Summary
Cette étude décrit les procédures chirurgicales et les techniques expérimentales pour effectuer une cystométrie éveillée dans une souris qui se déplace librement. En outre, il fournit des preuves expérimentales pour soutenir son optimisation et sa standardisation.
Abstract
La cystométrie de remplissage éveillée a été utilisée pendant longtemps pour évaluer la fonction de la vessie chez les souris qui se déplacent librement, mais les méthodes spécifiques utilisées varient selon les laboratoires. L'objectif de cette étude était de décrire la procédure microchirurgicale utilisée pour implanter un tube intravésical et la technique expérimentale pour l'enregistrement de la pression de la vessie dans une souris éveillée et en mouvement libre. En outre, des données expérimentales sont présentées pour montrer comment la chirurgie, ainsi que le type et la taille du tube, affectent la fonction inférieure du système urinaire et la sensibilité de l'enregistrement. L'effet du diamètre du tube sur l'enregistrement sous pression a été évalué dans des tubes en polyéthylène et en polyuréthane avec des diamètres internes différents. Par la suite, le tube le plus performant des deux matériaux a été implanté chirurgicalement dans le dôme de la vessie de souris mâles C57BL / 6. Une fréquence de miction de douze heures et une nuit a été enregistrée chez des animaux et des animaux sains, intacts 2, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie. À la récolte, les vessies wOn a évalué les signes de gonflement en utilisant une observation brute et ont ensuite été traités pour une analyse pathologique. La plus grande étendue du gonflement de la vessie a été observée au jour 2 et 3, ce qui était en corrélation avec les données de mictions comportementales montrant une déficience significative de la fonction de la vessie. Au jour 5, l'histologie de la vessie et la fréquence d'annulation ont été normalisées. Sur la base de la littérature et des preuves fournies par nos études, nous proposons les étapes suivantes pour l' enregistrement in vivo de la pression intravésicale et du volume annulé dans une souris éveillée: 1) Effectuer la chirurgie à l'aide d'un microscope opérationnel et d'outils microchirurgicaux, 2) Utiliser du polyéthylène-10 Tubes pour minimiser les artefacts de mouvement, et 3) Effectuer la cystométrie le jour 5 après l'opération, lorsque le gonflement de la vessie se résout.
Introduction
La cystométrie de remplissage (FC) est une méthode de diagnostic consistant à placer un cathéter dans la vessie pour enregistrer la pression pendant le remplissage lent de la vessie. Introduit en 1927 en tant que méthode de diagnostic clinique pour évaluer la fonction des voies urinaires inférieures, il est resté largement utilisé. 1 Dans les applications de recherche, le FC peut être utilisé pour tester la fonction de la vessie dans des modèles animaux sains et malades et pour étudier les effets des agents pharmacologiques. Les modèles animaux de rongeurs sont couramment utilisés pour étudier la fonction des voies urinaires inférieures. 2 Dans ce groupe de mammifères, le FC a d'abord été développé pour être utilisé chez des rats. 3 Ici, la méthodologie pour implanter un tube dans la vessie et effectuer le FC a été bien décrite et utilisée par de nombreux chercheurs avec un niveau de reproductibilité acceptable. 4 La disponibilité de souches transgéniques et knock-out fait de la souris une espèce précieuse pour de nombreuses zones de recherche,Y compris le domaine du dysfonctionnement des voies urinaires inférieures. La méthodologie utilisée pour effectuer la cystométrie de souris varie sensiblement entre les laboratoires, ce qui rend difficile la comparaison des résultats. 5
Par rapport aux modèles ex vivo , le FC préserve l'anatomie des voies urinaires inférieures, ce qui permet d'évaluer la fonction coordonnée entre la vessie et sa sortie pendant les phases de stockage et de mictions du cycle de la miction. Des recherches antérieures montrent que de nombreux anesthésiques couramment utilisés suppriment la contraction de la miction. Les agents qui préservent la contraction des muscles lisses de la vessie urinaire (uréthane, α-chloralose, kétamine et xylazine), permettant à l'animal de se moudre, réduisent encore considérablement la capacité fonctionnelle de la vessie et suppriment la neurotransmission. 6 , 7 , 8 , 9 Bien que techniquement plus difficile, FC a joué en awLes animaux ambulants conservent l'intégrité fonctionnelle du réflexe de miction.
