Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

निष्कर्षण और मिट्टी में माइक्रोबियल Phospholipid फैटी एसिड का विश्लेषण

Published: August 26, 2016 doi: 10.3791/54360
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 5
1Department of Renewable Resources, University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty, University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement, Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences, Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre, Natural Resources Canada

Summary

फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। हम एक एकल चरण क्लोरोफॉर्म मिश्रण, ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों का उपयोग कर निकाला लिपिड के विभाजन, और methanolysis फैटी एसिड मिथाइल एस्टर, जो केशिका गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं का निर्माण करने के साथ मिट्टी के नमूने से निकासी के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड (PLFAs) माइक्रोबियल कोशिका झिल्ली के प्रमुख घटक हैं। मिट्टी से निकाला PLFAs के विश्लेषण स्थलीय माइक्रोबियल समुदायों के समग्र संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। PLFA रूपरेखा के बड़े पैमाने पर समग्र मिट्टी की गुणवत्ता का एक जैविक सूचकांक के रूप में पारिस्थितिक तंत्र की एक श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है, और मिट्टी की प्रतिक्रिया का एक संकेतक के रूप में मात्रात्मक प्रबंधन और अन्य पर्यावरणीय तनाव देश के लिए।

एक एकल चरण क्लोरोफॉर्म मिश्रण के साथ मिट्टी के नमूने से 1. लिपिड निकासी, 2. विभाजन अन्य निकाले लिपिड से फॉस्फोलिपिड को अलग-थलग करने के लिए ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों का उपयोग, 3. फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड का उत्पादन करने के methanolysis: यहां प्रस्तुत मानक पद्धति चार प्रमुख कदम की रूपरेखा मिथाइल एस्टर (fames), और 4. केशिका गैस एक लौ आयनीकरण डिटेक्टर (जीसी खूंटी) का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रसिद्धि विश्लेषण। दो मानकों इस्तेमाल कर रहे हैं, 1,2-dinonadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (पीसी (19 सहित:0/19: 0)) निष्कर्षण विधि के समग्र वसूली का आकलन करने के लिए, और मिथाइल decanoate (MeC10: 0) जीसी विश्लेषण के लिए एक आंतरिक मानक (ISTD) के रूप में।

Introduction

फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड (PLFAs) डोमेन बैक्टीरिया और यूकेरिया से माइक्रोबियल सेलुलर झिल्ली का हिस्सा हैं। सूक्ष्मजीवों सेल झिल्ली अखंडता और उनके तत्काल पर्यावरण की स्थिति के जवाब में सेलुलर समारोह को बनाए रखने के लिए एक साधन के रूप में विभिन्न श्रृंखला लंबाई और रचना के PLFAs उत्पादन; इसलिए यह तर्क दिया जा सकता है कि माइक्रोबियल समुदायों कि भौगोलिक दृष्टि से अलग हो रहे हैं लेकिन इसी मिट्टी की स्थिति के अधीन हैं समान PLFAs व्यक्त करेंगे। 14 और 20 सी परमाणुओं के बीच एक श्रृंखला लंबाई के साथ मिट्टी PLFAs आम तौर पर मुख्य रूप से बैक्टीरियल और फंगल उत्पत्ति 1 का होना माना जाता है। मिश्रित संस्कृतियों में, PLFA विश्लेषण व्यक्ति माइक्रोबियल प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह मिट्टी में पाया माइक्रोबियल समुदायों की एक समग्र फिंगरप्रिंट प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, क्योंकि PLFAs तेजी से कोशिका मृत्यु पर अपमानित कर रहे हैं, वे व्यवहार्य मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय 2 का प्रतिनिधि माना जा सकता है। इस टीईसीhnique बड़े पैमाने पर वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया माइक्रोबियल समुदायों, 5-6 घास के मैदानों के लिए जंगलों में 3-4 से लेकर और कृषि क्षेत्रों 7 के संरचनात्मक रचना को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह सफलतापूर्वक मिट्टी प्रतिक्रिया निस्र्पक प्रबंधन बदलाव करने के लिए भूमि में लागू किया गया है, जंगल साफ-काटने 8, 9 LiMing, उद्धार 10-12, साथ ही ऐसी आग 13, धातु 14 और हाइड्रोकार्बन 15 से संदूषण के रूप में गड़बड़ी के रूप में शामिल है, और कीट प्रकोप 16 ।

समकालीन PLFA विश्लेषणात्मक विधि पिछले छह अनुसंधान समूहों की एक संख्या से कई महत्वपूर्ण प्रगति के माध्यम से दशकों के दौरान विकसित हुआ। एक दो अवस्था का सिस्टम 17 में monophasic से मिश्रण में बदलाव करने की निकासी के समाधान में पानी के अनुपात: मेथनॉल: 1958 में, एक महत्वपूर्ण सुधार क्लोरोफॉर्म को एडजस्ट करने से पैदा हुई। यह अनुकूलित लिपिड निकासी और संशोधित अलगाव समर्थकtocol Bligh और डायर पद्धति के रूप में जाना गया। प्रोटोकॉल अगले कुछ दशकों में कई प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया गया था और इस समय के दौरान, सफेद और उनके सहयोगियों ने विधि करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति योगदान दिया; उदाहरण के लिए, वे पानी के लिए एक फॉस्फेट बफर आदान प्रदान से निष्कर्षण कदम में सुधार हुआ है, और वे गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) बढ़ाया चोटी की पहचान और मात्रा का ठहराव के माध्यम से विश्लेषण अनुकूलित। मृदा विज्ञान के लिए अधिक प्रासंगिकता के शायद, वे 1979 में चुना गया है, जब वे समुद्री तलछट 18 के माइक्रोबियल बायोमास की जांच की कि निकाले लिपिड माइक्रोबियल संरचना का एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

आगे की घटनाओं में 1980 के दशक में हुई के रूप में विधि अधिक व्यापक रूप से, मृदा विज्ञान के क्षेत्र में उपयोग किया जाने लगा विशेष rhizosphere 19 के संबंध में। उस समय, विधि शामिल मिथाइल nonadecanoate (MeC19: 0) एक आंतरिक मानक 19 और लिपिड विभाजन 21 <के लिए एक सिलिका संबंधी एसिड स्तंभ के उपयोग के रूप में/ Sup>। व्हाइट 19,21 के साथ अपने काम के बाद, Tunlid स्वीडन में लौटे और बाथ और Frostegård के साथ सहयोगात्मक अनुसंधान शुरू कर दिया। कार्बनिक पदार्थ सामग्री में बदलती मिट्टी का एक सूट के लिए अलग निकासी buffers की दक्षता की जांच करके, समूह से पता चला कि साइट्रेट बफर लिपिड फॉस्फेट निकाले की राशि में वृद्धि हुई फॉस्फेट बफर 22 की तुलना में। इसके अलावा, मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों पर LiMing के प्रभाव पर उनके 1993 के प्रकाशन 23 पर चला गया मिट्टी जीवविज्ञान और जैव रसायन 24 में एक प्रशस्ति पत्र क्लासिक बन जाते हैं। शोधकर्ताओं ने अपने डाटा प्रोसेसिंग में प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग किया। PLFA विश्लेषण, के रूप में विधि अब कहा जाता है, बड़े डेटा सेट उत्पन्न करता है और बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय प्रक्रियाओं के उपयोग इन आंकड़ों को प्रोसेस करने में अत्यधिक कई लोगों के लिए समय के लिए अभिनव और प्रेरणादायक था। काम करने के लिए समवर्ती स्वीडन में किया जा रहा है, PLFA प्रक्रिया के लिए संशोधन में जांच की जा रही थीजर्मनी द्वारा Zelles और उनके सहयोगियों ने 25-26। प्रक्रिया के अपने संस्करण एक ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) स्तंभ के बजाय सिलिका संबंधी एसिड स्तंभ के अपने प्रयोग के लिए उल्लेखनीय था लेकिन, कुल मिलाकर, अधिक प्रयोगशाला था गहन।

