Introduction
トリパノソーマは 、ウシにおける人間のアフリカtrypanosomasisとナガナ病を引き起こす寄生原虫である。T.トリパノソーマは 、高品質のゲノム、多数のプロテオミクスおよびトランスクリプトームデータセットとよく発達した分子ツール1-3の組み合わせにタンパク質機能の解析のための理想的な生物です。プロテオミクスおよびシーケンシングの進歩は、潜在的に興味深い遺伝子4-6ハイライト表示し、大規模なデータセットをもたらしています。しかし、多くの遺伝子は、既存のデータベースに、それらに関連する最小限の情報を持っています。タンパク質の機能的特徴付けを支援するためのハイスループット法が必要とされています。
タグ付けされたタンパク質の発現は、タンパク質の機能への洞察の多様性を与えることができます。例えば、蛍光タンパク質またはエピトープでタグ付けされたタンパク質は、protのについての情報を提供する、蛍光顕微鏡によってローカライズすることができますEINはその生物学的効果を発揮する可能性があります。また、TAP 7でタグ付けされたタンパク質は、HaloTag 8またはHisタグは、生化学的ア ッセイおよびその相互作用パートナーの同定のために精製することができます。
我々は最近、T.ための堅牢なタグ付けの方法論を開発しましたトリパノソーマ 9。これは、トランスフェクションのためのDNAを生成するために、長いプライマーPCRを使用し、並列中のタンパク質の数十のタギング許可 - 既存のプロトコルへの主要な改善を。我々は今一桁procyclic形で、このプロトコルの拡張性を改善しています。ここでは、回復と選択が24ウェルプレート内で発生して、96ウェルプレートに我々の我々は、PCRを行う方法およびトランスフェクションを示します。タンパク質の数百人が今並列にタグを付けることができますように、この方法は、全体トリパノソーマゲノムをタグ付けするための費用対効果や実現可能な方法を提供します。
Protocol
1. 96ウェルのロングプライマーPCR
- -80℃の冷凍庫でプレ凍結96ウェルPCRクーラー。
- プレート当たり2415マイクロリットルの総容積のために、のddH 2 O 2100μlを、105μlのPCRグレードのDMSO、105μlの10 mMのdNTPを、105μlのPPOTテンプレート（25 ngの/μl）を9：10 mlチューブでは、マスターミックスAを準備。
- アリコートを96ウェルPCRプレートの各ウェルに23μL。
- P20の12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用してもロードされた各プライマーをプールし、100μMの2μLを加えます。あらかじめ冷却PCRクーラーにフィルム、場所板をシールし、-80℃で20分間の最低凍結することができます。
- 10ミリリットルのチューブでは、マスターミックスBを用意：2048μlののddH 2 O、525μlの10×緩衝液、プレート当たり2626マイクロリットルの総容量52.5μlのポリメラーゼ。
- -80°Cの冷凍庫からプレートおよびPCRクーラーを取り外します。
- PCRクーラー上の静止プレートと、フリーズの上に25μlのマスターミックスBを追加nはマスターミックスAを50μlの総反応容量のために。これは重要な時期であり、そしてミックスAを解凍する前に完了する必要があります。フィルムでプレートをシール。
- 94℃を10分間7分間72℃での最終伸長期間に続いて2分間30秒15秒94℃の30サイクル、65℃、72℃、その後、次のようにサーマルサイクラーを設定します。 。
- ブロックが94℃に達した後、PCRプレートをロードします。
96ウェルのロングプライマーPCRの2検証
- ウェルの4行のゲルを得るために、4×28ウェルコームとトリス酢酸EDTA（TAE）ランニング緩衝液中で大きな1％（w / v）アガロースゲルをキャスト。 12チャンネルのマルチチャンネルピペットの先端に櫛の代替歯の位置を合わせます。レーンがロードされた後、慎重にTAEランニング緩衝液にゲルを浸します。
- 1 番目と28 番目のウェルの各列にロード1 kbのDNAラダー。
- P20 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、PCR産物でdirの2μLを移しますectlyゲル（ 図1A）の各レーンへ。アンプリコンを汚染する可能性を低減するために迅速にこれを行います。
- （ - レーン3、A2 - レーン5 ...... A11 - レーン23、A12 - A1レーン25）ゲルの1行目の奇数番号のレーンにPCRプレートのA列からのPCR産物をロードし、PCR産物をロードゲルの1 行目の偶数番号のレーンにPCRプレートの列Bから（B1 -レーン4、A2 -レーン6 ...... B11 -レーン24、B12 -レーン26）。
- 偶数レーンにレーン番号、行D奇数に列Cと、上記のように同じパターンを使用して、PCRプレートの列CおよびDからのPCR産物を読み込みます。 PCRプレートの各ウェルは、ゲル上にロードされるまで、この負荷パターンを続けます。 DNAローディングバッファーは、このゲルをロードする必要はありません。
- ランニングタンクにゲルを置き、ゲルが水没するまでバッファを実行しているTAEでタンクを埋めます。 30分間100 Vで実行し、UVトランスイルミネーターを使用して視覚化します。例えばゲルについては、 図1Bを参照してください。
注：PCR産物は、数週間前、トランスフェクションのために-20℃で保存することができ
3. 96ウェルトランスフェクション
- T.を使用しますトリパノソーマ procyclicフォーム細胞株は、この手順のためSMOXP9 10とFCS 10 10％を含むSDM-79培地中で増殖。
- トランスフェクションあたり1×10 7細胞を使用してください（1.1×10 9細胞の合計）Nタンパク質の末端およびトランスフェクションあたり2×10 7細胞にタグ付け（2.2×10 9細胞の合計）のC末端にタグ付けタンパク質。トランスフェクションの前に数日間中間対数（1.2×10 6 -1×10 7細胞/ ml）で細胞を維持し、5-8×10 6細胞/ mlの密度で、トランスフェクションのために細胞を回収。
- トランスフェクションのための冷凍PCR産物を室温で解凍することができます。
- ヘムを用いて細胞を数えますocytometerまたは自動セルカウンター。
- ペレットを10分間、800×gで、複数の50 mlのチューブ内のセルの数を必要としました。