La fonction des voies urinaires inférieures est influencée par de multiples facteurs, y compris l'enflure post-opératoire de la vessie, le stress dû à la douleur et à l'inconfort et les influences environnementales. L'utilisation d'une technique chirurgicale qui minimise les dommages aux tissus pendant l'implantation du tube et les méthodes d'enregistrement qui réduisent le mouvement du tube, tout en permettant simultanément à l'animal d'ambuler, sont essentielles pour obtenir des enregistrements précis et reproductibles.
Si elle est effectuée de manière adéquate, in vivo Le FC dans les animaux en mouvement libre peut fournir des données qui reflètent fidèlement la fonction physiologique de la vessie. 10 FC dans les animaux en mouvement libre peuvent fournir des données sur les paramètres suivants; Pression basale ou de base: pression minimale entre deux mictions. Pression d'intermittence: pression moyenne entre deux mictions. Pression de seuil: pression intra-survie immAvant la miction. Pression maximale: Pression maximale de la vessie pendant un cycle de miction. Activité spontanée (ou pression oscillatoire moyenne d'interconnexion): pression d'intermittence moins pression basale. Contractions non annulatoires: Augmentation de la pression intravésicale pendant la phase de remplissage, non associée à la libération de fluide. Conformité à la vessie: capacité de la vessie divisée par la pression de seuil moins la pression basale. Fréquence de miction: Nombre de mictions par unité de temps. Intervalle d'intermédiation: Période comprise entre deux pressions annulantes maximales. Capacité de la vessie: volume infusé divisé par le nombre de mictions. Une description détaillée de ces paramètres et de la terminologie standardisée a déjà été publiée. 11
Le FC peut être effectué en utilisant une méthode de perfusion intravésique en continu ou à cycle unique. La cystométrie continue permet d'enregistrer de multiples cycles de miction et de sélectionner des données représentatives baséesSur la reproductibilité. Sa précision dans la mesure de la capacité de la vessie est limitée en raison du volume résiduel inconnu. En outre, il est difficile de collecter de petits volumes annulés (qui, selon la tension et le sexe, varient entre 30 et 184 μL) chez des souris ambulantes. L'utilisation de cette méthode pour enregistrer le volume annulé est moins précise par rapport à une préparation anesthésiée, mais elle est supérieure car elle évite les effets suppressifs des anesthésiques sur la fonction de la vessie. La cystométrie à cycle unique doit être utilisée pour évaluer la capacité de la vessie. Dans cette méthode, la vessie est vidée par aspiration avant la perfusion et la capacité est calculée en fonction de la vitesse de perfusion multiplié par le temps à la pression maximale.
Bien que la technique d'exécution de la cystométrie chez les petits rongeurs ait été publiée, elle décrit la chirurgie effectuée chez un rat et a recommandé que la cystométrie de la souris soit réalisée sous anesthésie uréthane. 10 Le but de cette communication est tO décrire à la fois les techniques microchirurgicales utilisées pour implanter un tube intravésical dans le dôme de la vessie et la mise en place expérimentale utilisée pour enregistrer la fonction du tractus urinaire inférieur, in vivo , lors du remplissage continu de la vessie et de la miction sur une souris éveillée en mouvement libre. De plus, des expériences ont été effectuées pour déterminer comment la longueur, le diamètre et le matériau de la tubulure, ainsi que la méthodologie pour effectuer le FC in vivo , affectent l'enregistrement. Ce protocole expérimental résume les techniques publiées précédemment et propose un certain nombre de modifications basées sur des résultats expérimentaux.