Frostegård के पेपर 23, सफेद और Ringelberg 27 से विस्तृत कार्यप्रणाली के साथ-साथ, PLFA तकनीक के उपयोग के मृदा विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक सवालों की जांच करने में एक विस्फोट के लिए नींव प्रदान की है। और C19: तब से, फायरस्टोन और उनके सहयोगियों द्वारा विधि के आगे शोधन के एक आंतरिक जीसी मानक (0 C10): जोड़ने को शामिल किया है मात्रा का ठहराव 28 को सुधारने के लिए एक किराए की मानक के रूप में 0, और जुदा के उपयोग की जगह दौर नीचे शीशियों को सरल करने के लिए funnels निकासी 29। हाल ही में, चौधरी और डिक 30 मेथिलिकरण कदम की जांच की और दो ​​मेथिलिकरण मृदा विज्ञान साहित्य KOH / MeOH विधि अध्यक्ष में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की सूचना दी है किफैटी एसिड की एक बड़ी रेंज वर्गीकृत।

प्रस्तुत विधि काफी हद तक Bligh और डायर द्वारा विकसित मूल पद्धति पर आधारित है, और इस तरह के कदम के लिए मेथिलिकरण methanolic KOH के उपयोग के रूप में संशोधनों से ऊपर उल्लेख किया है, को शामिल किया गया है। दो मानकों प्रत्येक नमूना के लिए उपयोग किया जाता है, जो मिट्टी नमूना पहले निकासी के लिए पहले से जोड़ा जाता है 1,2-dinonadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (: 0/19 0) पीसी (19) की एक किराए की मानक दक्षता और पूरे प्रोटोकॉल की वसूली, और मिथाइल decanoate का एक साधन मानक आकलन करने के लिए (MeC10: 0) है, जो जीसी द्वारा की पहचान और मात्रा का ठहराव करने से पहले जोड़ा जाता है।

हम स्वीकार करते हैं कि PLFA विधि आमतौर पर दुनिया भर में कई माइक्रोबियल पारिस्थितिकी प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जाता है, और कई बार दर्ज किया गया है, मानकीकरण 2 के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन द्वारा भी शामिल है। इस पत्र का उद्देश्य एक आसान पालन करने के लिए और मजबूत प्रोटोकॉल है कि मिट्टी के लिए उपयोगी हो सकता है पेश करने के लिए हैवैज्ञानिकों ने PLFA तकनीक सीखने की कोशिश कर रहे हैं।

Protocol

नोट: हमेशा कि उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) सुनिश्चित प्रोटोकॉल भर में पहना जाता है। कांच के बने पदार्थ हाथों से छुआ नहीं होना चाहिए। उंगलियों, बाल, तेल, तेल और हाइड्रोकार्बन से लिपिड सभी संभावित contaminants हैं। हमेशा जब स्वच्छ कांच के बने पदार्थ से निपटने के 70% शराब के साथ nitrile दस्ताने और कुल्ला दस्ताने पहनते हैं।

विश्लेषण के लिए कांच के बने पदार्थ की 1. तैयारी

  1. डिस्पोजेबल कांच के बने पदार्थ (जैसे, अपकेंद्रित्र ट्यूब)
    1. 450 डिग्री सेल्सियस पर साढ़े चार घंटे के लिए ओढ़ना भट्ठी में एल्यूमीनियम पन्नी और गर्मी में लपेटें।
  2. Polytetrafluoroethylene (PTFE) टोपियां -lined
    1. फॉस्फेट डिटर्जेंट में एक घंटे के लिए भिगो दें टोपियां, और फिर गर्म पानी और डिटर्जेंट फॉस्फेट में झाड़ू से धो लें। नल के पानी से साबुन से कुल्ला।
    2. एसिड स्नान में रखें (5% एचसीएल) एक घंटे के लिए केवल (अब लाइनर्स टोपियां, तो वे भी लंबे समय के लिए भिगो कर रहे हैं से बाहर गिर सकता है के रूप में नहीं छोड़ते। कुल्ला तीन बारनल के पानी में। आसुत जल में तीन बार कुल्ला। 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सूखी।
  3. पुन: प्रयोज्य कांच के बने पदार्थ (जैसे, 10 मिलीलीटर, 15 मिलीलीटर, 45 मिलीलीटर की शीशियों / जार)
    1. गर्म पानी और डिटर्जेंट फॉस्फेट में झाड़ू से धो लें। नल के पानी और एसिड स्नान (5% एचसीएल) रात भर में जगह के साथ साबुन से कुल्ला। नल के पानी में तीन बार कुल्ला, तो 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में आसुत जल में तीन बार और फिर सूखी कुल्ला।
    2. साफ एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें (50 मिलीलीटर जार व्यक्तिगत रूप से लिपटे रहे हैं और अन्य कांच के बने पदार्थ का नमूना बैचों में लपेटा जाता है, जैसे, 20) और 450 डिग्री सेल्सियस पर साढ़े चार घंटे के लिए ओढ़ना भट्ठी में गर्मी।
  4. बड़ा कांच के बने पदार्थ (जैसे, फ्लास्क)
    1. गर्म पानी और डिटर्जेंट फॉस्फेट में झाड़ू से धो लें। नल के पानी और एसिड स्नान (5% एचसीएल) रात भर में जगह के साथ साबुन से कुल्ला। नल के पानी में तीन बार कुल्ला, आसुत जल में तीन बार कुल्ला, और फिर 40 और पर ओवन में सूखी# 186; सी।
    2. ओढ़ना भट्ठी में बड़ा कांच के बने पदार्थ डाल नहीं है - विलायक की एक छोटी राशि (जैसे, मेथनॉल) के साथ 3 बार कुल्ला उपयोग करने से पहले।

