Summary
Фосфолипидов жирные кислоты обеспечивают информацию о структуре микробных сообществ почвы. Представлены способы извлечения из образцов почвы с хлороформом с однофазным фракционирования экстрагированных липидов с использованием колонн экстракции твердой фазы, и метанолизе с образованием метиловых эфиров жирных кислот, которые анализируют с помощью капиллярной газовой хроматографии.
Abstract
Фосфолипидов жирные кислоты (PLFAs) являются ключевыми компонентами микробных клеточных мембран. Анализ PLFAs извлечена из почвы может предоставить информацию об общей структуре наземных микробных сообществ. PLFA профилирование широко используется в различных экосистемах в качестве биологического показателя общего качества почвы, а также количественный показатель реакции почвы на управление и другие экологические стрессоры землю.
Стандартный метод, представленный здесь представлены четыре основные стадии: 1. экстракции липидов из образцов почвы с хлороформом однофазной, 2. фракционирования с использованием колонны твердофазной экстракции для выделения фосфолипидов из других добываемых липидов, 3. метанолиза фосфолипидов для получения жирной кислоты метиловые эфиры (МЭЖК) и 4. анализ FAME с помощью газовой хроматографии с использованием капиллярного пламенно-ионизационным детектором (ГХ-FID). Два стандарта используются, в том числе 1,2-dinonadecanoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (ПК (19:0/19: 0)) для оценки общего восстановления способа экстракции, и метил-деканоат (MeC10: 0) в качестве внутреннего стандарта (ISTD) для анализа с помощью ГХ.
Introduction
Фосфолипидов жирные кислоты (PLFAs) являются частью микробных клеточных мембран из доменов бактерий и Eukarya. Микроорганизмы производят PLFAs различной длины цепи и композиции в качестве средства для поддержания целостности клеточных мембран и клеточной функции в ответ на их непосредственных условий окружающей среды; следовательно, можно утверждать, что микробные сообщества, которые разделены географически, но подвергаются сходных почвенных условиях будет выражать подобные PLFAs. PLFAs почвы с длиной цепи от 14 до 20 атомов углерода , как правило , считается преимущественно бактериальной и грибковой природы 1. В смешанных культурах, анализ PLFA не может быть использован для идентификации отдельных видов микроорганизмов, но она может обеспечить общую отпечатком сообществ микроорганизмов, обнаруженных в почве. Кроме того, так как PLFAs быстро деградируют после гибели клетки, они могут считаться представителем микробного сообщества жизнеспособной почвы 2. Это ТЕСhnique широко используется для характеристики структурный состав микробных сообществ , встречающихся в различных средах, начиная от лесов 3-4 до прерий 5-6 и сельскохозяйственных полей 7. Он был успешно применен при характеристике реакции почвы на землю изменения управления, в том числе леса вырубки 8, известкование 9, рекультивация 10-12, а также нарушений , таких как пожар 13, загрязнение металлами 14 и углеводородов 15, и вспышка от насекомых 16 ,
Современный PLFA аналитический метод развился в течение последних шести десятилетий через несколько ключевых достижений целым рядом исследовательских групп. В 1958 году значительное улучшение возникла из корректировки хлороформ: метанол: соотношение вода в экстракционном растворе , чтобы переложить смесь из монофазный в двухфазную систему 17. Эта оптимизированная экстракции липидов и пересмотренная изоляция протокол стал известен как метод Блай и Дайер. Протокол был принят многими лабораториями в течение следующих нескольких десятилетий, и в течение этого времени, белый и его коллеги способствовали значительный прогресс в метод; например, они улучшили стадию экстракции путем замены фосфатного буфера для воды, и они оптимизировали анализ с помощью газовой хроматографии (ГХ) с помощью расширенной идентификации пика и количественного определения. Возможно , большего отношение к почвоведению, они определены в 1979 году , что экстрагированные липиды могут быть использованы в качестве показателя микробного структуры , когда они исследовали микробной биомассы морских осадков 18.
Дальнейшее развитие произошло в 1980 - х годах , как метод стал более широко используется в науке почвы, в частности , по отношению к ризосфере 19. В то время, метод включены метильную nonadecanoate (MeC19: 0) в качестве внутреннего стандарта 19 и с использованием колонки с кремневой кислотой для липидного фракционирования 21 </ SUP>. После своей работы с White 19,21, Tunlid вернулся в Швецию и начали совместные исследования с Баас и Frostegård. Анализируя эффективность различных буферов экстракции для набора почв различных по содержанию органического вещества, группа показала , что цитратный буфер увеличивали количество липида фосфата , извлеченной по сравнению с буфером 22 фосфата. Кроме того, их публикация 23 1993 о влиянии известкования на почвенных микробных сообществ пошли дальше , чтобы стать Цитирование классикой в биологии почв и биохимии 24. Исследователи использовали анализ главных компонентов при их обработке данных. Анализ PLFA, как метод теперь называется, создает большие наборы данных и использование многовариантных статистических процедур для обработки этих данных был весьма новаторским для того времени и вдохновляющей для многих. Параллельно с работой, проводимой в Швеции, изменения в процедуре PLFA были исследованыГермания по Zelles и его коллеги 25-26. Их вариант процедуры отличался его использованием твердофазной экстракции (SPE) колонку вместо колонки кремниевой кислоты, но, в целом, была более интенсивной лаборатории.