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Protocol
Les animaux ont été hébergés dans l'établissement de soins des animaux de l'Université de Vermont selon les lignes directrices institutionnelles. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au guide des instituts nationaux de la santé pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Intravesical Tube Implantation
- Préparation de tubes et d'instruments pour la procédure chirurgicale
- Couper un morceau de PE10 de 7 cm pour former le cathéter pour l'implantation.
- Créez une étincelle à une extrémité du tube PE10 en avançant lentement l'extrémité vers une flamme nue.
REMARQUE: Retirez rapidement le tube dès que l'évasement se développe. - Appliquer trois gouttes de colle chaude polyvalente, en utilisant le réglage de chaleur faible sur un pistolet à colle, à 4,5, 5 et à 5,5 cm de l'extrémité évasée à l'extérieur du tube PE10. Ceux-ci aideront à sécuriser le tube au dos de l'animal. ( Figure 1 )
- Stériliser le tube en le trempant dans 70%Éthanol, puis rincer avec du NaCl stérile à 0,9% avant utilisation. Laissez le tube rempli pour éviter d'introduire des bulles d'air dans le système.
- Créez une fiche de calibre 30 pour sceller l'extrémité du cathéter PE10 en séparant une aiguille de calibre 30 du moyeu en manipulant manuellement l'extrémité proximale côte à côte. Appliquer une goutte de colle chaude à la fin. Assurez-vous que le joint est étanche. ( Figure 2 )
- Utilisez les instruments microchirurgicaux suivants: Deux paires de microforceps courbes Dumont # 7, deux paires de microforceps courbes Dumont # 5, une aiguille 21 G, un hémostatique droit ultrafine, des microcisifs, de petits ciseaux à dissection et un porte-micro-aiguille.
- Stériliser tous les instruments avant de commencer la procédure.
- Préparation de l'animal
- Après avoir anesthésié l'animal, raser d'abord la moitié inférieure de l'abdomen, puis tourner l'animal enclin et se raser et nettoyer la zone du haut du dos avec 70% d'alcool suivi de la betadine. Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux pour éviter la sécheresse. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux droites et émoussés et une paire de microforceps courbes Dumont # 7 pour effectuer une incision cutanée de 1,5 cm de long entre l'omoplate et placer l'animal en décubitus sur un coussin chauffant (37 ° C) recouvert de rideaux stériles.
- Enfin, nettoyez l'abdomen avec de l'alcool et de la betadine.
- Opération chirurgicale
REMARQUE: Effectuez toutes les interventions chirurgicales sous un microscope d'exploitation avec un grossissement allant de 3.15X à 20X. Après avoir placé l'animal sur les rideaux stériles, mettre des gants stériles. Continuez à utiliser des procédures stériles tout au long de la chirurgie.- Placez l'animal dans une boîte d'induction et anesthésie en utilisant 2% d'isoflurane inhalé avec un support d'oxygène (1 L / min). Maintenir l'anesthésie tout au long de la procédure en plaçant la tête de l'animal dans un cône de nez et en utilisant 2% d'isoflurane inhalé avec un support d'oxygène (1 L / min). Commencez la chirurgie après avoir reçu un négRéponse positive du test de pincement.
- Utilisez une paire de ciseaux francs et émoussés et une paire de microforceps courbes Dumont # 7 pour réaliser une incision abdominale inférieure de 1,5 cm dans la peau. Par la suite, créez une incision correspondante à travers le fascia le long du linea alba et du muscle pour exposer le dôme et la moitié supérieure de la vessie. Évitez de blesser la vessie en appliquant une traction vers le haut à chaque couche de tissu en utilisant une paire de microforceps courbes Dumont # 7. Garder les viscères abdominaux de la dessiccation en ajoutant des gouttes de solution saline physiologique chaude.
- Faites pivoter l'animal sur son côté pour accéder à l'incision sur la nuque. Poussez un hémostatique étroit par voie sous-cutanée par l'incision. Le canal sous-cutané devrait commencer par le dos et continuer le long du côté.