2. संग्रह और मिट्टी के नमूने के प्रसंस्करण से पहले PLFA विश्लेषण करने के लिए

  1. बाँझ बैग में मिट्टी के नमूने एकत्र, और जब तक इन तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है, उन्हें जितनी जल्दी हो सके फ्रीज। फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) तैयार है जब तक में स्टोर नमूने नमूनों की फ्रीज सुखाने के साथ आगे बढ़ने के लिए। फ्रीज ड्रायर के निर्देशों का पालन नमूने की सूखी बैचों रुक।
  2. नया लेबल बाँझ बैग करने के लिए प्रत्येक फ्रीज सूखे नमूना हस्तांतरण। बाहर PLFA निकासी के लिए पूर्व लेबल दबी अपकेंद्रित्र ट्यूब में बैग में फ्रीज सूखे माल से नमूना वजन।
    नोट: एक सामान्य दिशानिर्देश कार्बनिक पदार्थों (कार्बन सामग्री> 17% WT) के लिए और खनिज मिट्टी के नमूने के लिए 3.0 ग्राम तक 0.5 ग्राम का उपयोग करने के लिए है। प्रत्येक नमूना के लिए रिकार्ड नमूना वजन।
  3. हर 10 नमूने के लिए, यह भी एक बाहर का वजनअतिरिक्त डुप्लीकेट विश्लेषण के लिए, और हर 20 नमूने के लिए शामिल एक खाली (यानी, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब है कि इसमें किसी भी नमूना नहीं है - PLFA निकालने की प्रक्रिया के दौरान किसी भी संभावित संदूषण की पहचान करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है)। एक ही समय में नमूना ट्यूब की प्रक्रिया बैचों।
    नोट: 20 नमूनों का एक सेट 23 नमूना ट्यूबों के एक बैच के अनुरूप होगा (नमूने 1 से 10, नमूना 10 में से एक डुप्लिकेट, नमूने 12 से 22, नमूना 22 में से एक डुप्लिकेट, और एक खाली = 23 नमूना ट्यूबों के बैच)।
    नोट: आचरण निकासी, तो जुदाई, तो मेथिलिकरण नमूने के बैच में उन्हें जीसी विश्लेषण के लिए तैयार करने और उन सब को एक साथ चलाने से पहले। इस की पहचान करने के लिए कुछ भी गलत हो जाता है, जहां गलतियों हुआ है, और आवश्यक दोहराने एक्सट्रेक्शन की संख्या कम करने में मदद कर सकते हैं मदद करता है।

3. PLFA तकनीक (कदम एक समय में अलग-अलग नमूना लेकिन पूरा एक पूरे बैच के लिए कर रहे हैं)

नोट: PLFA तकनीक के सभी चरणों के चरणों में वर्णित1-3 नीचे उपयुक्त पीपीई का उपयोग कर और प्रयोगशाला सुरक्षा दिशा निर्देशों का पालन एक धूआं हुड में आयोजित किया जाना चाहिए।