Бумага Frostegård в 23, наряду с подробной методикой по White & Ringelberg 27, послужил основой для взрыва при использовании метода PLFA для исследования фундаментальных вопросов в области науки почвы. С тех пор, дальнейшие усовершенствования метода , при помощи Firestone и его коллеги включили добавление внутреннего стандарта GC (С10: 0) и С19: 0 в качестве суррогатного стандарта для улучшения количественной оценки 28, и заменяя использование делительных воронок для круглых флаконах дна до упрощающих добыча 29. Совсем недавно, Чоудхури и Дика 30 исследовал шаг метилирования и сообщили , что из двух процедур метилирования , используемых в научной литературе почвы метод КОН / МеОН идентманьяков больший диапазон жирных кислот.
Представленный метод в значительной степени основан на оригинальной методике, разработанной Блай и Дайер, и включает в нее изменения, упомянутые выше, такие как использование метанольного KOH для стадии метилирования. Два стандарта используются для каждого образца: суррогатный стандарт 1,2-dinonadecanoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (ПК (19: 0/19: 0)), который добавляют к пробе почвы до начала первой экстракции для оценки эффективности и восстановление всего протокола, а также стандартного инструмента метилового эфира деканоат (MeC10: 0), который добавляется до идентификации и количественного определения методом ГХ.
Мы признаем , что метод PLFA обычно используется многими микробной экологии лабораторий по всему миру, и было документально подтверждено много раз, в том числе Международной организацией по стандартизации 2. Цель данной работы заключается в представлении легко следовать и надежный протокол, который может быть полезен для почвыУченые, которые пытаются овладеть техникой PLFA.
Protocol
Примечание: Всегда убедитесь, что соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) носится по всему протоколу. Стеклянная посуда не должна граничить с голыми руками. Липиды из пальцев рук, волос, жира, масел и углеводородов все потенциальные загрязнители. Всегда носите нитриловые перчатки и перчатки Полоскание с 70% -ным спиртом при обращении с чистой стеклянной посуды.
1. Подготовка посуды для анализа
- Одноразовая посуда (например, центрифужные пробирки)
- Заверните в алюминиевую фольгу и тепла в муфельной печи в течение четырех с половиной часов при 450 ° С.
- Политетрафторэтилена (PTFE) -lined колпачки
- Замочите колпачки в течение одного часа в фосфатном моющим средством, а затем промыть щеткой в горячей воде и фосфатного моющего средства. Смойте мыло с водопроводной водой.
- Место в кислотной ванне (5% HCl) в течение одного часа только (не оставляйте дольше, поскольку вкладыши могут выпасть из крышек, если они вымачивают слишком долго. Полоскание три разав водопроводной воде. Промыть три раза в дистиллированной воде. Сушить в духовке при температуре 40 ° С.
- Многоразовая стеклянная посуда (например, 10 мл, 15 мл, 45 мл ампулы / банки)
- Промыть щеткой в горячей воде и фосфатного моющего средства. Смойте мыло с водопроводной водой и место в кислотной ванне (5% HCl) в течение ночи. Промыть три раза в водопроводной воде, затем промыть три раза в дистиллированной воде и затем сушат в печи при температуре 40 ° С.
- Заверните в чистой алюминиевой фольги (50 мл баночки завернуты по отдельности и другие изделия из стекла заворачивается в партиях образцов, например, 20) и тепло в муфельной печи в течение четырех с половиной часов при 450 ° С .
- Объемные изделия из стекла (например, мерную колбу)
- Промыть щеткой в горячей воде и фосфатного моющего средства. Смойте мыло с водопроводной водой и место в кислотной ванне (5% HCl) в течение ночи. Промыть три раза в водопроводной воде, промыть три раза в дистиллированной воде, а затем сушат в печи при 40 &# 186; C.
- Перед применением прополоскать 3 раза с небольшим количеством растворителя (например, метанол) - не помещать мерную стеклянную посуду в муфельной печи.
2. Сбор и обработка проб почвы до анализа PLFA
- Сбор образцов почвы в стерильные пакеты, и если они не могут быть проанализированы сразу, заморозить их как можно скорее. Образцы Хранить в морозильной камере (-80 ° C) до готовности приступить к сублимационной сушки образцов. Замораживание сухих партий образцов следуя инструкциям замерзают сушилки.
- Передача каждого лиофилизированный образец к новым меченных стерильной мешок. Взвесить образец из лиофилизированного материала в пакете в предварительно меченных приглушенным центрифужную пробирку для экстракции PLFA.