- Une fois que la pointe de l'instrument atteint le fond de la cage thoracique, tournez la pointe vers la ligne médiane et à l'intérieur de l'abdomen (il y aura une légère pop lors du perçage des muscles de la paroi abdominale). Continuez à avancer l'hémostatique jusqu'à ce que la pointe soit exposée à l'incision abdominale sous la couche musculaire. ( Figure 3 )
- Saisissez l'extrémité "non évasée" du tube avec l'hémostatique et retirez lentement l'outil, en tirant la fin du tube par l'incision à l'arrière du cou. Réglez l'extrémité évasée du tube afin qu'il soit directement au-dessus du dôme de la vessie.
- Faites une baguette lâche de la suture monofilamentée 6-0 (non absorbable) et placez-la sur le sommet de la vessie. Cette cravate sera utilisée plus tard pour sécuriser le tube dans la vessie.
- Placez un petit rouleau de tissu sans peluches dans l'abdomen et derrière la vessie pour aider à la stabiliser et à l'élever.
- Préparez-vous à insérer l'extrémité évasée du cathéter PE10 dans la vessie.
- Dans la main non dominante, maintenez le dôme de la vessie avec des microforceps courbes Dumont # 7 et maintenez cette poignée jusqu'à ce que le cathéter soit placé dans la vessie.
- Utilisez une aiguille de calibre 21 tO faire une cystotomie dans le sommet du dôme. Essuyez doucement la cystotomie avec une paire fermée de microforceps courbes n ° 5 pour s'assurer que le cathéter peut facilement passer à travers le trou.
- Tout en maintenant le dôme de la vessie dans la main non dominante, placez l'extrémité évasée du cathéter PE10 dans la vessie (enfoncez le flare vers le bas vers le col de la vessie afin qu'il ne glisse pas en le fixant).
- Attachez la suture monofilamentée 6-0 autour du dôme de la vessie et du tube avec la cravate placée antérieurement à la tubulure. Assurez-vous d'attacher la suture aussi haut que possible sur la vessie pour éviter de réduire artificiellement la capacité de la vessie. ( Figure 4 )
- Alternativement, fixez le cathéter à l'aide d'une suture à cordon de sac à main comme suit. Faire une suture de cordon de sac à main lâche sur le dôme de la vessie en utilisant un monofilament 6-0. Suivre les étapes 1.3.8.1 - 1.3.8.3 pour effectuer la cystotomie et insérer le cathéter. Fixez le tube en attachant la suture du cordon. ( Figure 5 )
- Testez la perméabilité et le joint du tube dans la vessie en attachant une seringue à insuline de 0,5 mL avec une aiguille de calibre 30 à l'extrémité distale du tube. Remplir lentement la vessie avec 0,1 à 0,2 ml de NaCl 0,9% jusqu'à ce qu'une goutte apparaisse à l'orifice de l'urètre, puis vider la vessie par aspiration. Il est important que la vessie soit à la fois remplie et vidée.
- Si aucune fuite ne se produit dans le dôme, appuier la vessie avec une paire de microforceps courbes et tirer doucement sur le tube jusqu'à ce que la flambée repose contre l'intérieur du dôme de la vessie.
- Avant de fermer, retirez le petit rouleau de papier et assurez-vous que la vessie est dans sa position normale.
- Fermez la paroi abdominale en deux couches (muscle et peau) avec une suture de course de 6-0. Il est préférable d'approcher le muscle du rectus abdominis en suturant uniquement les arêtes du fascia antérieur abdominal (paroi antérieure de la gaine rectale).
- Pour sécuriser le tube à l'arrière des animaux, doucementTate l'animal sur son abdomen. Insérer la partie sous-cutanée de l'ancre métallique dans l'incision interculturelle. ( Figure 12 ) Utilisez une suture 6-0 pour fixer le tube et l'ancre en les encerclant avec une suture de matelas verticale.