  1. निष्कर्षण (चरण 1):
    1. आसुत 50 मिलीलीटर में KOH के 14 जी, विआयनीकृत पानी (DH 2 हे) भंग द्वारा 5.0 एम KOH तैयार करें।
    2. DH 2 ओ की 400 मिलीलीटर में 31.52 छ साइट्रिक एसिड Monohydrate भंग द्वारा 0.15 मीटर साइट्रेट बफर तैयार 5.0 एम KOH जोड़कर पीएच 4.00 ± 0.02 करने के लिए समायोजित; लगभग 5.0 एम KOH के 45-50 मिलीलीटर 4.00 पीएच को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। जब पीएच निकाला जाता है, एक बड़ा फ्लास्क का उपयोग कर 1000 मिलीलीटर के लिए साइट्रेट बफर पतला। रेफ्रिजरेटर जब उपयोग में नहीं है (अप करने के लिए एक महीने के लिए) में साइट्रेट बफर स्टोर।
    3. nonadecanoate किराए की मानक (इस 23 नमूनों में से एक बैच के लिए पर्याप्त किराए की मानक प्रदान करता है) 25 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में शेयर समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) के 250 μl गिराए द्वारा पीसी (: 0/19 0 19) दैनिक तैयार करें। पीसी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें (19: 0/19: 0) नमूना अपकेंद्रित्र ट्यूब किराए की मानक समाधान।
    4. एइस क्रम में मिट्टी के नमूने लिए Bligh और डायर निकासी DD: i) 2.0 मिलीलीटर साइट्रेट बफर, द्वितीय) 2.5 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म, और तृतीय) 5.0 मिलीलीटर मेथनॉल। 30 सेकंड के लिए एक PTFE लाइन टोपी और भंवर के साथ टोपी नमूना; 2 घंटे के लिए अंत से अधिक अंत प्रकार के बरतन में जगह है।
    5. पर टोपी के साथ 15 मिनट के लिए 226 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला एक पाश्चर विंदुक और एक लेबल 45 मिलीलीटर कांच की शीशी के लिए स्थानांतरण के साथ बंद ड्रा।
    6. Bligh और डायर निकासी के दूसरे दौर के प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें, और उपरोक्त कदम 4 और 5 दोहराएँ। सतह पर तैरनेवाला एक पाश्चर विंदुक और एक ही लेबल 45 मिलीलीटर कांच की शीशी के लिए स्थानांतरण के साथ बंद ड्रा।
    7. लेबल 45 मिलीलीटर कांच की शीशी युक्त सतह पर तैरनेवाला में जोड़ें: i) 5.0 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म, और द्वितीय) 5.0 मिलीलीटर साइट्रेट बफर। सफेद PTFE लाइन टोपी और भंवर गिलास के साथ कैप 30 सेकंड के लिए शीशी। यह अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर बैठ (ऑक्सीकरण से बचने के लिए) करते हैं।
    8. ध्यान से 45 मिलीलीटर शीशी के ऊपरी जलीय चरण (यदि कोई वैक्यूम उपलब्ध है, पिपेट aque के माध्यम से कम किया जाना चाहिए बंद वैक्यूमजब जैविक चरण pipetting ous चरण बहुत ही सावधानी के रूप में पिपेट में किसी भी जमा नहीं करने के लिए)। लेबल 15 मिलीलीटर की शीशी में पिपेट कम जैविक चरण।
    9. 15 मिलीलीटर की शीशियों के प्लेस बैच संकुचित एन 2 (ऑक्सीकरण से बचने के लिए) के तहत कमरे के तापमान पर। क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना धीरे धीरे बंद, शीशी में तरल की सतह व्याकुल लेकिन शीशी के पक्ष नहीं चढ़ एन 2 प्रवाह की स्थापना।
    10. -20 में फ्रीजर में PTFE लाइन टोपी और दुकान के नमूने पर भाड़ डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम पन्नी (बजाय अलग-अलग बैचों में लपेटो) तैयार है जब तक में लिपटे चरण 2 के साथ आगे बढ़ना।
  2. लिपिड विभाजन (चरण 2)
    1. कांच टैंक पर spigots के साथ विशेष स्तंभ धारक रखें। spigots में नए विशेष कॉलम (सिलिका, 500 एमजी, 6 मिलीग्राम) डालें। के रूप में आवश्यक लेबल कॉलम (नमूने मिश्रण से बचने के लिए अनुशंसित)।
    2. एसीटोन के 5 मिलीलीटर जोड़ने और यह बताने के माध्यम से पलायन करके प्रत्येक स्तंभ की स्थिति, और फिर 5 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म के दो अतिरिक्त जोड़ने (कुल मात्रा = 10 मिलीलीटर)। दूसरी क्लोरोफॉर्म धोने मिलाना ऊपर ~ 1 मिमी बाहर प्रवाह करने के लिए और उसके बाद पानी की कल बंद की अनुमति दें।
    3. शीशी और धीरे भंवर 0.5 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़कर नमूना (चरण 1 के अंत में 15 मिलीलीटर की शीशी में संग्रहित) फिर से भंग। स्थानांतरण फिर से भंग कर एक पाश्चर विंदुक का उपयोग विशेष स्तंभ के लिए नमूना; 2 स्थानान्तरण की कुल (नमूना प्रति 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म की कुल स्थानांतरण मात्रा) के लिए दोहराएँ।
    4. लिपिड नमूना स्तंभ के केंद्र में सीधे लेट गया और टैंक में पूरी तरह से पलायन करने के लिए विलायक अनुमति देते हैं।
    5. प्रत्येक स्तंभ के लिए क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर जोड़कर तटस्थ लिपिड Elute। टैंक में पूरी तरह से पलायन करने के लिए विलायक अनुमति दें।
    6. प्रत्येक स्तंभ के लिए एसीटोन के 5 मिलीलीटर जोड़कर glycolipids Elute। संग्रह टैंक में पूरी तरह से पलायन करने के लिए विलायक अनुमति दें।
    7. हटाये स्तंभ टैंक से खड़े हैं और निर्वात उपकरण के साथ टैंक नाली। टैंक में स्वच्छ और लेबल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के साथ रैक डालें। स्तंभ की टंकी पर खड़े जगह; लेबल स्तंभ के ऊपर लेबल centr के साथ अप लाइन चाहिएनीचे ifuge ट्यूब।
    8. प्रत्येक स्तंभ के लिए मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़कर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में फॉस्फोलिपिड Elute। उनमें से निपटान से पहले धूआं हुड में बाहर सुखाने के लिए विशेष कॉलम के लिए प्रतीक्षा करें। संकुचित एन 2 के तहत कमरे के तापमान पर सूखी नीचे फॉस्फोलिपिड अंशों।
    9. -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में PTFE लाइन टोपी और दुकान के नमूने पर एन 2. पेंच के साथ शुद्ध नलियों एल्यूमीनियम पन्नी (बजाय अलग-अलग बैचों में लपेटो) तैयार है जब तक में लिपटे चरण 3 के लिए आगे बढ़ना।
  3. लिपिड मेथिलिकरण (चरण 3)।
    1. गर्म पानी से स्नान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पर मुड़ें। 1000 मिलीलीटर DH 2 हे में 57.1 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड भंग एक 1000 मिलीलीटर फ्लास्क का उपयोग करके 1M एसिटिक एसिड (यदि पहले से ही बनाया नहीं) तैयार करें। यह समाधान करने के लिए तीन महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है। ।
    2. methanolic KOH के बैच तैयार करें। 40 मिलीलीटर मेथनॉल में 0.45 छ KOH भंग द्वारा 0.2 एम KOH समाधान तैयार है। एक के अनुसार KOH की मात्रा समायोजित करें और मेथनॉलचरण 3. दैनिक इस समाधान तैयार करने में nticipated बैच आकार; लंबी अवधि के लिए दुकान नहीं है।
    3. फ्रीजर से नमूने निकालें (चरण 2 के बाद संग्रहित अपकेंद्रित्र ट्यूब में) और नमूने कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं। 0.5 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म और प्रत्येक नमूने के लिए 0.5 मिलीलीटर मेथनॉल, 1.0 मिलीग्राम KOH methanolic के द्वारा पीछा जोड़ें। कैप नलियों PTFE लाइन टोपी के साथ कसकर। मिश्रण करने के भंवर।
    4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के स्नान में सीलबंद नमूने रखें। सुनिश्चित करें कि जल स्तर नमूना तरल के स्तर से ऊपर 1-2 मिमी की एक न्यूनतम है। निकालें और नमूने शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। नमूने नहाने के पानी में हैं, नमूना आईडी (PTFE लाइन टोपी के साथ 10 मिलीलीटर कांच की शीशी) के साथ छोटे कांच की शीशियों लेबल।
    5. प्रत्येक नमूना और चक्कर आने के लिए 2.0 मिलीलीटर हेक्सेन जोड़ें। फिर एक नमूना और फिर मिश्रण को चक्कर आने के लिए 1.0 एम एसिटिक एसिड के 0.2 मिलीलीटर जोड़ने; चरण जुदाई दिखाई देने लगते हैं चाहिए।
    6. चरण तोड़ने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए DH 2 हे के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें। 30 सेकंड के लिए भंवर नमूने हैं। 2 मिनट के लिए 226 XG पर फिर सेंट्रीफ्यूज नमूने हैं।
    7. का प्रयोगलघु पाश्चर विंदुक, हस्तांतरण शीर्ष चरण 10 मिलीलीटर की शीशियों लेबल साफ। कम (जलीय) चरण के किसी भी हस्तांतरण करने के लिए सावधान रहें।
    8. प्रत्येक नमूना अपकेंद्रित्र ट्यूब और चक्कर आने के लिए 2.0 मिलीलीटर हेक्सेन जोड़ें। 30 सेकंड के लिए भंवर नमूने हैं। 2 मिनट के लिए 226 XG पर फिर सेंट्रीफ्यूज नमूने हैं।
    9. लघु पाश्चर विंदुक का प्रयोग, फिर लेबल 10 मिलीलीटर कांच की शीशी को शीर्ष चरण जोड़ें।
    10. एन 2 के तहत लेबल-10 मिलीलीटर कांच की शीशी में कमरे के तापमान पर विलायक लुप्त हो जाना। -20 में फ्रीजर में PTFE लाइन टोपी और दुकान के नमूने पर भाड़ डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम पन्नी (बजाय अलग-अलग बैचों में लपेटो) जीसी विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार है जब तक में लपेटा। सभी नमूनों लेबल करने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. गैस chromatograph (जीसी) विश्लेषण
    नोट: पहचान और व्यक्तिगत PLFAs की मात्रा का ठहराव एक जीसी या तो एक खूंटी या एमएस डिटेक्टर से जुड़ा का उपयोग कर पूरा किया है। नीचे दिए गए निर्देशों जीसी खूंटी के लिए कर रहे हैं, नमूना तैयार जीसी एमएस के लिए मान्य होगा w के रूप मेंपक्ष। प्रारंभिक तापमान 190 डिग्री सेल्सियस, रैंप 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट 285 डिग्री सेल्सियस के लिए: एक जीसी खूंटी प्रणाली के लिए एक उदाहरण स्थापित-अप × 0.33 माइक्रोन (5% -phenyl) निम्न तापमान प्रोटोकॉल के साथ -methylpolysiloxane स्तंभ × 0.2 मिमी एक 25 मीटर में शामिल होगा 9.5 मिनट पकड़, रैंप 60 डिग्री सेल्सियस / मिनट 310 डिग्री सेल्सियस के लिए, 0.42 मिनट 31 पकड़ो।
    1. MeC10 की एक बूंद जोड़कर जीसी आंतरिक मानक (ISTD) तैयार: 100 मिलीलीटर हेक्सेन 0 (मिथाइल decanoate) (रिकॉर्ड 0.1 मिलीग्राम के लिए वजन जोड़ा)। जीसी गैसों चालू करें और फिर जीसी पर बारी। सुनिश्चित करें कि एच 2, एन 2 और हवा सिलेंडरों खुला और वहाँ विश्लेषण चलाने के लिए पर्याप्त गैस है कि कर रहे हैं बनाओ (एच 2 500 साई नीचे कभी नहीं मिलना चाहिए)।
    2. चेक एक अच्छा अंशांकन की शर्तों अंशांकन फैटी एसिड का एक मिश्रण, एक हेक्सेन खाली द्वारा पीछा किया युक्त मानकों चल रहा से मुलाकात कर रहे हैं। व्यक्तिगत फैटी एसिड की पहचान मैन्युअल मानकों के लिए प्राप्त प्रतिधारण समय के साथ तुलना के आधार पर सौंपा जा सकता है, या इस Automatica हो सकता हैlly व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 31 सौंपा। सभी मामलों में, स्पष्ट पहचान एक एमएस डिटेक्टर 2 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।
      नोट: एक अच्छा अंशांकन के अतिरिक्त संकेत एक फ्लैट आधारभूत और हेक्सेन कुल्ला में कोई संदूषण शामिल हैं।
    3. प्रत्येक PLFA नमूना अवशेषों ISTD समाधान के 150 μl में (लिपिड मेथिलिकरण चरण 3 से 10 मिलीलीटर कांच की शीशी में निहित) को भंग करने और जीसी शीशी में स्थानांतरण (वैकल्पिक रूप से 50 से 75 μl का उपयोग करता है, तो नमूना प्रतिक्रिया ऐसे बहुत के रूप में कमजोर होने का अनुमान है रेतीली मिट्टी)।
    4. 2 μl के लिए नमूना इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करें। 300 डिग्री सेल्सियस के लिए खूंटी तापमान सेट करें। वाहक गैस (प्रवाह की दर 1.3 मिलीग्राम / मिनट) और 30 के एक विभाजन अनुपात के रूप में एच 2 के साथ 250 डिग्री सेल्सियस के एक इनलेट तापमान का उपयोग कर नमूने भागो,: 1।