Примечание: Общее правило заключается в использовании 0,5 г для органических материалов (содержание углерода> 17% по массе) и до 3,0 г для образцов минеральной почвы. Запись веса образца для каждого образца. - За каждые 10 образцов, также отвеситьдополнительный дубликат для анализа, и на каждые 20 образцов включают пустой (то есть, центрифуга труба , которая не имеет никакого образца в нем - использовали в качестве контроля для идентификации любого возможного загрязнения в процессе экстракции PLFA). Процесс партии образцов труб одновременно.
Примечание: Набор из 20 образцов будет соответствовать партии из 23 пробирок (образцы с 1 по 10, один дубликат образца 10, образцы от 12 до 22 лет, один дубликат образца 22, и одна заготовка = партия из 23 пробирок).
Примечание: Проведение экстракции, а затем разделение, затем метилирования в партиях образцов перед приготовлением их для анализа с помощью ГХ и запустить их все вместе. Это помогает определить, где ошибки не случилось, если что-то пойдет не так, и может помочь снизить количество необходимых повторных экстракций.
3. Методика PLFA (шаги для индивидуального образца, но полный одной всей партии в то время)
Примечание: Все этапы методики PLFA, описанные в стади1-3 ниже следует проводить в вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и следуя инструкциям по технике безопасности лаборатории.
- Добыча (Шаг 1):
- Готовят 5,0 М КОН путем растворения 14 г КОН в 50 мл дистиллированной, деионизированной воды (Dh 2 O).
- Приготовьте 0,15 М цитрат буфер путем растворения моногидрата 31,52 г лимонной кислоты в 400 мл дН 2 O. Отрегулируйте до рН 4,00 ± 0,02 добавлением 5,0 М КОН; примерно 45-50 мл 5,0 М KOH потребуется для доведения рН до 4,00. Когда рН, разбавленные цитратного буфера до 1000 мл с помощью мерную колбу. Храните цитратный буфер в холодильнике, когда он не используется (до одного месяца).
- Подготовьте ежедневно ПК (19: 0/19: 0) nonadecanoate суррогатным стандартным путем разбавления 250 мкл исходного раствора (10 мг / мл) в 25 мл хлороформа (это обеспечивает достаточно суррогатный стандарт для выпечки 23 образцов). Добавить 0,5 мл PC (19: 0/19: 0) суррогатной стандартное решение образца центрифуге трубки.
- д.д. экстрагент Bligh и Dyer к образца почвы в следующем порядке: I) 2,0 мл цитратного буфера, II) 2,5 мл хлороформа, и в) 5,0 мл метанола. Крышка образца с крышкой с покрытием из ПТФЭ и вихря в течение 30 секунд; разместить в конец поверх концевой мешалке в течение 2 часов.
- Центрифуга при 226 мкг в течение 15 мин с крышкой на. Нарисуйте супернатанта прочь с помощью пипетки Пастера и передачи в меченым стеклянную пробирку 45 мл.
- Добавьте второй раунд Блай и Дайер экстрагента к каждому образцу, и повторите шаги 4 и 5 выше. Нарисуйте супернатанта прочь с помощью пипетки Пастера и передачи в тот же маркированный 45 мл стеклянную пробирку.
- Добавить в меченого 45 мл стеклянный флакон, содержащий супернатант: I) 5,0 мл хлороформа и II) буфер 5,0 мл цитрата. Крышка с белым с покрытием из ПТФЭ крышкой и вихревого стекла флакон на 30 сек. Пусть сидят в течение ночи при комнатной температуре в темноте (во избежание окисления).
- Тщательно пылесосить от верхнюю водную фазу флакона 45 мл (если вакуум не доступен, пипетка должна быть опущена через AqueOUs фаза очень осторожно, чтобы не собирать любой в пипетку, когда пипеткой органической фазы). Пипетка ниже органическую фазу в меченого 15 мл флакон.
- Место партия 15 мл ампулы в сжатом N 2 (во избежание окисления) при комнатной температуре. Упаривают хлороформ медленно, установив поток N 2 к рябить поверхности жидкости во флаконе , но не лезьте стороны флакона.
- Винт на подкладке из PTFE крышкой и хранить образцы в морозильной камере при температуре -20 ° С, завернутые в алюминиевую фольгу (завернуть в партиях, а не индивидуально) до готовности приступить к шагу 2.
- Липидный фракционирование (стадия 2)
- Поместите держатель SPE колонки с патрубками на стеклянный резервуар. Включить новые столбцы SPE (силикагель, 500 мг, 6 мл) в патрубками. столбцы этикетки по мере необходимости (рекомендуется, чтобы избежать смешения образцов).
- Выдержать каждый столбец путем добавления 5 мл ацетона и сливом через, а затем добавить два дополнения 5 мл хлороформа (Общий объем = 10 мл). Разрешить второй мыть хлороформ вытекать до ~ 1 мм над фритту и затем закройте кран.
- Повторно растворите образец (хранится в 15 мл флаконе в конце стадии 1) путем добавления 0,5 мл хлороформа в пробирку и осторожно вихревое. Передача повторно растворяют образец в колонку SPE, используя пипетку Пастера; повторить в общей сложности 2 передачи (общий объем перенос 1 мл хлороформа на пробу).