- Assurez-vous qu'une bulle de colle reste au-dessus et au-dessous de la peau pour éviter que le tube ne s'arrête. Couper le tube à environ 2 cm au-dessus de la peau.
- Insérez délicatement la fiche à calibre 30 (étape 1.1.5) dans l'extrémité du tube pour empêcher l'urine de fuir.
- Injecter par voie sous-cutanée 0,5 ml de NaCl à 0,9% pour l'hydratation. Donner une analgésie post-opératoire immédiatement après la chirurgie et maintenir pendant 48 h.
- Placez l'animal dans sa cage située sous une lampe infrarouge. Maintenir une observation constante jusqu'à ce que l'animal se déplace librement dans la cage.
- Surveillez quotidiennement l'animal et laissez-le récupérer pendant 5 jours avant l'enregistrement.
2. Kysté réveilléEnregistrement d'ometrie
- Préparation du programme d'enregistrement, du transducteur de pression et de la pompe à perfusion.
- Avant d'anesthésier l'animal, connectez la pompe à perfusion, le transducteur de pression et le pivot 22 G à l'aide de tubes PE50. ( Figure 6 )
- Ouvrez le programme d'enregistrement (voir la table des matières pour un exemple), sur un ordinateur pour étalonner la pression du système et préparer l'enregistrement. Assurez-vous d'utiliser les mêmes paramètres pendant l'étalonnage et l'enregistrement.
- Remplir une seringue de 20 ml avec 10 à 15 ml de température ambiante 0,9% de NaCl et charger dans la pompe à perfusion. Programmer la pompe pour infuser à un taux de 0,6 mL / h.
- Fixez le transducteur de pression à la même hauteur que la vessie de l'animal ou le fond de la cage d'enregistrement.
- Fixez le pivot de calibre 22 à la fin du transducteur de pression (PE50 - tube - transducteur de pression pour pivoter)
REMARQUE: le pivot est utilisé pour empêcher le tube de tordre ou de tordre unS l'animal se déplace. - Avancez la pompe de la seringue pour rincer 0,9% de NaCl dans le système. Assurez-vous d'enlever toutes les bulles d'air avant d'étalonner.
- Lorsque le programme d'enregistrement fonctionne, utilisez une règle pour étalonner la pression (cm / H 2 O). Déplacez lentement la longueur de l'attache PE50 de 0 à 30 cm. Ajustez le zéro si nécessaire.
REMARQUE: La marque de 0 cm doit être à la même hauteur que le sol de la cage d'enregistrement et du transducteur de pression.
- Suspendre le pivot de calibre 22 au-dessus du centre de la cage d'enregistrement. Assurez-vous que le fond de la cage permet à l'urine de tomber sur le collecteur de la balance positionnée au-dessous de la cage. Réglez la hauteur de l'attache afin que la souris puisse se déplacer librement autour de la cage sans forcer ou étirer le tube. ( Figure 7 )
- Une fois terminé, vérifiez que le système et le tube externe PE50 sont remplis de NaCl à 0,9% et toutes les bulles d'air ont été retirées.
- PréparationL'enregistrement de l'animal pour l'enregistrement
- Anesthésier l'animal avec 2% d'isoflurane inhalé et le placer sur son abdomen. Retirez la fiche de calibre 30 et faites glisser le tube PE10 (cathéter vessie) à l'extrémité de la sangle PE50. Utilisez de la colle chaude pour former un joint étanche à l'eau.
- Éteignez l'anesthésie et placez l'animal dans la cage d'enregistrement avec un plancher en fil parallèle, ce qui permettra à l'urine de tomber directement sur un dispositif collecteur placé sur une balance analytique. ( Figure 7 )
- Commencez l'enregistrement une fois que l'animal est dans la cage, mais ne commencez pas à infuser. Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il récupère complètement de l'anesthésie. Une fois que la pression de la vessie se stabilise, commencer à infuser 0,9% de NaCl à un taux de 0,6 mL / h.
