR-produkter til transfektion tø op ved stuetemperatur.
- Tæl celler under anvendelse af en hæmocytometer eller automatisk celletæller.
- Pellet nødvendige antal celler i multiple 50 ml rør ved 800 xg i 10 min.
- Efter centrifugering skille supernatanten og resuspender cellerne i 10 ml modificeret cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCI, 0,15 mM CaCl2, 10 mM kaliumphosphatbuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (vægt / volumen) glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM hypoxanthin, 144 mM saccharose) pr rør. Overføre alle-løsninger til et enkelt rør og spin igen ved 800 xg i 10 min.
- Efter centrifugering kasseres supernatanten, og cellerne resuspenderes i 23 ml modificeret cytomix til en slutkoncentration på 5 x 10 7 celler / ml.
- Mens cellerne er spinning, tilsættes 1 ml SDM-79 medier til hver brønd i 4 x 24-brønds vævskulturplader. Mærk plader AD og tegne en ring rundt godt A1 på hver plade i permanent markør for at hjælpe plade orientering.
- Slut pladen handleren til elektroporator. På electroporator enhed indstille spændingen til 1.500 V, impulslængden til 100 mikrosekunder, og antallet af pulser til 12 og impulsintervallet til 500 msek. På pladen handleren, indstille impulstælling til 1. Dette sikrer, at denne elektroporator vil anvende en enkelt impuls til hver af de 12 kolonner i elektroporation pladen.
- Ved hjælp af en P200 12 kanals multikanal pipette PCR-reaktionerne fra PCR-plade til de 96 brønde engangs elektroporation plader, 4 mm hul.
- Når cellerne er blevet spundet og resuspenderes til en slutkoncentration på 5 x 10 7 celler / ml (trin 3.7), overførsel til et reagens reservoir. Pipetter 200 pi af cellens opløsningen i hver brønd på elektroporation plade ved anvendelse af en P200 12 kanals multikanalpipette, blandes med PCR-produkt ved pipettering.
- Brug af væv fjerne eventuelle smådråber fra toppen af pladen for at undgå kortslutninger.
- Påfør forseglingsfilmen tilvejebragt i pladen emballage til toppen af elektroporation plade, positioning det således at der efterlades huller til elektroderne afdækket ved toppen og bunden af hver søjle. Undgå at dække de hævede punkter, der bruges til at styre filmen.
- Læg elektroporation pladen ind i pladen handleren og luk låget. Tryk på 'Puls' på elektroporator enhed.
- Efter elektroporering, hurtigt overføre cellerne fra 96 brønde elektroporering pladen til 4 x 24-brønds vævskulturplader. For at overføre cellerne, brug en P200 12-kanal multikanal pipette med alle andre spids mangler således at de resterende 6 tips linje med de 6 rækker på en 24-brønds vævskulturplade. Overfør elektroporerede celler i 96-brønds plader elektroporeringer i foruddefineret mønster til de 24-brønds vævskulturplader (figur 2A).
- Forbered P200 pipettespidser - for hver 96 brønde transfektion forberede 2 kasser med 96 tips med alle andre kolonne fjernet.
- Overfør brønde A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 på 96-brønds elektroporering plade tilplade En række A i 24-brønds vævskulturplader, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 i række B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 i række C og D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 i rækken D. Efter overførsel af hvert sæt af 6 brønde fra 96-brønds plade til plade med 24 brønde, er brøndene i 96-brønds plade derefter vasket med medier fra de tilsvarende brønde i 24- brønds plade og vask overføres derefter tilbage til brøndene i 24-brønds plade.
- Overfør brønde E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 på 96-brønds elektroporering plade til plade med 24 brønde B række A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 i række B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 i række C og H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 i rækken D. Efter overførsel af hvert sæt af 6 brønde fra 96-brønds plade til plade med 24 brønde, brøndene i 96 brønds plade vaskes derefter med medier fra de tilsvarende brønde i 24-brønds plade og vask overføres derefter tilbage til brøndene i 24-brønds plade.
- Overfør brønde A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 på 96-brønds elektroporering plade til plade med 24 brønde C række A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 i række B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 i række C og D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 i rækken D. Efter overførsel af hvert sæt af 6 brønde fra 96 brønds plade til plade med 24 brønde, er brøndene i 96-brønds plade derefter vasket med medier fra de tilsvarende brønde i 24-brønds plade og vask overføres derefter tilbage til brøndene i 24-brønds plade.
- Overfør brønde E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 på 96-brønds elektroporering plade til plade med 24 brønde D række A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 i række B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 i række C og H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 i rækken D. Efter overførsel af hvert sæt af 6 brønde fra 96-brønds plade til plade med 24 brønde, brøndene i 96 brønds plade vaskes derefter med medier fra de tilsvarende brønde i 24-brønds plade og vask overføres derefter tilbage til brøndene i 24-brønds plade.
- Anvendelse af et omvendt fasekontrastmikroskop, undersøge 1 boringen fra hver søjle til at kontrollere cellerne. Der vil være en blanding af levende og døde celler med etvæsentlig mængde cellerester. Levende celler kan skelnes fra døde celler, fordi de vil være lyse under fasekontrastmikroskopi og vil bevæge sig.
- Placer 24-brønds plader i en ren, plastkasse med et låg, der danner en tæt forsegling. Sæt kassen i en 28 ° C inkubator.