- 遠心廃棄上清後で、cytomix（0.8mMのEGTA、24 mMのKClを修飾10ml中に0.15ミリモルのCaCl 2、10mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.6、25mMのHEPES-KOH pH7.6、2.6ミリモルのMgCl 2を 、細胞を再懸濁チューブあたり0.5％（w / v）のグルコース、100μg/ mlのBSA、1mMのヒポキサンチン、144 mMのスクロース）。単一の管に、すべてのセル・ソリューションを移し、10分間、800×gで再びスピン。
- 遠心分離後、上清を廃棄し、5×10 7細胞/ mlの最終濃度のために修飾cytomix 23 ml中に細胞を再懸濁。
- 細胞が回転している間に、4×24ウェル組織培養プレートの各ウェルにSDM-79培地1mlを加えます。プレートのADにラベルを付け、プレートの向きを助けるために永久的なマーカーで各プレート上の周りにもA1をリングを描きます。
- エレクトロポにプレートハンドラーを接続します。 electropora上器ユニットは、1500 Vへの電圧、100マイクロ秒のパルス長と12へのパルス数と、500ミリ秒のパルス間隔を設定します。プレートハンドラーでは、これは、そのエレクトロはエレクトロポレーションプレートの12列のそれぞれに単一パルスを印加するようになります1にパルス数を設定します。
- P200 12チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルの使い捨てエレクトロポレーションプレートを、4mMのギャップにPCRプレートからPCR反応を転送します。
- 細胞は、紡糸されており、5×10 7細胞/ ml（ステップ3.7）の最終濃度に再懸濁されたときに、試薬容器に移します。ピペットP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、エレクトロポレーションプレートの各ウェルに細胞溶液200μlを、ピペッティングによりPCR産物と混合します。
- 組織を使用することにより、短絡を回避するために、プレートの上から任意の液滴を除去します。
- エレクトロポレーションプレートの上に板パッケージに設けられたシールフィルム、POSを適用各列の上部と下部に覆われていない電極用の穴を残すようにそれをitioning。フィルムを導くために使用される隆起した点をカバーすることは避けてください。
- プレートハンドラーへのエレクトロポレーションプレートをロードし、蓋を閉じます。エレクトロユニットを押し「パルス」。
- エレクトロポレーション後、すぐに4×24ウェル組織培養プレートに96ウェルエレクトロポレーションプレートから細胞を移します。細胞を転送するには、他のすべての先端が欠けているとP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用するように、残りの6つのヒントは、24ウェル組織培養プレート上の6行と列に並ぶこと。 24ウェル組織培養プレート（ 図2A）に予め定義されたパターンで、96ウェルエレクトロポレーションプレートでエレクトロポレーションした細胞を移します。
- P200のピペットチップを準備 - 各96ウェルのトランスフェクションのために除去他のすべての列と96のヒントの2箱を準備します。
- 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルA1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11へプレート24ウェル組織培養プレートの列A、B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11列Bに、C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11行のCおよびD1 / D3 / D5 / D7へ行D.へ/ D9 / D11 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転送後、96ウェルプレート中のウェルは、その後で対応するウェルから培地で洗浄されています24-ウェルプレートの洗浄は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。
- 24ウェルプレートB列Aに96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルE1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11、F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11列Bに、G1 / G3 / G5 / 96でのG7 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11へG9 / G11、井戸型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。
- 24ウェルプレートのC列A、B2 / B4 / B6 / B 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送のウェルA2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12列Bに、C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 C列と96から6ウェルの各セットの転写後行D.へD2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12には、 24ウェルプレートに型ウェルプレートは、96ウェルプレート中のウェルを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。
- 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送井戸E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24ウェルプレートD列AにB行に、F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12、G2 / G4 / G6 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12にG8 / G10 / G12、96のウェル型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。