REMARQUE: Effectuez une note dans le programme d'enregistrement lorsque des modifications sont apportées. Il est important d'avoir un compte rendu de la début de la perfusion, des arrêts ou des irrégularités. - Vérifiez le système pour détecter les fuites et assurez-vous que l'animal a facilement accEssence et eau.
- Continuer l'enregistrement dans une pièce tranquille jusqu'à ce que trois cycles de miction puissantes soient obtenus.
REMARQUE: l'animal doit être totalement perturbé tout au long de l'enregistrement. De préférence, utilisez la surveillance vidéo à distance pour observer le comportement.
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Representative Results
Il n'y avait pas de différence significative entre les matériaux et les diamètres des tubes dans la consistance de l'augmentation de la pression et tombent dans le système pendant l'occlusion du tube. L'implantation du tube intravésical après gonflement de la paroi de la vessie était significative pour les matériaux en polyéthylène (PE) et en polyuréthane (PU). Le jour 2, un gonflement sous-muqueux sévère s'est développé. Il occupait la moitié de la section transversale de la vessie, entraînant une obstruction de la lumière. Le jour 5, l'œdème a complètement résolu, en laissant les zones sous-muqueuses infiltrées avec des cellules inflammatoires qui ont en partie envahi le muscle. Le jour 7, l'infiltration inflammatoire a été considérablement réduite et l'histologie de la paroi de la vessie est revenue à la normale ( figure 8 ). La plus grande étendue de gonflement des tissus observée au jour 2 et au jour 3 était en corrélation avec les données anormales comportementales montrant une déficience significative de la fonction de la vessie ( figure 9 ). Fréquence d'annulation normalisée par po Le jour de l'opération 5.
La pression intravechique dans une souris éveillée en mouvement libre (avec des artefacts de mouvement minimaux) se caractérise par une pression de base de 10 à 15 cm H 2 O, qui peut rester inchangée ou augmenter progressivement de plus de 10 cm H 2 O pendant le cycle de remplissage , Suivie d'une augmentation de pression soudaine et pulsatile, puis baisse pendant l'annulation ( Figures 10 et 11 ).
Figure 1: Tubes PE10 pour l'implantation dans la vessie urinaire. ( A ) Un morceau de PE10 de 7 cm avec des gouttes de colle chaude à 4,5, 5 et à 5,5 cm de l'extrémité évasée. ( B et C ) Une image détaillée montrant l'extrémité évasée du tube (utilisé pour sécuriser le tube dans la vessie).Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Plug for the External Portion of the PE10 Bladder Tubing. La fiche est fabriquée à partir d'une aiguille 30 G et d'une colle chaude. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Cours du tube de vessie. Dessin de ligne schématique illustrant le placement du tube dans l'abdomen et sa voie sous-cutanée vers la nuque. Cliquez ici pour voir un plus grandVersion de ce chiffre.