- Lay образец липида непосредственно в центре колонны и попаданию растворителя полностью стечь в бак.
- Элюции нейтральные липиды добавлением 5 мл хлороформа в каждой колонке. Разрешить растворитель полностью стечь в бак.
- Элюции гликолипиды путем добавления 5 мл ацетона в каждой колонке. Разрешить растворитель полностью стечь в сборный резервуар.
- Удалить столбец стоять из бака и слейте резервуар с вакуумным устройством. Вставьте стойку с чистыми и меченых центрифужные пробирки в резервуар. Заменить колонки стоять на баке; маркированы столбец выше, должны совпадать с меченым CENTRifuge трубки ниже.
- Элюции фосфолипидов в центрифужные пробирки путем добавления 5 мл метанола в каждой колонке. Подождите колонн SPE высыхать в вытяжном шкафу перед утилизацией них. Сухие вниз фосфолипидных фракций при комнатной температуре в атмосфере сжатого N 2.
- Чистки трубки с N 2. Винт на PTFE картонных крышкой и хранить образцы в морозильной камере при температуре -20 ° С, завернутые в алюминиевую фольгу (завернуть в партиях , а не индивидуально) до готовности перейти к шагу 3.
- Липидный метилирование (Шаг 3).
- Включите ванну с горячей водой, установленной на 37 ° С. Приготовьте 1М уксусной кислоты (если уже не сделали) путем растворения 57,1 мл ледяной уксусной кислоты в 1000 мл дН 2 O с использованием 1000 мл мерную колбу. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение до трех месяцев. ,
- Приготовьте порцию метанольного KOH. Готовят 0,2 М раствора КОН путем растворения 0,45 г КОН в 40 мл метанола. Регулировка громкости КОН и метанола согласно аОЖИДАЕМЫЕ размер партии в шаге 3. Подготовить этот раствор ежедневно; не хранить в течение более длительных периодов времени.
- Удалить образцы (в центрифужные пробирки, сохраненных после шага 2) из морозильной камеры и позволяют образцы до комнатной температуры. Добавить 0,5 мл хлороформа и 0,5 мл метанола, к каждому образцу, а затем 1,0 мл метанольного КОН. Cap трубы плотно с тефлоновым подкладке крышкой. Вихревой перемешать.
- Поместите запечатанные пробы в 37 ºC бане в течение 30 мин. Убедитесь, что уровень воды составляет минимум 1-2 мм над уровнем жидкости пробы. Удалить и дайте остыть образцы. В то время как образцы в водяной бане, маркировать маленькие стеклянные ампулы с образцом удостоверения личности (10 мл стеклянный флакон с тефлоновым подкладке крышкой).
- Добавить 2,0 мл гексана для каждого образца и вихрь. Затем добавляют 0,2 мл 1,0 М уксусной кислоты в каждом образце и водоворот, чтобы снова перемешать; разделение фаз должно стать видимым.
- Добавить 2,0 мл дН 2 O для каждого образца , чтобы разбить фазу. Образцы Vortex в течение 30 сек. Затем центрифуга образцы при 226 мкг в течение 2 мин.
- С помощьюкороткий пипетки Пастера, перенесите верхнюю фазу чистится маркированы флаконах по 10 мл. Будьте осторожны, чтобы не передавать какие-либо из нижней (водной) фазы.
- Добавить 2,0 мл гексана для каждого образца центрифужную пробирку и вихрем. Образцы Vortex в течение 30 сек. Затем центрифуга образцы при 226 мкг в течение 2 мин.
- Использование короткой пипетку Пастера, снова добавить верхнюю фазу с меченым стеклянную пробирку объемом 10 мл.
- Выпаривают растворитель в меченой-10 мл стеклянную пробирку при комнатной температуре в атмосфере N2. Винт на подкладке из PTFE крышкой и хранить образцы в морозильной камере при температуре -20 ° С, завернутые в алюминиевую фольгу (завернуть в партиях, а не индивидуально) до готовности приступить к анализу GC. Обязательно маркировать все образцы.
- Газовый хроматограф (ГХ) анализа
Примечание: Идентификация и количественное определение отдельных PLFAs осуществляется с использованием ГХ подключен либо к FID или детектором MS. В то время как ниже инструкции предназначены для GC-FID, препарат образца будет действителен для ГХ-МС, как шELL. Пример настройки для системы GC-FID будет включать в себя 25 м × 0,2 мм × (5% -фенил) 0,33 мкм -methylpolysiloxane колонку со следующим протоколом температуры: начальная температура 190 ºC, рампа 10 ° C / мин до 285 ° С , удерживайте 9,5 мин, рампы 60 ° с / мин до 310 ° с , провести 0,42 мин 31.- Подготовить внутренний стандарт GC (ISTD), добавив одну каплю MeC10: 0 (метилдеканоат) до 100 мл гексана (запись дополнительный вес до 0,1 мг). Включите газов в GC, а затем включите GC. Убедитесь , что H 2, N 2 и воздушные цилиндры открыты и что имеется достаточно газа для запуска анализа (H 2 никогда не должны получить ниже 500 фунтов на квадратный дюйм).