- Mellem 6-8 timer senere tilsættes 1 ml SDM-79 med 10% FCS indeholdende 2x selektiv antibiotikum til hver brønd. Det er vores erfaring, cellelinjer, hvor generne er tagget på den N-terminale ende er resistente over for højere koncentrationer af selektivt medikament. Derfor bruger blasticidin som et eksempel, tagging på N-terminalen kræver en slutkoncentration på 20 ug / ml blasticidin og kodning på C-terminalen kræver en slutkoncentration på 10 ug / ml blasticidin.
Bemærk: Transgene cellelinjer bliver synlige 9-10 dage efter transfektion. - Passage mindst to gange i frisk lægemiddel og medier før analyse. Figur 2B viser resultaterne fra en typisk 96-brønds overfIndsatsen til mærkning af 96 forskellige proteiner på N-terminalen. Vurdere hver brønd ved fasekontrastmikroskopi for at afgøre, om den indeholder sunde lægemiddelresistente celler. En sund brønd indeholder overvejende (<95%) meget aktive celler, der er lyse i fase kontrakt mikroskopi. Efterfølgende analyse ved epifluorescens-mikroskopi eller western blot er påkrævet for at bestemme, om proteinet er blevet tagget med succes.
Representative Results
I dette repræsentative transfektion blev primerne designet ved hjælp af taken perl script 9 og syntetiseret kommercielt. 96-brønds PCR blev udført og valideret som beskrevet (figur 1A); i dette eksempel, 95/96 indeholder PCR'er var vellykkede (Figur 1B). Det er vores erfaring, at gentage mislykkede reaktioner enten med de oprindelige primere eller re-syntetiserede primere ikke resulterer i en vellykket PCR.
Amplikonerne blev overført til 96-brønds plader til elektroporation elektroporering (figur 2A) og derefter overført til 24-brønds dyrkningsplader til nyttiggørelse og udvælgelse. Efter tilstrækkelig tid til at tillade udvælgelsen at forekomme, blev brøndene scoret for overlevelse før yderligere analyse. I dette eksempel 88/96 brønde (92%) var positive efter 15 dages selektion.
Figur 1: Validering af lang primer PCR (A) Mønster til overførsel PCR-produkter fra 96-brønds PCR-plade til agarosegelen til validering af PCR.. (B) En repræsentativ 96-brønds PCR-validering gel til mærkning af 95 gener på N-terminalen, og 1 amplikon, der ikke indeholdt 5'målretning homologi til at fungere som en negativ kontrol i transfektionen. Prøverne lastes på en 1% (w / v) agarosegel og løses ved 100 V i 30 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 96-brønds elektroporering og udvælgelse (A) Mønster til overførsel elektroporerede celler fra 96-brønds elektroporation plat.e til 24-brønds vævskulturplader. (B) En skematisk viser en typisk levende / døde score efter 15 dage selektion i 24-brønds plader. Green betegner en vellykket transfektion, grå betegner en brønd med kun døde celler. I dette eksempel, 88/96 (92%) af brønde indeholdt held transfekterede parasitter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dramatiske forbedringer i følsomhed proteomics og transcriptomics metoder i de sidste 5-10 år har givet værdifulde data på tusinder af gener og deres produkter. Men til de værktøjer fat funktionen af disse proteiner har ikke holdt trit.
Tagging et protein letter talrige eksperimenter for at bestemme dens funktion. For eksempel kan et protein være fusioneret til et fluorescerende protein i en række forskellige farver til at lette lokaliserings- og co-lokalisering undersøgelser. Tags udviklet til elektronmikroskopi, såsom APEX2 eller miniSOG 11,12, tillade ultrastrukturelle lokalisering af mærkede protein. Tags til biokemi, såsom TAP-tag, og ProtC-TEV-ProtA (PTP) tagge 7,13 tillader oprensning af komplekser, der er forbundet med proteinet til identifikation af bindingspartnere eller in vitro biokemiske assays.
De specifikke trin, der er afgørende for succes af protocol er: inkorporeringen af DMSO i PCR Master Mix 1, frysning af PCR Master Mix 1 før tilsætningen af Master Mix 2, brug af den kommercielle polymerase i Master Mix 2 og ændringen af cytomix elektroporation buffer. Det er vores erfaring, er det nødvendigt at anvende fordoble antallet af celler efter C-terminal tagging transfektioner som for N-terminal tagging transfektioner for at opnå en lignende andel af positive brønde. Derfor skal udføres alle trin som beskrevet.
Denne teknik er kun forventes at blive en succes, når transfektion insekt procyklisk formular trypanosominfektion. Blodbanen former har en lavere transfektionseffektivitet 14 i øvrigt er de tilbøjelige til at dø i løbet af udvælgelsen på grund af tætheden-afhængig toksicitet, som er relateret til det selektive stof. Derfor er vores tidligere protokol repræsenterer den aktuelle bedste teknologi til kodning af blodbanen formular trypanosomer 9. Det er også sandsynligt, at den transinfektion effektivitet vil variere afhængig af den specifikke trypanosominfektion isolat. Denne protokol blev optimeret ved hjælp af 927 SMOX procykliske former - andre stammer kan kræve yderligere optimering. Foranstaltninger, der kan øge sandsynligheden for succes omfatter: at øge mængden af PCR-amplikon, øge antallet af celler, der indgår i transfektion.
Vi præsenterer en fremgangsmåde, hvor hundredvis af proteiner kan mærkes parallelt. Dette vil lette undersøgelser i stor skala på lokalisering og interaktion, der supplerer de eksisterende store datasæt og giver uvurderlig information til samfundet. Primer skabeloner er tilgængelige efter anmodning og en liste over plasmider skabeloner er tilgængelig fra: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