Figure 4: comparaison de la vessie / tube et étapes utilisées pour insérer et sécuriser le tube à l'aide d'une suspension de suture monofilamentaire. Des photographies intra-opératoires illustrant: ( A ) Image comparant PE50 et PE10 à une vessie urinaire de souris. ( B ) Une petite boucle de suture monofilamentée 6-0 placée autour de la vessie. Une paire de microforceps n ° 5 accroche le dôme de la vessie tandis qu'une aiguille de 21 G est utilisée pour faire la cystotomie. ( C ) Sans libérer le dôme de la vessie, une paire de microforceps n ° 5 dans la main opposée sond les trous avant d'insérer le cathéter PE10. ( D ) cathéter PE10 sécurisé dans le dôme de la vessie avec une suture monofilamentée 6-0. Cliquez ici s'il vous plaitPour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Une Suture à cordes de sac à main peut être utilisée comme méthode alternative pour sécuriser le tube dans la vessie. ( A ) Suture de cordon dans le dôme de la vessie. ( B ) tube PE10 inséré à travers un centre de la corde du sac. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Mise en place expérimentale. Seringue contenant 0,9% de NaCl dans la pompe à perfusion connectée en série au transducteur de pression et au cathéter intravésical. L'écran de l'ordinateur en bas à droite montre trois mict reproductiblesCycle de l'âge. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Configuration expérimentale de l'enregistrement. ( A ) 22 G pivot suspendu sur une cage d'enregistrement et un équilibre. ( B ) Photographie montrant toute la longueur de la partie externe du tube de perfusion avec un pivot 22 G et une attache PE50. ( C ) Un pivot 22 G avec une gaine de ressort couvrant le tube PE50. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8: Évaluation histologique du ReRéponse du mur de la vessie urinaire à un tube PE10 implanté. Les coupes transversales de la vessie sont colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) avant, 2, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie. L'enflure de la paroi de la vessie est résolue le jour postopératoire 5. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9: Évaluation fonctionnelle de la vessie à l'aide de l'analyse par spottage. Points d'urine sur le papier filtre vu avec une lumière UV documentant le motif représentatif de la miction au jour 0 (avant l'implantation du tube), 2, 3, 4, 5 et 7 post-intravésicale tube implant. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 10: Cystométrogramme. Traces représentatives de la pression intravésique de la vessie dans une souris éveillée et librement mobile. Trace montrant 3 cycles de microprocessions reproductibles. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 11: Phase de Miction. Trace représentant la phase de miction avec des oscillations à haute fréquence lors de l'augmentation initiale de la pression, de la pression maximale et d'une chute de pression rapide à la ligne de base. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 12: ancrage de l'attache. ( A ) Ancre utilisée pour fixer le cathéter PE10 dans l'animal et empêcher le tube de pulper sur la vessie. Le disque est attaché à la gaine de ressort. ( B ) Capteur interne PE10 connecté au tube externe PE50. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 13: ancre pivotante. Partie sous-cutanée de l'ancre consistant en ( 1 ) un disque en tissu et ( 2 ) une boucle en métal.
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Discussion
Matériau optimal et taille du tube intravésiculaire
Pour déterminer l'effet du diamètre du tube sur les enregistrements de pression, nous avons testé différents tubes microfluidiques; PE50 (0,58 mm ID), polyuréthane PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) et PE10 (0,28 mm ID). Pour chaque tube, la pression a été enregistrée avec la pompe à perfusion à 1 mL / h, tout en déplaçant rapidement le tube verticalement de 0 à 30 cm. Les expériences initiales in vivo ont tenté d'utiliser le tube PE50, mais ont échoué en raison de la taille des tubes par rapport à la vessie de la souris ( figure 4A ). Bien que cela confirme la conclusion de Smith et Kuchel, qui suggèrent que l'utilisation de tubes PE50 pour la cystométrie réveillée dans une souris crée des artefacts, ce qui rend difficile l'interprétation des données 12 , il est important de noter que d'autres ont utilisé avec succès des tubes PE50 à la fois sans rétention , Réveillé et inhibé la cystométrie de souris. 9 , <SUP class = "xref"> 13 , 14 Comparé au PE50, le PE10 est plus souple, ce qui réduit la quantité de tension que le tube applique à la vessie à mesure que la souris se déplace, réduisant les artefacts du mouvement. Il est important que la section de PE10 soit aussi courte que possible (≤ 7 cm). Un tube PE10 plus long conduit à une plus grande probabilité que la pression de lecture soit humidifiée. Bien qu'il existe un avantage théorique à utiliser un matériau plus doux, plus bio-inerte comme le PU pour l'implantation intravésique pour diminuer la réaction inflammatoire, il n'a pas entraîné de différence significative dans le gonflement post-opératoire de la vessie. En outre, les essais qui ont utilisé le tube PU plus doux, ont été associés à la pliure et à la branchement.