Representative Results

फैटी एसिड होता है एक्स के रूप में नामित कर रहे हैं: YωZ, जहां एक्स कार्बन परमाणुओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, वाई डबल बांड की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और जेड अणु की स्निग्ध (ω) अंत से पहले डबल बांड की स्थिति को इंगित करता है। प्रत्यय 'सी' और 'टी' सीआईएस और ट्रांस isomers ज्यामितीय संकेत मिलता है। उपसर्गों और प्रत्ययों 'ए' और 'मैं' anteiso करने और आईएसओ मेरे शाखाओं में बंटी और और ओह मिथाइल समूहों और हाइड्रॉक्सिल समूहों, क्रमशः निर्दिष्ट देखें।

पोस्ट-जीसी रन, जाँच करें कि नमूनों में 10 तलाश द्वारा पर्याप्त ISTD प्राप्त: 0 शिखर। इसके अलावा जीसी मानकों की प्रतिक्रिया की जांच, यानी, शीशियों जोड़ा ISTD समाधान के साथ हेक्सेन युक्त; ये कोई अन्य चोटियों होनी चाहिए। आंतरिक मानक प्रतिक्रिया सभी रन भर में समान होना चाहिए।

चित्रा 1 एक प्रतिनिधि को प्रस्तुत करता हैसक्रिय नमूना रन। बड़े हेक्सेन विलायक शिखर विशेषता से एक अवधारण समय (आरटी) 1.8 मिनट के आसपास में प्रकट होता है। ISTD मानक शिखर (C10: 0), 3.4 मिनट की एक आरटी पर प्रकट होता है, जबकि C19: 0 16.2 मिनट की एक आरटी है। जीसी विश्लेषण उनकी श्रृंखला लंबाई, अब चेन और धीरे धीरे एल्यूटिंग के साथ के आधार पर PLFAs अलग करता है; उदाहरण के लिए, C18: 0 14.4 मिनट जबकि C16 पर elutes: 0 10.8 मिनट पर elutes। इसके अलावा, इस विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल unsaturation और उनके डबल बांड की स्थिति के अपने डिग्री के आधार पर PLFAs अलग नहीं कर सकता; उदाहरण के लिए, C18: 0, 14.4 मिनट पर elutes जबकि C18: 1 9c, और C18: 14.0 पर 1 7c Elute और 14.1 मिनट में क्रमश: (चित्रा 1)। अन्त में, समान श्रृंखला लंबाई और संतृप्ति लेकिन विभिन्न शाखाओं में बंटी विन्यास (anteiso बनाम आईएसओ) के PLFAs अलग किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, C15: 0i और C15: 8.6 और 8.7 मिनट में क्रमश: 0A Elute (चित्रा 1)।

अलग जीसी चोटियों के क्षेत्रों im हो सकता हैएक स्प्रेडशीट आगे गैस chromatogram जानकारी प्रक्रिया में रखी। प्रत्येक पहचान PLFA मात्रा निर्धारित है (nmol ग्राम सूखी मिट्टी की -1) निम्न समीकरण का उपयोग:

1 समीकरण

जहां एफ एक समायोजन कारक है कि खाते खूंटी चयनात्मकता और फैटी एसिड 32 के बीच मतभेद molarity में ले जाता है, areaPLFA प्रत्येक पहचान PLFA, areaC10 के लिए शिखर क्षेत्र है: 0 ISTD के लिए शिखर क्षेत्र है (MeC10: 0), C10: 0 एसटीडी जोड़ा ISTD (nmol) की राशि जीसी रन करने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा है, अनुपात (C19: 0 एसटीडी जोड़ा / C19: 0 नमूना) पीसी की वसूली से मेल खाती है (C19: 0 / C19: ओ) किराए की मानक, और नमूना वजन ओवन में सुखा मिट्टी (G) की राशि मूल नमूना अपकेंद्रित्र ट्यूब को जोड़ा गया और PLFAs निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है।

नोट: विभिन्न क्षेत्रों के तहतNT चोटियों शिखर क्षेत्रों, प्रतिक्रिया या% प्रतिक्रिया जीसी सिस्टम के आधार पर के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सीमा मिट्टी PLFA लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक के भीतर, क्षेत्रों रैखिक फैटी एसिड का वजन करने के लिए आनुपातिक माना जा सकता है; वैकल्पिक रूप से, छोटे सुधार कारकों खूंटी चयनात्मकता 32 के लिए खाते के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, क्योंकि परिणामों शुरू में एक प्रतिशत वजन के आधार पर व्यक्त कर रहे हैं, वे दाढ़ मात्रा में उपज के लिए सामान्यीकृत किए जाने की जरूरत है। molarity मतभेद खाते में व्यक्तिगत फैटी एसिड की आणविक भार लेने के द्वारा हासिल की है के लिए समायोजन; प्रकाशित टेबल 32 और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर 31 भी जब molarity के लिए सामान्य बनाने में मदद करने के लिए उपलब्ध हैं।

ISTD (nmol) की राशि प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा आगे के रूप में गणना की जा सकती है:

C10: 0std वी × = [ISTD] जोड़ा (एसटीडी) जोड़ा

[ISTD] एकाग्रता (nmol एल -1) MeC10 की है: 0 (मिथाइल decanoate) हेक्सेन में भंग (चरण 3.4.1 देखें), और वी (एसटीडी) जोड़ा मात्रा है तैयार ISTD समाधान के (एल) जीसी रन करने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा (यानी, 150 μl 3.4.4 कदम के अनुसार)।

C19 की राशि: 0 (nmol) जीसी विश्लेषण के दौरान प्रत्येक नमूने में मौजूद से मेल खाती है:

2 समीकरण

जहां areaC19: 0 C19 के लिए शिखर क्षेत्र है: हे, जबकि C19 की इसी राशि: 0 (nmol) (सीएफ चरण 3.1.3) PLFA निष्कर्षण विधि की शुरुआत में प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा गया है:

3 समीकरण

जहां [19: 0] एसटीडी (एमजी एल -1 (19 0 nonadecanoate किराए की मानक क्लोरोफॉर्म में भंग (चरण 3.1.3): 0 एसटीडी) जोड़ा गया है PLFA निकासी की शुरुआत में प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा तैयार किराए की मानक की मात्रा sup>) C19 की एकाग्रता है विधि (सीएफ चरण 3.1.3), एम 19: (: 0/19: पीसी (19 0)) 0 1,2-dinonadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine की आणविक वजन है।

नोट: C19 की एक तिल: 0 nonadecanoate किराए की मानक पैदावार C19 के दो मोल्स: 0 मेथिलिकरण कदम के बाद, जबकि C10: 0 मानक मेथिलिकरण के बाद कहा है।