- Убедитесь, что условия хорошей калибровки выполнены путем запуска калибровочных стандартов, содержащих смесь жирных кислот, а затем гексан заготовки. Идентичность отдельных жирных кислот может быть назначен вручную на основе сравнения с временами удерживания, полученными для стандартов, или это может быть AutomaticaLLY назначены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения 31. Во всех случаях однозначен идентификация может быть достигнута с помощью детектора MS 2.
Примечание: Дополнительные признаки хорошей калибровки включают плоскую базовую линию и отсутствие загрязнения в гексане полоскании. - Растворите каждого остатка образца PLFA (содержащийся в стеклянной пробирке объемом 10 мл из липидной метилирования стадии 3) в 150 мкл раствора ISTD и перенесите в пробирку GC (в качестве альтернативы используют от 50 до 75 мкл, если ответ образца, как ожидается, будет слабым, например, в очень песчаные почвы).
- Установите объем впрыска образца до 2 мкл. Установите температуру FID до 300 ° С. Запуск образцов , используя температуру на входе 250 ° С , с Н 2 в качестве газа - носителя (скорость потока 1,3 мл / мин) , а также отношение разделенного 30: 1.
Representative Results
Жирные кислоты, обозначаются как X: YωZ, где Х представляет собой число атомов углерода, Y представляет собой число двойных связей, и Z обозначает положение первой двойной связи с алифатическим (ω) конца молекулы. Суффиксы 'с' и 'т' означают цис- и транс-геометрические изомеры. Префиксы и суффиксы 'а' и 'я' относятся к anteiso и изо ветвление и Me и ОН заданным метильные группы и гидроксильных групп, соответственно.
После запуска GC, проверьте, что образцы получали адекватную ISTD, глядя на 10: пик 0. Также проверьте реакцию стандартов GC, т.е., флаконы , содержащие гексан с добавлением раствора ISTD; они не должны иметь никаких других пиков. Внутренний ответ стандарт должен быть одинаковы во всех опытах.
На рисунке 1 представлена представиный запуск образца. Большой гексан пик растворителя характерно появляется при времени удерживания (RT) около 1,8 мин. Стандартный пик ISTD (С10: 0) появляется при RT 3,4 мин, в то время как C19: 0 имеет RT 16,2 мин. Анализ методом ГХ отделяет PLFAs в зависимости от их длины цепи, с более длинными цепями, элюируя более медленно; например, С18: 0 элюируется 14,4 мин в то время как C16: 0 элюируется при 10,8 мин. Кроме того, этот аналитический протокол может отделить PLFAs в зависимости от их степени ненасыщенности и положение их двойной связью; например, С18: 0 элюируется 14,4 мин, в то время как С18: 1 9с и С18: 1 7с элюата в 14,0 и 14,1 мин, соответственно (рис 1). И, наконец, PLFAs аналогичной длины цепи и насыщения , но разной конфигурации разветвления (anteiso по сравнению с ИСО) могут быть разделены; например, C15: 0i и C15: 0a элюат 8,6 и 8,7 мин, соответственно (Рисунок 1).
Площади пиков различных GC может быть импортирован в электронную таблицу для дальнейшей обработки информации газовой хроматограммы. Каждый идентифицированный PLFA количественно (нмоль г -1 сухой почвы) , используя следующее уравнение:
где F представляет собой поправочный коэффициент , который учитывает FID селективности и молярность различия между жирными кислотами 32, areaPLFA площадь пика для каждого идентифицированного PLFA, areaC10: 0 площадь пика для ISTD (MeC10: 0), С10: 0 СТД добавляемое количество ISTD (нмоль) к каждому образцу добавляли до GC пробега, отношение (С19: 0 СТД добавлено / С19: 0 образец) соответствует восстановлению ПК (С19: 0 / С19: о) суррогатный стандарт, и вес образца является количество высушенную в сушильном шкафу почвы (г) добавляют к исходной пробе центрифужную пробирку и использовали для извлечения PLFAs.
Примечание: Площади под differeПики нт выражаются в виде площади пиков, ответ или% ответа в зависимости от системы ГХ. В пределах диапазона, имеющей отношение к почвенной PLFA характеристики, области можно считать линейно пропорционально весам жирных кислот; В качестве альтернативы, малые поправочные коэффициенты могут быть применены для учета FID селективности 32. Кроме того, так как результаты изначально выражены в расчете на весовой процентной основе, они должны быть нормализованы, чтобы получить мол рные количества. Регулировка для молярность различий достигается путем учета молекулярных масс индивидуальных жирных кислот; опубликованные таблицы 32 и коммерческое программное обеспечение 31 также доступны , чтобы помочь при нормализации для молярности.
Количество ISTD (нмоль) к каждому образцу добавляли может быть дополнительно рассчитана как:
С10: 0std добавлен = [ISTD] × V (STD добавлено)
[ISTD] означает концентрацию (нмоль л -1) MeC10: 0 (метилдеканоат) , растворенный в гексане (шаг 3.4.1), и V (СТД добавляется) является объем (L) , из полученного раствора ISTD к каждому образцу добавляли до GC прогона (т.е. 150 мкл в соответствии со стадией 3.4.4).
