Introduction
Trypanosoma brucei is een protozoa parasiet die humane Afrikaanse trypanosomasis en Nagana bij runderen veroorzaakt. T. brucei ideaal organisme voor de analyse van eiwitfunctie door de combinatie van een hoge kwaliteit genoom talrijke proteomics en transcriptomics datasets en goed ontwikkelde moleculaire technieken 1-3. Vooruitgang in proteomics en sequencing hebben geresulteerd in grote datasets die potentieel interessante genen 4-6 te benadrukken; echter veel genen minimale informatie die bij hen in de bestaande gegevensbanken. Er is derhalve behoefte aan een high-throughput werkwijze voor het eiwit functionele karakterisatie steun.
Expressie van een gelabeld eiwit kan een veelheid aan inzichten geven in de functie van een eiwit. Zo kan een eiwit gelabeld met een fluorescerend eiwit of epitoop gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie met informatie over waar de prot geeftein zou kunnen uitoefenen zijn biologische effect. Als alternatief, een eiwit gelabeld met een TAP 7, HaloTag 8 of His tag kan worden gezuiverd voor biochemische analyses en identificatie van de interactie tussen partners.
We hebben onlangs ontwikkelde een robuuste tagging methode voor T. brucei 9. Dit was lange PCR primer met het DNA voor transfectie genereren en kon de tagging tientallen eiwitten in parallel - een significante verbetering van bestaande protocollen. We hebben nu een verbetering van de schaalbaarheid van dit protocol in procyclische vormen door een orde van grootte. Hier presenteren we onze werkwijze waar we PCR en transfectie uitgevoerd in 96-well platen, met de terugwinning en selectie zich in 24-well platen. Honderden proteïnen nu kan worden gelabeld parallel deze methode een kosteneffectieve en werkbare methode voor het coderen van het gehele genoom trypanosoom.
Protocol
1. 96-well Lange PCR Primer
- Pre-freeze 96-well PCR koeler in -80 ° C vriezer.
- In een 10 ml buisje, maak Master Mix A: 2100 pl DDH 2 O, 105 ui PCR rang DMSO, 105 gl 10 mM dNTPs, 105 gl pPot matrijs (25 ng / ul) 9, voor een totaal volume van 2415 gl per plaat .
- Aliquot 23 pi in elk putje van een 96-well PCR plaat.
- Voeg 2 pl 100 uM primers samengevoegd aan elk putje beladen met een P20 12 kanaals multichannel pipet. Seal met film, plaat plaats op de pre-PCR gekoelde koeler en laten bevriezen gedurende ten minste 20 minuten bij -80 ° C.
- In een 10 ml buisje, maak Master Mix B: 2048 pl DDH 2 O, 525 gl 10x buffer, 52,5 pl polymerase voor een totaal volume van 2626 gl per plaat.
- Verwijder plaat en de PCR-koeler uit de -80 ° C vriezer.
- Met de plaat nog op de PCR koeler, voeg 25 pi Master Mix B bovenop het bevroorn Master Mix A voor een totaal reactievolume van 50 pl. Dit is de tijd van cruciaal belang, en moet worden afgerond voordat Mix A kan ontdooien. Seal plaat met film.
- Stel thermische cycler als volgt: 94 ° C gedurende 10 min, vervolgens 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 65 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door een laatste verlenging van 72 ° C gedurende 7 min .
- Laad de PCR-plaat na het blok 94 ° C heeft bereikt.
2. Validatie van 96-well Long Primer PCR
- Zet een grote 1% (w / v) agarosegel in Tris-acetaat EDTA (TAE) loopbuffer met 4 x 28 putjes kammen om een gel te geven met 4 rijen putjes. Lijn alternatieve tanden van de kam met de toppen van een 12-kanaals multichannel pipet. dompel voorzichtig de gel in TAE loopbuffer na de rijstroken worden geladen.
- Load 1 kb DNA ladder in de 1 ste en 28 ste putje van elke rij.
- P20 met een 12 kanaals multichannel pipet 2 pi PCR product directly elke laan van de gel (figuur 1A). Doe dit snel om de mogelijkheid van besmetting van de amplicons verminderen.