- 倒立位相差顕微鏡を用いて、細胞を確認するために、各列のウェル1を調べます。で生細胞と死細胞の混合物があるでしょう細胞破片のかなりの量。それらは位相差顕微鏡の下で明るくなり、移動されるので、生細胞を死細胞と区別することができます。
- タイトなシールを形成する蓋付きの清潔な、プラスチック製の箱に24ウェルプレートを置きます。 28℃のインキュベーターにボックスを置きます。
- 後で時間6-8との間には、各ウェルに2倍の選択抗生物質を含む10％FCSをSDM-79の1ミリリットルを追加します。我々の経験では、遺伝子はN末端にタグ付けされた細胞株は、選択薬剤の高い濃度に対して耐性です。したがって、一例としてブラストサイジン用いて、N末端にタグ付けすることを20μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とし、C末端にタグ付けを10μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とします。
注：トランスジェニック細胞株を9-10日、トランスフェクション後に見えるようになります。 - 少なくとも2倍、新鮮な薬剤やメディアでの分析の前に通過。 図2Bは、典型的な96ウェルtransfeからの結果を示しますN末端に96の異なるタンパク質をタグ付けするためのction。それは健康、薬剤耐性細胞が含まれているかどうかを判断するために、位相差顕微鏡により各ウェルを評価します。健康だけでなく、位相契約顕微鏡で明るく、主に（<95％）高活性の細胞が含まれています。落射蛍光顕微鏡法またはウェスタンブロットによるその後の分析は、タンパク質が正常にタグ付けされているかどうかを決定する必要があります。
Representative Results
この代表的なトランスフェクションでは、プライマーはTagItのperlスクリプト9を使用して設計され 、商業的に合成しました。 96ウェルPCRを行うと説明した （ 図1A）のように検証されました。この例では、96分の95のPCR（ 図1B）に成功しました。我々の経験では、成功したPCRにはなりません元のプライマーまたは再合成されたプライマーを用いたいずれかの障害が発生した反応を繰り返します。
アンプリコンは、エレクトロポレーション（ 図2A）のための96ウェルエレクトロポレーションプレートに移し、次いで、回収および選択のための24ウェル培養プレートに移しました。選択が起こることを可能にするのに十分な時間の後、ウェルを、さらなる分析の前に、生存のために記録しました。この例では、96分の88ウェル（92％）は、15日間の選択後に陽性でした。
図2：96ウェルエレクトロポレーションおよび選択 96ウェルエレクトロポレーションPLATのエレクトロポレーションした細胞を転送するための（A）パターン。24ウェル組織培養プレートに、E。 （B）24ウェルプレートにおける選択の15日後に典型的な生/死得点を模式的に示します。グリーンはグレーのみ死細胞とよく表して、成功したトランスフェクションを表します。この例では、ウェルの96分の88（92％）が正常にトランスフェクトされた寄生虫が含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
最後の5年から10年におけるプロテオミクスとトランスクリプトミクスの方法の感度の劇的な改善は、遺伝子およびそれらの製品の何千もの貴重なデータを提供してきました。しかし、これらのタンパク質の機能に対応するためのツールが追いついていません。
タンパク質のタグ付けは、その機能を決定するために多くの実験を容易にします。例えば、タンパク質は、局在化および共局在研究を容易にするために、異なる色の様々な蛍光タンパク質に融合することができます。このようなAPEX2やminiSOG 11,12などの電子顕微鏡用に開発されたタグ、タグタンパク質の超微局在を可能にします。このようなTAPタグ、およびProtC-TEV-PROTA（PTP）などの生化学用のタグは、7,13は、結合パートナーの同定のためまたはインビトロ生化学アッセイでタンパク質と結合した複合体の精製を可能にするタグ。
protocの成功に重要である特定の手順、PCRマスターミックス1へのDMSOの取り込みマスターミックス2、マスターミックス2の商業ポリメラーゼの使用とcytomixエレクトロポレーションバッファの変更を加える前に、PCRマスターミックス1の凍結：オールがあります。我々の経験では、陽性ウェルの類似の比率を達成するために、N末端タグのトランスフェクションのためのように、C末端タグのトランスフェクションのための細胞の二重の数を使用する必要があります。記載されているようにそのため、すべてのステップを実行する必要があります。
この技術は、昆虫procyclicフォームトリパノソーマをトランスフェクションする際に成功する唯一の可能性があります。血流フォームは低いトランスフェクション効率14を持って、しかもそれらが原因で、選択薬とは無関係の密度依存毒性に選択中に死亡する可能性があります。したがって、我々の以前のプロトコルは、血流フォームトリパノソーマ9のタグ付けのための現在の最高の技術を表しています。また、トランス、その可能性がありますフェクション効率は、特定のトリパノソーマの分離株に依存して変化するであろう。他の株は、追加の最適化を必要とするかもしれない - このプロトコルは927 SMOX procyclicフォームを使用して最適化しました。成功の確率を高めることができる対策は、次のとおり、PCRアンプリコンの量を増加させるトランスフェクションに含まれるセルの数を増加させます。
我々は、タンパク質の数百を並列にタグを付けることができます方法を提示します。これは、既存の大規模なデータセットを補完し、コミュニティに貴重な情報を提供し、局在との相互作用に大規模な研究を促進します。プライマーテンプレートは、リクエストに応じて利用可能であり、プラスミドテンプレートのリストは、から入手できます。http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
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