Количество С19: 0 (нмоль), присутствующего в каждом образце раствора при проведении анализа ГХ соответствует:
где areaC19: 0 площадь пика для C19: O, в то время как соответствующее количество С19: 0 (нмоль) к каждому образцу добавляли в начале способа экстракции PLFA (см Шаг 3.1.3) является:
где [19: 0] Std (мг L -1 (19: 0 добавили СТД) является объем подготовленной суррогатного стандарта к каждому образцу добавляют в начале экстракции PLFA метод (см Шаг 3.1.3), М 19: 0 является молекулярная масса 1,2-dinonadecanoyl- зп глицеро-3-фосфохолина (PC (19: 0/19: 0)).
Примечание: Один моль C19: 0 nonadecanoate суррогатных стандартные выходы два моля С19: 0 после стадии метилирования, в то время как С10: 0 стандарт добавляется после метилирования.
Следующие PLFAs, как правило, исключены из анализа почвы микробных сообществ: я) PLFAs, которые <14 C и> 20 ° С в длину, и II) PLFAs с менее чем 0,5% от общей площади пика в. После того, как эти PLFAs были исключены, ответы от всех остальных PLFAs можно суммировать для получения общей PLFA биomass (нмоль г -1 сухой почвы). Одномерный анализ данных PLFA (например, ANOVA, после преобразования данных в зависимости от обстоятельств , чтобы соответствовать условиям испытания выполняются) могут быть использованы для сравнения общей биомассы PLFA и / или PLFA биомасса отдельных групп среди выборочных групп / лечения. Например, на рисунке 2 представлены результаты для относительного распределения различных групп PLFA, таких как прямой цепью насыщенных PLFAs, насыщенных PLFAs либо с середины цепи (10-метил) или терминальный разветвлением, и моно- или полиненасыщенные PLFAs, а также сумма общего PLFAs (нмоль г -1 сухой почвы). В этом конкретном примере, возраст деревьев (падающая от участка 1 в участок 3) видно, чтобы влиять как общие PLFAs и относительное распределение различных групп PLFA.
Для того, чтобы оценить общие закономерности в составе PLFA среди образцов, многомерный анализ всех PLFAs может быть conduИДКТК 33. Данные PLFA должны быть преобразованы в случае необходимости до выбранного многомерный анализ , чтобы удовлетворить условиям статистического испытания и исследования вопроса решаются, например, преобразование Хеллингера часто используется для релятивизировать данных. Рисунок 3 показывает результаты из неправительственного -метрикой многомерное шкалирование (NMDS) согласование тех же данных , которые были использованы на рисунке 2; NMDS является непараметрический, многомерный метод, который производит 2- или 3-мерное позиционирование точек данных, основываясь на сходстве ранжирования баллов между образцами.
Рисунок 1. Представитель GC-FID хроматограмма. Образец , полученный из культивируемого Браун черноземной почвы был использован для этого анализа. Время удерживания и соответствующие PLFAs (в скобках) и их площадь пика (Pa) авновь указано на рисунке для представительных пиков. Для ясности, не все пики указаны на рисунке, хотя этот конкретный пример дали 33 выявленных PLFAs. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Относительное содержание шести различных классов PLFAs (% от общего числа PLFAs), а общая биомасса PLFA (нмоль г -1 сухой почвы). Образцы из лесистых Luvisolic почв были использованы для этого анализа. Результаты показывают большую суммарную PLFAs для почвы на участке 1, который находится под более старых деревьев (> 50 лет), а затем промежуточные возраста (25 лет) деревьев (участок 2), и, наконец, самый молодой (10 лет) деревья ( Сайт 3). Относительно более насыщенные PLFAs присутствуют в самых маленькихсайт, в то время как все больше ненасыщенных PLFAs присутствуют на старейшем сайте. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. неметрические многомерное шкалирование (NMDS) согласование PLFAs ( с использованием% от общего количества PLFAs данных) для осей 2 и 3 3-мерного решения. Эта координация была вычислена с использованием тех же данных, которые используются для фиг.2. молодой сайт (3 сайта) отделяет очень четко от старых двух сайтов (сайты 2 и 3), которые показывают перекрытие в их PLFA состав микробного сообщества. Величина изменения в сообществе данных PLFA объясняется каждой оси включается в скобках; 72,5% вариации объясняется этими двумя осями для 3-Дименасиональных решение NMDS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Чтобы свести к минимуму и избежать неправильной интерпретации данных PLFA, тщательный отбор данных должно быть сделано, потому что некоторые PLFAs, которые находятся в почве микробного сообщества также присутствуют в одно- и многоклеточных эукариотических организмов, таких как корни растений, водорослей и почвенных животных. Кроме того, археи не содержат PLFAs; вместо этого, архейного мембраны состоят из фосфолипидных эфиров липидов (PLELs). Следовательно, протокол PLFA не может быть использован для характеристики архейного сообществ в почве.