- Laad de PCR-producten van rij A van de PCR-plaat in de oneven genummerde rijstroken van de 1e rij van de gel (A1 - baan 3, A2 - laan 5 ...... A11 - laan 23, A12 - laan 25) en laadt de PCR-producten van rij B van de PCR-plaat in de even genummerde lanen van de 1e rij van de gel (B1 - laan 4, A2 - laan 6 ...... B11 - laan 24, B12 - laan 26).
- Laad de PCR-producten van rij C en D van de PCR-plaat met hetzelfde patroon als hierboven beschreven, met rij C in de oneven genummerde lanen en rij D in de even genummerde rijstroken. Herhaal dit beladingspatroon totdat elk putje van de PCR-plaat op de gel geladen. DNA laadbuffer is niet vereist om deze gel geladen.
- Plaats de gel in de running tank en vul de tank met TAE-loopbuffer totdat de gel wordt ondergedompeld. Uitgevoerd bij 100 V gedurende 30 minuten envisualiseren met een UV transilluminator. Zie Figuur 1B een voorbeeld gel.
Opmerking: PCR producten kan gedurende verscheidene weken voorafgaand aan transfectie worden bewaard bij -20 ° C
3. 96-well Transfectie
- Gebruik de T. brucei procyclische vorm cellijn SMOXP9 10 voor deze procedure en groeien in SDM-79 media met 10% FCS 10.
- Met 1 x 10 7 cellen per transfectie (totaal 1,1 x 10 9 cellen) bij het labelen van de N terminus van het eiwit en 2 x 10 7 cellen per transfectie (totaal 2,2 x 10 9 cellen) bij het labelen van de C terminus van het eiwit. Handhaaf de cellen in mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 cellen / ml) gedurende enkele dagen voorafgaand aan transfectie en oogst de cellen voor transfectie bij een dichtheid van 5-8 x 10 6 cellen / ml.
- Laat bevroren PCR producten voor transfectie te ontdooien bij kamertemperatuur.
- Aantal cellen met een haemocytometer of automatische cel teller.
- Pellet vereiste aantal cellen in meerdere 50 ml buizen bij 800 xg gedurende 10 min.
- Na centrifugeren verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml gemodificeerde cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM kaliumfosfaatbuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (w / v) glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM hypoxanthine, 144 mM sucrose) per buis. Transfer alle GSM oplossingen voor een enkele buis en weer draaien bij 800 xg gedurende 10 min.
- Na centrifugeren, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 23 ml gemodificeerd cytomix voor een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml.
- Terwijl cellen spinnen, voeg 1 ml SDM-79 medium aan elk putje van 4 x 24-putjes weefselkweekplaten. Label de platen AD en trek een ring rond goed A1 op elke plaat in permanent marker op plaat oriëntatie te helpen.
- Sluit de plaat handler aan de electroporator. Op electroporator toestel de spanning 1500 V, de pulslengte op 100 psec en het aantal pulsen 12 en de puls interval 500 msec. Op de plaat handler stelt de pulsteller op 1. zodat dat electroporator één puls voor elk van de 12 kolommen van de plaat elektroporatie.
- P200 met een 12 kanaals multichannel pipet de PCR-reacties van de PCR-plaat met de 96-well platen disposable elektroporatie, 4 mm tussenruimte.
- Wanneer de cellen werden gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd om de uiteindelijke concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml (stap 3,7), over te dragen aan een reagensreservoir. Pipetteer 200 ul van de cel-oplossing in elk putje van de plaat elektroporatie met een P200 12 kanaals multichannel pipet, mengen met PCR product door pipetteren.
- Met behulp van weefsel verwijderen druppels van de bovenkant van de plaat om kortsluitingen te voorkomen.
- Breng de afsluitfolie aangebracht in de plaat verpakking aan de bovenzijde van de plaat elektroporatie, positioning is om de gaten voor de elektroden onbedekte bovenaan en onderaan elke kolom staat. Voorkom dat de verhoogde punten gebruikt om de film te begeleiden.
- Laad de elektroporatie plaat in de plaat handler en sluit het deksel. Druk op 'Pulse' op de electroporator unit.