निम्नलिखित PLFAs आम तौर पर मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों के विश्लेषण से बाहर रखा गया है: i) PLFAs कि <14 सी और> 20 लंबाई में सी कर रहे हैं, और ii) शिखर क्षेत्र में कुल की कम से कम 0.5% के साथ PLFAs। एक बार इन PLFAs बाहर रखा गया है, शेष PLFAs के सब से प्रतिक्रियाओं की कुल PLFA द्वि प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्त किया जा सकताoMass (nmol जी -1 सूखी मिट्टी की)। PLFA डेटा का विश्लेषण Univariate (जैसे, एनोवा, परीक्षण किया जा रहा है की मान्यताओं को पूरा करने के रूप में उपयुक्त डेटा परिवर्तन के बाद) की कुल PLFA बायोमास और / या नमूना समूहों / उपचार के बीच में चयनित समूहों के PLFA बायोमास तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, या तो मध्य श्रृंखला (10 मिथाइल) या टर्मिनल शाखाओं के साथ इस तरह सीधे-जंजीर संतृप्त PLFAs के रूप में विभिन्न PLFA समूहों, संतृप्त PLFAs के रिश्तेदार वितरण के लिए चित्रा 2 तोहफे परिणाम है, और पॉलीअनसेचुरेटेड PLFAs, साथ ही मोनो या कुल PLFAs का योग (nmol जी -1 सूखी मिट्टी की)। इस विशेष उदाहरण में, पेड़ (जो साइट 1 से 3 साइट करने के लिए कम हो जाती है) की उम्र दोनों कुल PLFAs और विभिन्न PLFA समूहों के रिश्तेदार वितरण को प्रभावित करने के लिए देखा जाता है।

नमूनों के बीच PLFA रचना में समग्र पैटर्न का मूल्यांकन करने के लिए, सभी PLFAs की बहुभिन्नरूपी विश्लेषण condu हो सकता है33 cted। PLFA डेटा सांख्यिकीय परीक्षण और अनुसंधान के सवाल की मान्यताओं को पूरा करने में संबोधित किया जा रहा है, जैसे, एक Hellinger परिवर्तन अक्सर डेटा relativize करने के लिए प्रयोग किया जाता है का चयन किया बहुभिन्नरूपी विश्लेषण करने से पहले आवश्यक के रूप में तब्दील हो जाने की जरूरत है। एक गैर से चित्रा 3 से पता चलता परिणाम एक ही डेटा है कि चित्रा 2 में इस्तेमाल किया गया -metric बहुआयामी स्केलिंग (NMDS) समन्वय; NMDS एक गैर पैरामीट्रिक, बहुभिन्नरूपी तकनीक है कि नमूने के बीच रैंकिंग अंकों के समानता के आधार पर डेटा बिंदुओं की 2 या 3 आयामी स्थिति पैदा करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि जीसी खूंटी वर्णलेख। एक खेती की जाती भूरा Chernozemic मिट्टी से प्राप्त एक नमूना इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। अवधारण बार और इसी PLFAs (कोष्ठक में) और उनके शिखर क्षेत्र (देहात) एकप्रतिनिधि चोटियों के लिए आंकड़ा पर संकेत कर रहे हैं। स्पष्टता के लिए, नहीं सभी चोटियों, चित्रा पर संकेत कर रहे हैं, हालांकि इस विशेष नमूना सामने आए 33 पहचान PLFAs। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. PLFAs (कुल PLFAs का%) के छह विभिन्न वर्गों के रिश्तेदार बहुतायत है, और कुल PLFA बायोमास (nmol जी -1 वन Luvisolic मिट्टी से सूखी मिट्टी की)। नमूने इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। परिणामों में साइट 1, जो पुराने पेड़ (> 50 वर्ष) के अंतर्गत स्थित है पर मिट्टी के लिए अधिक से अधिक कुल PLFAs, मध्यवर्ती आयु वर्ग (25 वर्ष) के बाद पेड़ (साइट 2) से संकेत मिलता है, और अंत में सबसे कम उम्र (10 वर्ष) पेड़ ( साइट 3)। अपेक्षाकृत अधिक संतृप्त PLFAs सबसे कम उम्र में मौजूद हैंसाइट है, जबकि अधिक असंतृप्त PLFAs सबसे पुराने स्थल पर मौजूद हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. गैर-मीट्रिक बहुआयामी स्केलिंग (NMDS) PLFAs के समन्वय कुल्हाड़ियों 2 और 3 आयामी समाधान के 3 के लिए (कुल PLFAs डेटा का% का उपयोग)। यह समन्वय चित्रा 2 के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में एक ही डेटा का उपयोग कर गणना की गई थी। The सबसे कम उम्र साइट (साइट 3) बड़े दो साइटों से बहुत स्पष्ट रूप से (साइटों 2 और 3) को अलग करती है, जो उनके PLFA माइक्रोबियल समुदाय संरचना में ओवरलैप दिखा। PLFA समुदाय डेटा प्रत्येक अक्ष कोष्ठकों में शामिल है के द्वारा समझाया में बदलाव की राशि; बदलाव की 72.5% एक 3-Dimen के लिए इन दो कुल्हाड़ियों द्वारा समझाया गया हैप्रखंड NMDS समाधान है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कम से कम और PLFA डेटा की गलत व्याख्या से बचने के लिए सावधान डेटा स्क्रीनिंग से किया जाना चाहिए, क्योंकि कुछ PLFAs कि मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय में पाए जाते हैं भी इस तरह के पौधे की जड़ों, शैवाल, और मिट्टी जानवरों के रूप में एकल और बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक जीवों में मौजूद हैं। इसके अलावा, आर्किया PLFAs शामिल नहीं है; इसके बजाय, अर्चेअल झिल्ली फॉस्फोलिपिड ईथर लिपिड (PLELs) के शामिल हैं। नतीजतन, PLFA प्रोटोकॉल मिट्टी में अर्चेअल समुदायों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

विशिष्ट माइक्रोबियल समूहों के लिए अलग-अलग PLFAs जोड़ सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए (PLFA विधि की सीमाओं से कुछ का एक उत्कृष्ट चर्चा के लिए Frostegård और उनके सहयोगियों 34 2011 प्रकाशन देखिए)। इसके बजाय, यह अधिक उपयुक्त हो सकता है के रूप में मध्य चाय के साथ उनकी रासायनिक संरचना के आधार पर चित्रा 2 में किया गया था, समूह PLFAs करने के लिए, उदाहरण के लिए, मैं) सीधे जंजीर संतृप्त PLFAs, द्वितीय) संतृप्त PLFAsn (10 मिथाइल) शाखाओं में बंटी, iii) टर्मिनली-branched संतृप्त फैटी एसिड होता है, iv) मोनोअनसैचुरेटेड PLFAs, वी) पॉलीअनसेचुरेटेड PLFAs, और vi) हाइड्रोक्सी फैटी एसिड होता है।