Effets de la chirurgie sur la contractilité et l'enflure de la paroi de la vessie
Jusqu'à présent, les données sur la fonction de la vessie et le gonflement de la paroi de la vessie, après l'implant d'un tube intravésical, n'étaient disponibles que pour les rats. Selon les précédents sLe volume de la miction était plus faible et la fréquence des miction était plus élevée aux jours postopératoires 1 - 3. 15 On a également montré que les altérations de la fonction de la vessie d'un rat étaient associées à un gonflement sévère de la vessie, l'œdème commençant à diminuer après 3 journées. 16 Pour mieux comprendre le changement dans la fonction de la vessie urinaire, l'enflure de la paroi de la vessie et la chronologie de réparation des souris mâles, C57BL / 6, qui proviennent de l'implantation du tube PE10, une fréquence de mictions comportementales de 12 heures a été évaluée à l'aide de la méthode d'enregistrement du papier filtre . Après le dernier enregistrement, la souris a été anesthésiée et la vessie a été grossièrement évaluée, récoltée, fixée et évaluée histologiquement. Lors de la chirurgie post-opératoire 1 et 2, la fréquence d'annulation a diminué et le repérage a augmenté, suivi d'une augmentation de l'annulation d'ici le 3ème jour. Le comportement d'anesthésie s'est normalisé au jour 5. L'évaluation brute des vessies lors de la récolte et la coloration H & E révélées ont révélé le montant le plus élevéD'enflure subtrotéliale chez les jours 2 et 3 post-opératoires, les vessies devenant semblables aux vessies témoins au jour 5 et 7 suite à l'implant tubulaire.
Comme pour les études cliniques en urodynamique, la majorité des laboratoires ont utilisé la température ambiante à 0,9% de NaCl. 11 Le taux de perfusion dans les études précédentes varie considérablement de 10 μL / min à 100 μL / min. 17 , 18 Une étude comparant les effets de différents taux de perfusion sur la fonction de la vessie chez une souris n'a pas été effectuée, mais les données obtenues dans des études plus grandes sur les animaux ont recommandé que des taux de remplissage plus lents soient utilisés. En raison du petit volume de la vessie de souris, les pompes péristaltiques ne sont pas appropriées et une pompe à perfusion à mécanisme continu est nécessaire.
Les enregistrements FC les plus précis et utilisables permettent d'équilibrer la bonne transmission des changements de pression avec des artefacts limités. Les résultats obtenus en utilisantUn court segment de tube PE10 connecté directement au PE50 a fourni une mesure précise de la pression dans la vessie urinaire de la souris. Les fluctuations de pression causées par le mouvement de l'animal peuvent être limitées par l'ancrage du tube sur la peau au point où il sort à la nuque ( Figures 12 et 13 ). Cela pourrait être réalisé grâce à l'utilisation de bulles de colle et d'une ancre spécial constituée d'une plaque métallique recouverte de tissu placée par voie sous-cutanée, et la pièce externe, qui est fixée au ressort métallique qui recouvre le tube. Des procédés supplémentaires pour empêcher le tube de tirer sur la vessie comprennent la création d'une piste sous-cutanée incurvée pour la partie interne du tube PE10, qui assure un jeu dans le tube, et en utilisant un pivot et une attache, ce qui empêche la torsion et le pliage. Selon la littérature et les preuves fournies par ces études, les étapes suivantes sont recommandées pour fournir la méthode la plus reproductible et physiologiquement précise pour in vivoEnregistrement de la pression intravésique dans une souris. Utilisez un microscope opérationnel et des outils microchirurgicaux pour implanter le cathéter dans le dôme de la vessie. Permettre une période de récupération de 5 jours entre la chirurgie et l'enregistrement. Acclimater l'animal dans la même cage que l'enregistrement sera effectué et fournir un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Effectuez l'expérience dans un environnement silencieux avec un contact humain minimal, utilisez idéalement une surveillance vidéo à distance pour observer le comportement de l'animal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