- Na elektroporatie snel de cellen overbrengen van de 96-well plaat elektroporatie de 4 x 24-putjes weefselkweekplaten. Om de cellen te brengen, gebruikt een P200 12 kanaals multichannel pipet met elke tip ontbreekt, zodat de resterende 6 tips onmiddellijk boven het 6 rijen op een 24-well weefselkweekplaat. Breng de geëlektroporeerde cellen in 96-well platen in electroporations voorgeprogrammeerd patroon aan de 24-well weefselkweekplaten (Figuur 2A).
- Bereid de P200 pipet tips - voor elke 96-well transfectie bereiden 2 dozen van 96 tips met elke andere kolom verwijderd.
- Transfer putten A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 op de 96-well elektroporatie plaatplaat Een rij A van de 24-well weefselkweek platen, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in rij B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in rij C en D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putjes van de 96-well plaat om de 24-well plaat, worden de putten in de 96-well plaat vervolgens met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24- wells plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat.
- Transfer putjes E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 van de 96-well elektroporatie plaat 24 putjes B rij A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in rij B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in rij C en H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96-well plaat om de 24-well plaat, de putten in de 96 -well platen worden vervolgens gewassen met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat.
- Transfer putjes A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 op de 96-well plaat elektroporatie 24-putjesplaat C rij A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in rij B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in rij C en D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96 -well plaat om de 24-well plaat, worden de putten in de 96-well plaat vervolgens met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat.
- Transfer wells E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 op de 96-well elektroporatie plaat 24 putjes D rij A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in rij B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in rij C en H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96-well plaat om de 24-well plaat, de putten in de 96 -well platen worden vervolgens gewassen met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat.
- Met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop, onderzoeken 1 en van elke kolom aan de cellen te controleren. Er zal een mix van levende en dode cellen met een te zijnaanzienlijke hoeveelheid celresten. Levende cellen kunnen worden onderscheiden van dode cellen omdat ze licht onder fasecontrast microscopie en zal bewegen.
- Plaats de 24-well platen in een schone, plastic doos met een deksel dat een afdichting vormt. Zet de box aan een 28 ° C incubator.
- Tussen 6-8 uur later, voeg 1 ml SDM-79 met 10% FCS bevattende 2x selectieve antibioticum aan elk putje. Onze ervaring cellijnen waar de genen hebben op het N-uiteinde zijn bestand tegen hogere concentraties van selectieve geneesmiddelen. Daarom worden bij Blasticidine als voorbeeld tagging op het N-uiteinde vereist een eindconcentratie van 20 ug / ml blasticidine en tagging op de C-terminus is een eindconcentratie van 10 ug / ml blasticidine.
Opmerking: Transgene cellijnen zijn zichtbaar 9-10 dagen worden na transfectie. - Passage ten minste tweemaal in vers geneesmiddel en media voorafgaand aan analyse. Figuur 2B toont de resultaten van een typische 96-putjes ovectie voor tagging 96 verschillende eiwitten op de N terminus. Beoordelen elk putje door fasecontrast microscopie te bepalen of deze bevat gezonde, drug resistente cellen. Een gezonde en bevat voornamelijk (<95%) zeer actieve cellen die helder in fase contract microscopie zijn. Daaropvolgende analyse door epifluorescentie microscopie of Western blot nodig om te bepalen of het eiwit met succes hebben.
Representative Results
In deze representatieve transfectie werden de primers ontworpen met het TagIT perlmanuscript 9 en commercieel gesynthetiseerd. De 96-well PCR werd uitgevoerd en gevalideerd zoals beschreven (figuur 1A); in dit voorbeeld, 95/96 PCRs werden succesvol (Figuur 1B). Onze ervaring herhalen mislukt reacties hetzij de oorspronkelijke primers of opnieuw gesynthetiseerde primers niet tot een succesvolle PCR.
De amplicons werden overgebracht in 96-well platen voor elektroporatie elektroporatie (Figuur 2A) en vervolgens overgebracht naar 24-well kweekplaten voor terugwinning en selectie. Na voldoende tijd om de selectie plaatsvindt, werden de putjes scoorden voor overleving voorafgaand aan verdere analyse. In dit voorbeeld 88/96 wells (92%) waren positief na 15 dagen selectie.