Сопоставляя отдельные PLFAs к определенным группам микроорганизмов следует проявлять с осторожностью (см 2011 публикацию Frostegård и коллег 34 за отличную обсуждение некоторых ограничений метода PLFA). Вместо этого он может быть более подходящим, как это было сделано на рисунке 2, к группе PLFAs на основе их химической структуры, например, я) неразветвленными, насыщенными PLFAs II) с насыщенными PLFAs середине ChaiN (10-метил) ветвистые, III) терминально-разветвленные насыщенные жирные кислоты, IV) мононенасыщенных PLFAs, V) полиненасыщенные PLFAs и VI) гидрокси жирных кислот.
Масса образца может потребоваться скорректировать на основании количества экстрагируемых PLFAs, содержащихся в данном образце почвы. Но, не изменяя количество почвы, добываемой в менее микробиологически активных почвах, пользователи рискуют не получить достаточного количества ответов PLFA (пики), чтобы точно представить общее микробное сообщество. В сильно микробиологически активных почвах с высокими концентрациями PLFAs, пользователи подвергаются риску перегрузки колонны GC, тем самым предотвращая точную количественную оценку PLFAs. В обоих случаях образцы почвы должны быть повторно проанализированы для PLFAs. Хорошей отправной точкой является добавление 0,5 г для органических проб почвы (например, лесных этажей), а также около 3 г для минеральных образцов почвы. Так как количество экстрагируемых PLFAs обычно коррелирует с количеством органического углерода, содержащегося в почве, выборка,IGHT можно регулировать в зависимости от содержания углерода в почве, например, 1 г образца минеральной части почвы может быть достаточно , чтобы получить хороший PLFA квантификации , когда содержание углерода составляет 10-15%, в то время как> 5 г может быть необходимо , если содержание углерода ≤ 0,5 %. Это всегда хорошая идея, чтобы сделать пробный прогон с несколькими образцами для оптимизации выборки веса перед тем весь набор выполняется.
Общие стратегии по устранению неполадок для протокола PLFA и ГХ-анализа заключаются в следующем. Если ГХ хроматограммы базовой линии слишком высока, газовый баллон Н 2 должен быть изменен. Если растворитель или ISTD пики отсутствуют на хроматограмме, может возникнуть проблема с введением образца (например, подключен шприц, проблема с пробоотборником, пустой или отсутствует флакон, ошибка с позиционированием флакона). Если более чем три пика обнаруживаются в методе / контрольного образца, есть загрязнение заготовки, и существует высокая вероятность того, что тот же загрязняющее вещество (ы) будет присутствовать в образце С GChromatograms. Найти источник загрязнения (обычно водные среды), или, по крайней мере, гарантировать, что пики, соответствующие примеси удаляются из образцов хроматограммах и что эти пики не включены в какой-либо статистического анализа данных PLFA. Кроме того, это хорошая идея, чтобы запустить гексан ополаскиватели между образцами при подозрении на унос. Дополнительные пики в гексане полоскании будет указывать унос (т.е. более тяжелые компоненты , элюирующихся от предыдущего запуска).
Липиды особенно чувствительны к окислению, а также особое внимание необходимо проявлять по всему протоколу, чтобы защитить образцы от воздуха и освещенности, например, сохранение их в темноте и держать их в атмосфере азота. Все образцы и бланки должны иметь достаточную C19: 0 суррогатный стандарт. Отсутствующий C19: 0 пик, либо в образцах или заготовок, указывает на плохое восстановление или полную потерю аналитов. Ответ С19: 0 в образцах, что значительно ниже, чем меню / контрольных образцов указывает на потерю аналитов в какой-то момент в методологии PLFA. Когда они сталкиваются с плохим С19: 0 восстановление, все аспекты процедуры должны быть тщательно рассмотрены и изучены в том числе первоначальной экстракции, все этапы переноса пробы, экстракции SPE, метилирование жирных кислот, сушки, хранения и обработки образцов для того, чтобы изолировать стадии или стадии, где анализируемые теряются. С другой стороны, это может быть, что извлечение некоторых образцов почвы, может дать С19: 0, в этом случае восстановление суррогатной стандарта может быть завышена. При использовании двух стандартов ((PC (19: 0/19: 0) и MeC10: 0) не является абсолютным требованием, мы обнаружили, что это будет очень полезно при необходимости устранения тех пор, пока MeC10:. 0 ответ адекватен , устранение неполадок может сосредоточиться на ступеньках перед анализом ГХ.