नमूना वजन एक दिया मिट्टी के नमूने में निहित निष्कर्षण PLFAs की मात्रा के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। कम microbially सक्रिय मिट्टी में निकाली गई मिट्टी की राशि नहीं समायोजित करके, उन PLFA प्रतिक्रियाओं (चोटियों) के लिए पर्याप्त संख्या में सही समग्र माइक्रोबियल समुदाय का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्राप्त नहीं होने का ख़तरा है। PLFAs की उच्च सांद्रता के साथ अत्यधिक microbially सक्रिय मिट्टी में, उपयोगकर्ताओं को जीसी स्तंभ ओवरलोडिंग, जिससे PLFAs की सही मात्रा का ठहराव को रोकने का खतरा होता है। दोनों ही मामलों में, मिट्टी के नमूने PLFAs के लिए फिर से विश्लेषण किया जाना चाहिए। एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु (जैसे वन फर्श के रूप में) कार्बनिक मिट्टी के नमूने के लिए 0.5 ग्राम, और खनिज मिट्टी के नमूने के लिए लगभग 3 जी जोड़ने के लिए है। चूंकि निष्कर्षण PLFAs की मात्रा आम तौर पर एक मिट्टी, नमूना हम में निहित कार्बनिक कार्बन की मात्रा को जोड़ा जाता हैight मिट्टी में कार्बन की मात्रा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, जैसे, खनिज मिट्टी के नमूने की 1 ग्राम, एक अच्छा PLFA मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए जब कार्बन की मात्रा 10-15% है पर्याप्त हो सकता है, जबकि> 5 ग्राम आवश्यक हो सकता है यदि कार्बन की मात्रा 0.5 ≤ है %। यह हमेशा से पहले पूरे सेट चलाया जाता है नमूना वजन अनुकूलन करने के लिए कुछ नमूने के साथ एक परीक्षण चलाने के लिए एक अच्छा विचार है।

PLFA प्रोटोकॉल और जीसी विश्लेषण के लिए आम समस्या निवारण रणनीतियों इस प्रकार हैं। जीसी वर्णलेख आधारभूत बहुत अधिक है, एच 2 गैस सिलेंडर बदला जाना चाहिए। विलायक या ISTD चोटियों वर्णलेख से याद कर रहे हैं, वहाँ नमूना इंजेक्शन के साथ एक समस्या हो सकती है (जैसे, सिरिंज, autosampler के साथ समस्या है, खाली शीशी या लापता, शीशी स्थिति के साथ त्रुटि खामियों को दूर किया)। तीन से अधिक चोटियों विधि / नमूना रिक्त में पता चला रहे हैं, तो वहां के प्रदूषण खाली है, और वहाँ एक उच्च संभावना है कि एक ही प्रदूषक (s) नमूना जीसी ग में उपस्थित होना होगाhromatograms। प्रदूषण का स्रोत (आमतौर पर जलीय मीडिया) का पता लगाएं, या बहुत कम से कम, यह सुनिश्चित करें कि चोटियों दूषित पदार्थों को इसी नमूना chromatograms से और है कि इन चोटियों PLFA डेटा के किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण में शामिल नहीं हैं हटा रहे हैं। इसके अलावा, यह एक अच्छा विचार हेक्सेन नमूनों के बीच rinses जब कैरी ओवर संदेह है चलाने के लिए है। हेक्सेन कुल्ला में अतिरिक्त चोटियों कैरी ओवर (यानी, भारी घटकों पिछले रन से एल्यूटिंग) का संकेत होगा।

लिपिड विशेष रूप से ऑक्सीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और विशेष रूप से ध्यान में इस तरह उन्हें अंधेरे में भंडारण और उन्हें नाइट्रोजन के तहत रखने के रूप में हवा और प्रकाश जोखिम से नमूने, की रक्षा के लिए प्रोटोकॉल भर में प्रयोग किया जाना चाहिए। 0 सरोगेट मानक: सभी नमूनों और कारतूस पर्याप्त C19 होना चाहिए। एक लापता C19: 0 शिखर, या तो नमूने या रिक्त स्थान, एक गरीब वसूली या analytes का एक पूरा नुकसान इंगित करता है। नमूनों में 0 कि मीटर की तुलना में काफी कम है: C19 की प्रतिक्रियाethod / नमूना कारतूस PLFA कार्यप्रणाली में कुछ बिंदु पर analytes की एक नुकसान इंगित करता है। जब गरीब C19 के साथ सामना: 0 वसूली, प्रक्रिया के सभी पहलुओं को ध्यान से विचार किया जाना है और प्रारंभिक निकासी, नमूना हस्तांतरण के सभी चरणों, विशेष निकासी, फैटी एसिड मेथिलिकरण, सुखाने, भंडारण और नमूना हेरफेर आदेश को अलग करने में शामिल की जांच की मंच या चरणों जहां analytes खो रहे हैं। दूसरी ओर, यह हो सकता है कि कुछ मिट्टी के नमूने की निकासी उपज हो सकती C19: 0, जिसमें किराए की मानक के मामले वसूली overestimated जा सकता है। दो मानकों का प्रयोग करते हुए ((पीसी (19: 0/19: 0) और MeC10: 0) नहीं एक परम आवश्यकता है, हम इस मिल गया है जब समस्याओं का निवारण करने की आवश्यकता होगी, बहुत उपयोगी हो सकता है जब तक MeC10 के रूप में:। 0 प्रतिक्रिया पर्याप्त है , समस्या निवारण चरणों जीसी विश्लेषण करने से पहले पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं।

जैसा कि पहले उल्लेख, सावधानी जब पूरी तरह बायोमार्कर निकाले जाते हैं पर आधारित पारिस्थितिक महत्व और पारिस्थितिकी तंत्र के रिश्तों की व्याख्या इस्तेमाल किया जाना चाहिएPLFA डेटा से डी, क्योंकि शुद्ध संस्कृति के अध्ययन से पता चलता है कि पृथक जीवाणु उपभेदों PLFAs की विभिन्न श्रेणियों में शामिल होंगे। इसके बजाय, बायोमार्कर PLFAs जब व्यापक पारिस्थितिक inferences बनाने सबूत का एक सूट में एक उपयोगी इसके अतिरिक्त के रूप में देखा जाना चाहिए। साहित्य में, अलग-अलग PLFAs प्रस्ताव किया है और विभिन्न समूहों के लिए माइक्रोबियल बायोमार्कर के रूप में उपयोग किया गया है। संतृप्त PLFAs आम तौर पर ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया और PLFA मोनोअनसैचुरेटेड ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए किया जाता है। 1ω7, C18: 1ω7, और C18: ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए मान्यता प्राप्त बायोमार्कर ऐसे C16 के रूप में ω5 या ω7 स्थिति, पर unsaturation साथ मोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड शामिल 1ω5। इसके अलावा, cyclopropyl फैटी एसिड भी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 35 का प्रतिनिधि हो सकता है। 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo इसलिए, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से PLFAs की राशि के बराबर के रूप में गणना की जा सकती है। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के लिए मान्यता प्राप्त बायोमार्कर टर्मिनली SA branched रहे हैंturated फैटी एसिड होता है, आईएसओ branched C15 जैसे: 0i, C16: 0i, C17: 0i; 0A और C17: 0A या ऐसे C15 के रूप में, anteiso-branched। मध्य श्रृंखला (10 मिथाइल) शाखाओं में बंटी के साथ संतृप्त PLFAs, जैसे 10Me16: 0 और 10Me18: 0 actinomycetes 36 में विशेषता से मौजूद हैं। इस प्रकार, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया से PLFAs एक की राशि के रूप में बराबर की गणना की जा सकती है: 0 (आईएसओ, ANTEISO, 10-मिथाइल)।