Figuur 1: Validatie van lange primer PCR (A) Patroon voor het overbrengen van PCR-producten van 96-well PCR-plaat om de agarosegel voor de validatie van PCR.. (B) Een representatieve 96-wells PCR validatie gel voor het etiketteren 95 genen op de N- terminus en 1 amplicon die geen 5 'homologie gericht om als negatieve controle in de transfectie. De monsters worden geladen op een 1% (w / v) agarosegel en opgelost bij 100 V gedurende 30 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 96-well elektroporatie en selectie (A) Patroon voor het overbrengen van geëlektroporeerde cellen van 96-well elektroporatie plat.e naar 24-putjes weefselkweekplaten. (B) Een schema dat een typische levende / dode doelpunt na 15 dagen selectie in 24-well platen. Groen staat voor een succesvolle transfectie, grijs is een goed met slechts dode cellen. In dit voorbeeld, 88/96 (92%) van de putten die met succes getransfecteerde parasieten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Drastische verbeteringen in de gevoeligheid van proteomics en transcriptomics methoden in de afgelopen 5-10 jaar heeft waardevolle gegevens over duizenden genen en hun producten. De instrumenten aan te pakken de functie van deze eiwitten hebben geen gelijke tred gehouden.
Tagging een eiwit vergemakkelijkt talrijke experimenten om de functie te bepalen. Zo kan een eiwit worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit in een verscheidenheid van verschillende kleuren localisatie en co-localisatie studies te vergemakkelijken. Markeringen ontwikkeld voor elektronenmicroscopie, zoals APEX2 of miniSOG 11,12 toestaan ultrastructurele lokalisatie van het gecodeerde eiwit. Tags for biochemie, zoals TAP tag en ProtC-TEV-ProtA (PTP) tag 7,13 zodat zuivering van complexen geassocieerd met het eiwit voor het identificeren van bindingspartners of in vitro biochemische assays.
De specifieke stappen die cruciaal zijn voor het succes van de protoc zijnol zijn: de opname van DMSO in de PCR Master Mix 1, het bevriezen van de PCR Master Mix 1 voorafgaand aan de toevoeging van de Master Mix 2, het gebruik van de commerciële polymerase in Master Mix 2 en de wijziging van de cytomix elektroporatie buffer. In onze ervaring, is het noodzakelijk om het dubbele van het aantal cellen te gebruiken voor C-terminale tagging transfecties als voor N-terminale tagging transfecties met het oog op een vergelijkbaar percentage van positieve putjes te bereiken. Daarom moeten alle stappen worden uitgevoerd zoals beschreven.
Deze techniek is alleen kans van slagen als het transfecteren van het insect procyclische vorm trypanosoom. Bloedstroomvormen hebben een lagere transfectie-efficiëntie 14, bovendien zijn ze waarschijnlijk tijdens de selectie om te sterven als gevolg van de dichtheid-afhankelijke toxiciteit die geen verband houdt met de selectieve drug. Daarom is onze vorige protocol vertegenwoordigt de huidige beste technologie voor het etiketteren van bloed vorm trypanosomen 9. Het is ook waarschijnlijk dat de transfection efficiency zal afhangen van de specifieke trypanosoom isolaat variëren. Dit protocol werd geoptimaliseerd met behulp van 927 SMOX procyclische vormen - andere stammen kunnen extra optimalisatie nodig. Maatregelen die de kans op succes kunnen verhogen zijn: het verhogen van de hoeveelheid PCR amplicon, waardoor het aantal cellen in de transfectie.
We presenteren een methode waarbij honderden eiwitten kunnen worden gelabeld parallel. Dit zal grootschalige studies te vergemakkelijken op lokalisatie en interactie, als aanvulling op bestaande grote datasets en het verstrekken van waardevolle informatie aan de gemeenschap. Primer templates zijn beschikbaar op aanvraag en een lijst van plasmiden templates beschikbaar is beschikbaar op: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