Как было отмечено ранее, осторожность следует использовать при интерпретации экологического значения и экосистемных отношения, основанные исключительно на биомаркеры вывестиd из данных PLFA, поскольку исследования чистой культуры показывают, что выделенные штаммы бактерий будет содержать различные категории PLFAs. Вместо этого биомаркера PLFAs следует рассматривать как полезное дополнение в набор доказательств при принятии более широких экологических выводов. В литературе отдельные PLFAs были предложены и использованы в качестве биомаркеров для различных групп микроорганизмов. Насыщенные PLFAs, как правило, используются для представления грам-положительных бактерий и мононенасыщенные PLFA используются для грам-отрицательных бактерий. Признанные биомаркеров грамотрицательные бактерии включают мононенасыщенные жирные кислоты с ненасыщенностью в ω5 или ω7 позиции, такие как С16: 1ω7, С18: 1ω7 и С18: 1ω5. Кроме того, циклопропила жирные кислоты могут также быть представителем грамотрицательных бактерий 35. Следовательно, PLFAs из грамотрицательных бактерий может быть рассчитана как равная сумме A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Признанные биомаркеры для грамположительных бактерий неизлечимо разветвленными саturated жирные кислоты, изо-разветвленные, такие как C15: 0i, С16: 0i, С17: 0i; или anteiso-разветвленные, такие как C15: 0a и С17: 0a. Насыщенные PLFAs с середины цепи (10-метил) ветвистый, такие как 10Me16: 0 и 10Me18: 0 характерно присутствует в актиномицетов 36. Таким образом, PLFAs из грамположительных бактерий можно рассчитать как равный сумме А: 0 (ISO, ANTEISO, 10-метил).
Многие биомаркеры, связанные с грибковой PLFA часто полиненасыщенные, но некоторые грибковые биомаркеры мононенасыщенные. Например, с точки зрения грибковыми мононенасыщенных биомаркеров, С16: 1ω5 был идентифицирован как показатель эндомикоризными грибов (AMF) 37, С18: 1ω9 часто встречается у сапрофитных грибов, и ectomycorrhizae обычно содержат С16: 1ω9. Присутствие ди-ненасыщенным С18: 2ω6,9 часто встречается в сочетании с С18: 1ω9, а также хорошо коррелирует с грибкового стерина эргостерина, который указывает, что С18: 2ω6,9 может адекватно представлять ectomycorrhizae и сапрофитные грибы 38. Трехкратно ненасыщенными С18: 3ω 6,9,12 также был использован в качестве биомаркера для грибов 10; Тем не менее, С18: 3ω6c можно найти в других эукариотических организмов, в том числе и растений и водорослей, хотя, как правило, не встречается в бактериях. В перспективе почвенных протистов, С20: 4ω6c был признан как протисты биомаркера 39, хотя, другие работы не удалось обнаружить C20: 4ω6c даже когда жизнеспособные популяции протисты были подтверждены визуально с использованием световой микроскопии 40.
Многие исследования посвящены экологические вопросы, связанные с общей микробного сообщества почвы путем использования методики многофакторного ординации в качестве инструмента анализа данных PLFA. При использовании этого подхода, некоторые авторы решили исключить редкие PLFAs из набора данных путем удаления PLFAs, которые присутствуют в менее чем 5% образцов 4. Нормальные насыщается С16: 0 и С18: 0 в изобилии во всех почвенных микроорганизмов, в том числе прокариот и EUKaryotes. Следовательно, некоторые исследователи решили удалить эти PLFAs до статистического анализа на том основании, что они не могут быть чувствительными индикаторами состава микробного сообщества почвы - хотя С16: 0 и С18: 0 по-прежнему должны быть включены при суммировании всех PLFAs для индекс микробной биомассы. В перспективе статистических анализов, многие исследователи предпочитают проводить неметрические многомерное шкалирование (NMDS) рукоположение , как этот метод хорошо подходит для данных , которые не могут быть нормально распределены 33. Дополнительные анализы, связанные с категориальные переменные могут включать в себя анализ видов-индикаторов, которые могут относиться возникновение конкретных PLFAs категорических группировок и нескольких процедур реагирования перестановок (MRPP), которые могут помочь определить сходства или различия между микробных сообществ, назначенных категорических групп. Кроме того, многомерные регрессионные деревья (MRT) может быть особенно полезно, когда влияние нескольких экспериментальных переменных илилечение должно быть оценено в качестве потенциальных переменных пояснительных 5 (например, текстура почвы, влажность, рекультивация возраст).
После того, как установлено, протокол PLFA является относительно простой аналитический метод, который может быть очень полезным при количественной оценке почвы ответ микробной к изменениям окружающей среды и антропогенного воздействия. В то время как молекулярные методы , такие как генетической дактилоскопии лучше подходят для детального определения характеристик микробных сообществ, метод PLFA представляет преимущество обеспечения количественной информации о суммарной микробной биомассы 34. В нашей исследовательской лаборатории, один человек может комфортно обрабатывать набор из 20 образцов в течение 4 дней, и мы нашли протокол, представленный здесь, чтобы быть надежным и воспроизводимым методика для оценки биологического качества почвы.
Сила метода PLFA может быть значительно расширен путем присоединения его к стабильным изотопного анализа 41, 42. В частности, добавление OF 13 C-меченых субстратов в почву позволяет квантификации включения субстрата в почвенных микроорганизмов , хотя изотопного анализа отдельных PLFAs 41. Кроме того, этот метод представляется весьма перспективным инструментом для выяснения трофических связей в почве пищевых сетях 42.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