फंगल PLFA के साथ जुड़े कई बायोमार्कर अक्सर पॉलीअनसेचुरेटेड कर रहे हैं, लेकिन कुछ कवक बायोमार्कर मोनोअनसैचुरेटेड रहे हैं। उदाहरण के लिए, फंगल monounsaturated बायोमार्कर के मामले में, C16: 1ω5 arbuscular मायकोरिजल कवक का सूचक (AMF) 37, C18 के रूप में पहचान की गई है: 1ω9 saprophytic कवक में आम है, और आम तौर पर ectomycorrhizae C16 होते हैं: 1ω9। के DI-असंतृप्त C18 उपस्थिति: 2ω6,9 अक्सर C18 के साथ संयोजन के रूप में होता है: 1ω9 और भी फंगल sterol ergosterol, जो इंगित करता है कि C18 के साथ अच्छी तरह से संबद्ध: 2ω6,9 पर्याप्त रूप से प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ectomycorrhizae और saprophytic कवक 38। त्रि-असंतृप्त C18: 3ω 6,9,12 भी कवक 10 के लिए एक बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, C18: 3ω6c पौधों और शैवाल सहित अन्य यूकेरियोटिक जीवों में पाया जा सकता है, हालांकि यह आमतौर पर बैक्टीरिया में नहीं पाया जाता है। मिट्टी प्रोटिस्टों की अवधि में, C20: 4ω6c, एक protist बायोमार्कर 39 के रूप में स्वीकार किया गया है, हालांकि, अन्य काम C20 पता लगाने में विफल: 4ω6c भी जब व्यवहार्य protist आबादी नेत्रहीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी 40 का उपयोग कर पुष्टि की गई।

कई अध्ययनों से एक PLFA डेटा विश्लेषण उपकरण के रूप में बहुभिन्नरूपी समन्वय तकनीक का उपयोग करके समग्र मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय से संबंधित सवालों को संबोधित पारिस्थितिक। इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, कुछ लेखकों PLFAs कि नमूने 4 कम से कम 5% में मौजूद हैं हटाने के द्वारा डाटासेट से दुर्लभ PLFAs बाहर करने के लिए चुना है। सामान्य संतृप्त C16: 0 और C18: 0 सभी मिट्टी सूक्ष्मजीवों में प्रचुर मात्रा में हैं, prokaryotes और euk सहितaryotes। इसलिए, कुछ शोधकर्ताओं का आधार यह है कि वे मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय की रचना की संवेदनशील संकेतक नहीं हो सकता है पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने से पहले इन PLFAs को दूर करने के लिए चुन - हालांकि C16: 0 और C18: 0 अभी भी कर रहे हैं जब सभी के लिए PLFAs संक्षेप शामिल होने के लिए माइक्रोबियल बायोमास की एक सूची। सांख्यिकीय विश्लेषण की अवधि में, कई शोधकर्ताओं के रूप में इस तकनीक को अच्छी तरह से डेटा है कि सामान्य रूप से 33 से वितरित नहीं किया जा सकता है के लिए अनुकूल है एक गैर मीट्रिक बहुआयामी स्केलिंग (NMDS) समन्वय का संचालन करने के लिए चुनते हैं। स्पष्ट चर से संबंधित अतिरिक्त विश्लेषण सूचक प्रजातियों विश्लेषण है, जो स्पष्ट समूहों और बहु ​​प्रतिक्रिया क्रमचय प्रक्रियाओं (MRPP) के लिए विशिष्ट PLFAs, जो समानताएं या मतभेद का निर्धारण स्पष्ट समूहों को सौंपा माइक्रोबियल समुदायों के बीच मदद कर सकते हैं की घटना से संबंधित कर सकते शामिल कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, बहुभिन्नरूपी प्रतिगमन पेड़ (एमआरटी) विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब कई प्रयोगात्मक चर के प्रभाव याउपचार के संभावित व्याख्यात्मक चर 5 के रूप में मूल्यांकन करने की जरूरत है (जैसे, मिट्टी की बनावट, नमी, उद्धार उम्र)।

एक बार स्थापित, PLFA प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत सरल विश्लेषणात्मक विधि है कि बहुत उपयोगी हो सकता है जब पर्यावरण परिवर्तन और मानवीय अशांति के लिए मिट्टी माइक्रोबियल प्रतिक्रिया बढ़ाता है। हालांकि ऐसे आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के रूप में आणविक तकनीक बेहतर माइक्रोबियल समुदायों की विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल हैं, PLFA विधि कुल माइक्रोबियल बायोमास 34 पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने का लाभ प्रस्तुत करता है। हमारे शोध प्रयोगशाला में, एक व्यक्ति आराम से 4 दिनों में 20 नमूनों में से एक सेट प्रक्रिया कर सकते हैं, और हम यहाँ प्रस्तुत मिट्टी जैविक गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक होना प्रोटोकॉल पाया है।

PLFA विधि की शक्ति बहुत स्थिर आइसोटोप विश्लेषण 41, 42 के लिए यह युग्मन द्वारा बढ़ाया जा सकता है। विशेष रूप से, इसके अलावा ओएफ मिट्टी के लिए 13 सी लेबल substrates मिट्टी सूक्ष्मजीवों में सब्सट्रेट समावेश की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, हालांकि अलग-अलग PLFAs 41 के समस्थानिक विश्लेषण। इसके अलावा, इस विधि मिट्टी खाद्य जाले 42 में पौष्टिकता लिंक को स्पष्ट करने के लिए एक बहुत ही होनहार उपकरण प्रतीत होता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen Praxair Ni-T Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap Fisher Scientific 05-569-3 Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-4 Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band Grand & Toy 42199 1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C) Revco ULT2586-5-A36 Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column Agilent Technologies Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column Agilent Technologies 19091B-105
Gas chromatograph insert Agilent Technologies 5183-4692 Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid Agilent Technologies 5188-6592 Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes Fisher Scientific H292-4 Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3))
Hot water bath -Isotemp 220 Fisher Scientific Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-2 Used for freeze drying samples
KOH, ACS grade Fisher Scientific P250-500 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes Barnstead/Thermolyne 3,625,485 Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard Sigma-Aldrich 299030-2.5G Used for GC analysis
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software MIDI, Inc., Newark, DE Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System Lab Sphere Inc 1200-A Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves Fisher Scientific 27-058-52 Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter - Accumet XL200 Fisher Scientific Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette Socorex 832.02 Used throughout Steps (1 per sample)
250 µl gastight syringe Hamilton  1725 Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves Sigma-Aldrich Z529575 For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column Agilent Technologies 5982-2265 Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached Sigma-Aldrich Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 Barnstead International  M37615 Used in Steps 1-3
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade Sigma-Aldrich 270733-4L Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags Fisher Scientific 01-812-120 Used in sample collection - 2 bags required per sample collected

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
  2. ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
  3. Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
  4. McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
  5. Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
  6. McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
  7. Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
  8. Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
  9. Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
  10. Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
  11. Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
  12. Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
  13. Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
  14. Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
  15. Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
  16. Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
  17. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
  18. White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
  19. Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
  20. Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
  21. Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
  22. Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
  23. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
  24. Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
  25. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
  26. Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
  27. White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
  28. Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
  29. Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
  30. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
  31. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  32. Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
  33. McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
  34. Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
  35. Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
  36. Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
  37. Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
  38. Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
  39. Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
  40. Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
  41. Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
  42. Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 114 माइक्रोबियल समुदाय संरचना फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड होता है PLFA मिट्टी रोगाणुओं मिट्टी जीव विज्ञान सूक्ष्म पारिस्थितिकी भूमि उपयोग परिवर्तन भूमि प्रबंधन
निष्कर्षण और मिट्टी में माइक्रोबियल Phospholipid फैटी एसिड का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quideau, S. A., McIntosh, A. C. S.,… More

Quideau, S. A., McIntosh, A. C. S., Norris, C. E., Lloret, E., Swallow, M. J. B., Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. J. Vis. Exp. (114), e54360, doi:10.3791/54360 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter