दोहराया ओजोन जोखिम से चूहों में एक जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग मॉडल की पीढ़ी

Summary

इस अध्ययन के एक नए जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी) के सफल पीढ़ी का वर्णन करता है एक बार फिर से ओजोन के उच्च सांद्रता के लिए चूहों को उजागर द्वारा पशु मॉडल ।

Abstract

जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी) लगातार airflow सीमा और फेफड़ों parenchymal विनाश की विशेषता है । यह उंर बढ़ने की आबादी में एक बहुत ही उच्च घटना है । सीओपीडी के लिए वर्तमान पारंपरिक उपचारों मुख्य रूप से लक्षण-संशोधित दवाओं पर ध्यान केंद्रित; इस प्रकार नए उपचारों के विकास की तत्काल आवश्यकता है । सीओपीडी के योग्य पशु मॉडल अंतर्निहित तंत्र को चिह्नित करने में मदद कर सकता है और नई दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान सीओपीडी मॉडल, जैसे lipopolysaccharide (एलपीएस) या सुअर अग्नाशय elastase (पीपीई)-प्रेरित वातस्फीति मॉडल, फेफड़ों और एयरवेज में सीओपीडी तरह के घावों उत्पन्न करते हैं, लेकिन अन्यथा मानव रोगजनन के सीओपीडी सदृश नहीं है । एक सिगरेट का धुआं (सीएस) प्रेरित मॉडल सबसे लोकप्रिय में से एक है क्योंकि यह न केवल श्वसन प्रणाली में सीओपीडी तरह के घावों simulates रहता है, लेकिन यह भी मुख्य खतरनाक सामग्री है कि मनुष्यों में सीओपीडी का कारण बनता है में से एक पर आधारित है । हालांकि, समय लेने वाली और श्रम-सीएस प्रेरित मॉडल के गहन पहलुओं को नाटकीय रूप से नई दवा स्क्रीनिंग में अपने आवेदन की सीमा । इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक ओजोन के उच्च स्तर के लिए चूहों को उजागर करके एक नया सीओपीडी मॉडल उत्पन्न. यह मॉडल निंनलिखित का प्रदर्शन किया: 1) कम मजबूर expiratory मात्रा 25, ५०, और 75/मजबूर महत्वपूर्ण क्षमता (फेव₂₅/FVC, फेव_५०/FVC, और फेव_७५/FVC), फेफड़े समारोह की गिरावट का संकेत; 2) बढ़े हुए फेफड़े के alveoli, फेफड़े parenchymal विनाश के साथ; 3) थकान समय और दूरी कम; और 4) सूजन में वृद्धि हुई । एक साथ लिया, इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि ओजोन एक्सपोजर (ँ) मॉडल एक विश्वसनीय पशु मॉडल है कि मनुष्य के समान है क्योंकि ओजोन जोखिम सीओपीडी के etiological कारकों में से एक है । इसके अतिरिक्त, यह केवल 6-8 सप्ताह लिया, हमारे पिछले काम के आधार पर, एक ँ मॉडल बनाने के लिए, जबकि यह 3-12 महीने की आवश्यकता के लिए सिगरेट का धुआं मॉडल प्रेरित है, यह दर्शाता है कि ँ मॉडल सीओपीडी अनुसंधान के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है ।

Introduction

यह अनुमान लगाया गया है कि सीओपीडी, वातस्फीति और क्रोनिक ब्रोंकाइटिस सहित, दुनिया में २०२०^1,2में मौत का तीसरा प्रमुख कारण हो सकता है । ४० साल की उम्र में एक आबादी में सीओपीडी की संभावित घटनाओं में पुरुषों में १२.७% और अगले ४० साल के भीतर महिलाओं में ८.३% का अनुमान है³. कोई दवा वर्तमान में सीओपीडी रोगियों में प्रगतिशील गिरावट रिवर्स करने के लिए उपलब्ध हैं⁴. सीओपीडी के विश्वसनीय पशु मॉडल न केवल बीमारी रोग प्रक्रिया की नकल की मांग करते हैं, लेकिन यह भी एक छोटी पीढ़ी की अवधि की आवश्यकता है । एलपीएस या एक पीपीई-प्रेरित मॉडल सहित वर्तमान सीओपीडी मॉडल, वातस्फीति लक्षण^5,6की तरह प्रेरित कर सकते हैं । एक भी प्रशासन या एलपीएस या चूहों के लिए पीपीई की लंबी चुनौती या चूहों में चिह्नित neutrophilia में bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF), बढ़ जाती है समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों (जैसे, TNF-α और IL-1β) BALF या सीरम में, फेफड़ों का उत्पादन parenchymal विनाश-बढ़े हुए वायु रिक्त स्थान, और सीमाएं airflow^5,6,7,8,9,10. हालांकि, एलपीएस या पीपीई मानव सीओपीडी के कारण नहीं है और इस तरह रोग प्रक्रिया¹¹नकल नहीं है । एक सीएस प्रेरित मॉडल एक लगातार airflow सीमा, फेफड़े parenchymal विनाश, और कम कार्यात्मक व्यायाम क्षमता का उत्पादन किया । हालांकि, एक पारंपरिक सीएस प्रोटोकॉल एक सीओपीडी मॉडल^12,13,14,15उत्पंन करने के लिए कम से कम 3 महीने की आवश्यकता है । इस प्रकार, यह एक नया, और अधिक कुशल पशु मॉडल है कि दो आवश्यकताओं को पूरा उत्पंन महत्वपूर्ण है ।

हाल ही में, सिगरेट धूंरपान के अलावा, वायु प्रदूषण और व्यावसायिक जोखिम सीओपीडी^16,17,18के अधिक आम कारण बन गए हैं । ओजोन, प्रमुख प्रदूषकों में से एक के रूप में (हालांकि नहीं वायु प्रदूषण के प्रमुख घटक), सीधे श्वसन पथ के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और दोनों बच्चों और युवा वयस्कों के फेफड़े के ऊतकों को नुकसान^{19,20,21 ,22,23,24,25}. ओजोन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एलपीएस, पीपीई, और सीएस सहित अंय उत्तेजितियों, फेफड़े के oxidative तनाव और डीएनए क्षति के जैव रासायनिक रास्ते के एक गंभीर में शामिल है और दीक्षा और सीओपीडी के^26,27के संवर्धन से जुड़े हुए हैं । एक और पहलू यह है कि कुछ सीओपीडी रोगियों के लक्षण ओजोन को उजागर होने के बाद बिगड़ती है, यह दर्शाता है कि ओजोन फेफड़े समारोह^18,28,29को बाधित कर सकते हैं । इसलिए, हम एक बार 7 सप्ताह के लिए ओजोन की उच्च सांद्रता के लिए चूहों को उजागर द्वारा एक नया सीओपीडी मॉडल उत्पंन; यह airflow दोषों और फेफड़े parenchymal नुकसान पिछले जांच के उन लोगों के लिए इसी तरह के परिणामस्वरूप^30,31,३२। हम इस अध्ययन में महिला चूहों को ँ प्रोटोकॉल बढ़ाया और सफलतापूर्वक हमारे पिछले अध्ययन में पुरुष चूहों में मनाया वातस्फीति^30,31,३२। क्योंकि सीओपीडी मृत्यु दर में पुरुषों में कमी आई है लेकिन कई देशों में महिलाओं में वृद्धि हुई है^३३, मादाओं में एक सीओपीडी मॉडल के तंत्र का अध्ययन करने और महिला सीओपीडी रोगियों के लिए चिकित्सीय तरीके विकसित करने की जरूरत है । ँ मॉडल के सभी लिंग के लिए लागू एक सीओपीडी मॉडल के रूप में इसके उपयोग के लिए आगे समर्थन बख्शी ।

Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: ँ मॉडल तैयार किया गया है और पहले रिपोर्ट किए गए शोध में प्रयुक्त < सुप class = "xref" > 30 ^, < सुप class = "xref" > 31 ^, < सुप class = "xref" > 32 . सभी पशु प्रयोगों शंघाई Jiaotong विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

< p class = "jove_title" > 1. चूहे

1. घर रोगज़नक़-नि: शुल्क, 7-9 सप्ताहीय महिला बालब के लिए एक जानवर की सुविधा में व्यक्तिगत हवादार पिंजरों में चूहों नियंत्रित तापमान के तहत (20 & #176; ग) और आर्द्रता (४०-६०%) । सुविधा उपलब्ध कराने के लिए 12 & #160; ज लाइट और 12 & #160; ज डार्क सायकल प्रदान करें । खाना और पानी उपलब्ध कराना ad libitum .

< p class = "jove_title" > 2. ओजोन या एयर एक्सपोजर

1. एक सील एक्रिलिक ( जैसे Perspex) बॉक्स में एक बिजली जनरेटर के साथ ओजोन उत्पन्न करते हैं । एक हवा वेंट पाइप के माध्यम से एक छोटा सा हवा ब्लोअर का उपयोग कर बॉक्स के बाहर हवा झटका है कि बॉक्स के अंदर और बाहर पर जुड़ा हुआ है । एक ओजोन जांच का उपयोग कर बॉक्स में ओजोन की एकाग्रता की निगरानी । रुको जब तक ओजोन की एकाग्रता बॉक्स में २.५ भागों प्रति मिलियन (पीपीएम) तक पहुंचता है ।
   नोट: ओजोन जांच में स्वचालित रूप से ओजोन जनरेटर स्विच ऑन या ऑफ कर सकते हैं और २.५ पीपीएम पर बॉक्स में ओजोन स्तर को बनाए रख सकते हैं ।
2. बॉक्स में चूहों जगह जब ओजोन का स्तर २.५ पीपीएम तक पहुंच जाता है । चूहों को बॉक्स में 3 एच के लिए हर बार उन्हें ओजोन को बेनकाब करने के लिए रखें.
   नोट: बॉक्स स्वचालित रूप से ओजोन जनरेटर पर या बंद और सह ₂ कि बक्से के बाहर चूहों द्वारा उत्पादित है उड़ाने के द्वारा 3 एच के दौरान २.५ पीपीएम के एक ओजोन स्तर बनाए रख सकते हैं ।
3. दो ओजोन जोखिम (प्रत्येक प्रति सप्ताह स्थाई 3 घंटे) (एक बार हर 3 दिन) 7 सप्ताह के लिए दे; नियंत्रण चूहों एक ही समय में हवा के लिए और एक ही अवधि के लिए बेनकाब ।

< p class = "jove_title" > 3. सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी

1. सप्ताह के अंत में 7, anesthetize चूहों के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ pelltobarbitalum natricum (1%, ०.६-०.८ एमएल/100 g) & #160; खुराक समायोजित अलग स्थितियों के अनुसार देखने के लिए कि माउस नहीं है एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब. & #160; मॉनिटर और एक स्थिर श्वास आवृत्ति पर माउस रखें; और सुनिश्चित करें कि कोई स्वैच्छिक गति प्रक्रियाओं के दौरान मौजूद है ।
2. जगह anesthetized चूहों के चैम्बर में एक सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (& #181; सीटी).
3. मानक प्रोटोकॉल और निर्माता & #39; s निर्देश का उपयोग कर & #181; सीटी जांचना । ५० केवी पर एक्स-रे ट्यूब सेट और चालू ४५० & #181; A.
   नोट: चूहों के आसपास एक्स-रे और डिटेक्टर दोनों घुमाएं ।
4. प्रदर्शन & #181; सीटी विश्लेषण ०.०९२ mm के एक प्रभावी पिक्सेल आकार के साथ ५१५ अनुमानों, एक स्लाइस के लिए ३०० ms के एक जोखिम समय, और ०.०९३ mm.
की एक टुकड़ा मोटाई प्राप्त करके ।
5. एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहीत छवियों के साथ फेफड़ों का पुनर्निर्माण । स्केल-७५० और-५५० Hounsfield इकाइयों, क्रमशः स्केल की न्यूनतम और अधिकतम सेट करके ग्रेस्केल छवि चमक समायोजित करें ।
   नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से फेफड़ों पैरेन्काइमा के संस्करणों की गणना करेगा और कम क्षीणन क्षेत्र (इल्लल्लाह) < सुप वर्ग = "xref" > ३४ ^, < सुप वर्ग = "xref" > ३५ .
6. कुल फेफड़ों की मात्रा से इल्लल्लाह मात्रा विभाजित करके इल्लल्लाह (इल्लल्लाह%) के प्रतिशत की गणना करें ।

< p class = "jove_title" > 4. ट्रेडमिल टेस्ट

1. एक चल ट्रेडमिल मशीन पर 10 मिनट के लिए 10 एम/मिनट की गति से चूहों एक अनुकूलन परीक्षण दे । & #160; नोट: बिजली हमेशा बंद है जब प्रक्रिया आयोजित की जा रही है । & #160;
2. व्यवस्थापन a चूहों के लिए थकान परीक्षण.
   1. 5 मिनट के लिए 10 मीटर/मिनट की गति से चूहों को गर्म
   2. 10 min.
   के लिए 15 m/
   3. व्यायाम तीव्रता बढ़ाने के लिए: 5 एम/मिनट, 20 एम/मिनट से शुरू, हर 30 मिनट तक चूहों को चलाने के लिए जारी नहीं कर सकते तक गति बढ़ाने < सुप वर्ग = "xref" > ३६ .
3. कुल चल दूरी रिकॉर्ड और थकान दूरी और थकान समय के रूप में चल रहे समय, क्रमशः ।

< p class = "jove_title" > 5. पल्मोनरी फंक्शन माप

1. Anesthetize चूहों intraperitoneal pelltobarbitalum के एक natricum इंजेक्शन के साथ (1%, ०.६-०.८ मिलीलीटर/व्यक्तिगत स्थितियों के अनुसार खुराक समायोजित करें देखने के लिए कि माउस करता है एक पाँव चुटकी & #160 का जवाब न देना; और रुको जब तक चूहों ने सहज श्वास को बनाए रखा है. & #160; मॉनिटर और एक स्थिर श्वास आवृत्ति पर माउस रखें; और सुनिश्चित करें कि कोई स्वैच्छिक गति प्रक्रियाओं के दौरान मौजूद है ।
2. सावधानी से चूहों को tracheostomize और उन्हें एक ऐसे बॉडी plethysmograph में जगह दें जो कंप्यूटर नियंत्रित वेंटीलेटर से जुड़ा हो ।
   नोट: वेंटिलेशन endotracheal ट्यूब के लिए समीपस्थ स्थित एक वाल्व के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है । सेटअप अर्ध-स्थैतिक दबाव मात्रा और तेज प्रवाह मात्रा के छल सहित अलग अर्द्ध स्वचालित युद्धाभ्यास, प्रदान करता है ।
3. एक नियमित श्वास पैटर्न और प्रत्येक श्वास चक्र पर पूरा समय सीमा समाप्ति तक दबाव नियंत्रित वेंटिलेशन के माध्यम से anesthetized माउस को १५० सांसों/
की एक औसत श्वास आवृत्ति लागू
4. plethysmograph.
में उत्पन्न नकारात्मक दबाव का उपयोग करके अर्ध-स्थैतिक दबाव-मात्रा पैंतरेबाज़ी डिवाइस के साथ प्रदर्शन
5. FVC और फेव रिकॉर्ड करने के लिए अर्ध-स्थैतिक दबाव मात्रा छोरों के भीतर तेजी से प्रवाह मात्रा पैंतरेबाज़ी प्रदर्शन करते हैं । फेफड़ों को फुलाना + 30 cm h ₂ o और तुरंत बाद में इसे एक अत्यधिक नकारात्मक दबाव को समाप्त करने के लिए कनेक्ट जब तक अवशिष्ट मात्रा पर है-30 सेमी एच ₂ हे । फेव का रिकॉर्ड पहले 25, ५०, और ७५ ms छोड़ना (फेव ₂₅ , फेव _५० , और फेव _७५ , क्रमशः) । उपश्रेष्ठतम युद्धाभ्यास अस्वीकारें । हर एक माउस के साथ प्रत्येक परीक्षण के लिए, सभी संख्यात्मक मापदंडों के लिए एक विश्वसनीय मतलब प्राप्त करने के लिए तीन स्वीकार्य युद्धाभ्यास की एक न्यूनतम आचरण.

< p class = "jove_title" > 6. BALF संग्रह

1. pelltobarbitalum natricum के साथ टर्मिनल संज्ञाहरण के बाद ((1%, 1.8-2.4 मिलीलीटर/& #160; खुराक समायोजित करें अलग स्थितियों के अनुसार देखने के लिए कि माउस एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है और सांस खो), & #160; लेवेज एक 1 मिमी व्यास endotracheal ट्यूब के माध्यम से पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ चूहों और फिर पुनः प्राप्त BALF < सुप वर्ग = "xref" > १० .
2. पूल प्राप्त लेवेज aliquots और उन पर केंद्रापसारक 4 & #176; सी और 10 मिनट के लिए २५० x g.
3. तुरंत उपयोग के लिए supernatant को एकत्रित करें और शेष को स्टोर पर-८० & #176; C या तरल नाइट्रोजन.
किसी hemocytometer. का उपयोग करके कक्षों की कुल संख्या की गणना
5. पंजाब में सेल गोली फिर से सस्पेंड और फिर स्पिन (१,४०० x g, 6 min) २५० & #181; एक स्लाइड स्पिनर के उपयोग की स्लाइड पर reसस्पैंड कोशिकाओं के एल केंद्रापसारक ।
6. लागू करें के अनुसार स्लाइड पर कक्षों को राइट धुंधला करना निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल.
7. गणना २०० कोशिकाओं प्रति माउस; मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल के रूप में कोशिकाओं की पहचान, मानक आकृति विज्ञान के अनुसार, 400X आवर्धन के तहत, और उनकी संख्या गिनती.

< p class = "jove_title" > 7. कार्डिएक रक्त नमूना

1. हृदय पंचर के माध्यम से रक्त इकट्ठा, यह १.५-एमएल ट्यूबों में लोड, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए.
2. 5 मिनट के लिए रक्त के नमूनों को २,००० x g और 4 & #176; C.
3. एक नई ट्यूब के लिए supernatant (सीरम) हस्तांतरण और यह दुकान पर-८० & #176; ग या तरल नाइट्रोजन.
4. आईएल-1 & #946;, आईएल-10, और TNF-& #945; संबंधित एलिसा किट का उपयोग कर जांच परीक्षण के लिए सीरम तैयार करें ।

< p class = "jove_title" > 8. फेफड़े Morphometric विश्लेषण

1. चूहों से टुकड़े फेफड़ों और tracheas ।
   1. एक शल्य चिकित्सा बोर्ड पर एक euthanized माउस की स्थिति तुरंत बलिदान के बाद ।
   2. टुकड़े दूर platysma और पूर्वकाल सांस मांसपेशियों को कल्पना और सांस के छल्ले का उपयोग करने के लिए ।
   3. वक्ष गुहा खोलो । फेफड़ों और श्वासनली को टुकड़े, लेकिन दिल को फेफड़ों से अलग न करें ।
2. एक PE90 पॉलीथीन ट्यूब के माध्यम से 4% paraformaldehyde युक्त सिरिंज के लिए endotracheal कैथेटर कनेक्ट.
   सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है । दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहनें और एक धुएं हुड के अंदर समाधान का उपयोग करें ।
3. फेफड़े फुलाना पूरी तरह से 4% paraformaldehyde का उपयोग (10 बूंदें, ~ २०० & #181; L) endotracheal कैथेटर के माध्यम से । मुद्रास्फीति के पूरा होने के बाद दिल निकालें ।
4. एक 15 & #160 में फेफड़ों को बनाए रखने के लिए; एमएल ट्यूब युक्त 4% paraformaldehyde के 10 मिलीलीटर कम से 4 h.
के लिए
5. तेल में फेफड़ों एंबेड । एक रोटरी microtome के साथ आयल ब्लॉक खोदी द्वारा 5-& #181; मी वर्गों को प्राप्त करें । अनुभाग के दौरान, फेफड़ों के ऊतकों की अधिकतम सतह क्षेत्र के भीतर के पेड़ क्षेत्र का पर्दाफाश ।
6. morphometric विश्लेषण के लिए, प्रदर्शन hematoxylin और eosin (ज & #38; ङ) वर्गों पर दाग.
7. छवि एक उज्ज्वल क्षेत्र ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ वर्गों (उद्देश्य लेंस, 20X; एक्सपोजर टाइम, १.६६७ ms).
8. दो जांचकर्ताओं उपचार प्रोटोकॉल स्वतंत्र रूप से ऊतकीय वर्गों की गणना करने के लिए अंधा कर दिया है । अंतर-वायुकोशीय septal वॉल की दूरी मापने के लिए एक पैरामीटर के रूप में माध्य रेखीय अवरोधन (L _m ) का उपयोग करें । का निर्धारण L _m निंन चरणों का उपयोग:
   1. फ़ोटोशॉप में वर्गों की छवियों को खोलने और ५ ५५० & #181 के साथ छवि पर एक reticule-ग्रिड ड्रा; m & #160; लंबी लाइनें.
   2. ग्रिड लाइन में alveoli की संख्या गिनती.
   3. की गणना alveoli की संख्या के आधार पर ग्रिड लाइन की लंबाई को विभाजित करके L _m । ठहराव के लिए, प्रति माउस पांच वर्गों छवि । प्रत्येक खंड के दस छवियों (क्षेत्र के प्रति एक छवि) का अधिग्रहण और बेतरतीब ढंग से आकलन । फ़ील्ड चयन के दौरान, एक फ़ील्ड को आगे या दूसरी दिशा में ले जाकर वायुमार्ग और जहाजों के फ़ील्ड्स से बचें ।
      नोट: डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है माध्य & #177; S.E.M. एक संयुक्त राष्ट्र युग्मित टी परीक्षण हवा उजागर चूहों और ओजोन उजागर चूहों के बीच तुलना के लिए बाहर किया गया था । प्रत्येक समूह के तीन पशुओं को महत्वपूर्ण अंतर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । & #60; ०.०५ के अ p मान को भरपुर माना गया ।

Representative Results

प्रत्येक समूह की 3d µ सीटी छवियों के उदाहरण चित्रा 1एमें प्रदर्शित होते हैं । ओजोन उजागर चूहों एक काफी बड़ा कुल फेफड़ों की मात्रा थी (चित्रा 1ए और बी) और इल्लल्लाह% (चित्रा 1ग) से हवा में नियंत्रण चूहों को उजागर किया था. फेफड़ों की मात्रा और इल्लल्लाह% ओजोन जोखिम^31,३२के छह सप्ताह के बाद बुलंद रहे । फेफड़ों की मात्रा में वृद्धि और इल्लल्लाह% वातस्फीति phenotype प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्रा 2में फेफड़ों वायुकोशीय इज़ाफ़ा के उदाहरणएक वातस्फीति गठन वर्णन । मतलब रैखिक अवरोधन (एल एम) में वृद्धि ओजोन उजागर चूहों में मनाया गया था (चित्रा 2बी), जो पुष्टि की है कि फेफड़ों parenchymal विनाश ओजोन एक्सपोजर के बाद हुई ।

फेफड़े समारोह airflow दर मापदंडों, फेव₂₅/FVC, फेव_५०/FVC, और फेव_७५/FVC. के रूप में दिखाया द्वारा मापा गया था परिणामों से पता चला है कि ओजोन में कमी आई है कि सभी मापदंडों को उजागर चूहों (चित्रा 3ए सी) सीओपीडी रोगियों में विशिष्ट फेफड़े कार्यात्मक दोषों के अनुरूप थे^4,३७. आगे ँ मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक अभ्यास सहिष्णुता परीक्षण है कि 6 के लिए प्रतिस्थापित-मिन चलना परीक्षण (6MWT)^{३८,३९}, जो आमतौर पर सीओपीडी रोगियों में कार्यात्मक व्यायाम क्षमता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । ओजोन जोखिम काफी थकान समय और थकान दूरी (चित्रा 4ए और बी) में कमी आई ।

ँ मॉडल में सीओपीडी के रोगजनन को संबोधित करने के लिए मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल को चूहों के BALFs से गिना गया; माउस सीरा में समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस (आईएल-1β और TNF-α) और विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस (आईएल-10) का पता लगाया गया । ओजोन उजागर चूहों मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल सहित भड़काऊ कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है, (चित्रा 5ए-सी), साथ ही आईएल-10 में एक महत्वपूर्ण कमी और il-1β और TNF-α में एक वृद्धि (चित्रा 6ए-सी ). आंकड़ों के सभी का प्रदर्शन किया है कि ँ मॉडल recapitulated मानव सीओपीडी लक्षण की तरह ।

चित्र 1। ओजोन जोखिम फेफड़ों की मात्रा में वृद्धि हुई और इल्लल्लाह µ सीटी द्वारा पता चला% । (एक) प्रतिनिधि 3 डी हवा के फेफड़ों या ओजोन उजागर 7 सप्ताह में चूहों संबंधित जोखिम के बाद दिखा छवियां । (ख) दो समूहों के व्यक्तिगत कुल फेफड़ों के संस्करणों के आंकड़े के लिए 3 डी छवियों से निकाले गए थे । ओजोन-उजागर चूहों कुल फेफड़ों की मात्रा में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई । (ग) व्यक्तिगत और मतलब दो समूहों के इल्लल्लाह% । ओजोन उजागर चूहों इल्लल्लाह% में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई । लाल रंग इल्लल्लाह (voxels से 2550-2700 Hounsfield इकाइयों की घनत्व के साथ) इंगित करता है । इस आंकड़े में लाल रंग में दिखाई श्वासनली और ब्रांकाई को फेफड़े के इल्लल्लाह की गणना के लिए निकाला गया । आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.E.M. * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 2। ओजोन एक्सपोजर Lm बढ़ा । (क) माइक्रोग्राफ-उजागर या ओजोन उजागर चूहों में वह दाग वर्गों में फेफड़ों वायुकोशीय रिक्त स्थान का प्रतिनिधि. (ख) Lm के व्यक्तिगत मूल्यों के आंकड़ों के लिए दो समूहों के फेफड़े वर्गों से मात्रा थे । एल एम में वृद्धि ओजोन उजागर चूहों में मनाया गया । आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब ± S.E.M. * * P & #60; ०.०१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 3 . ओजोन एक्सपोजर फुफ्फुसीय समारोह में कमी आई. (a-c) दोनों हवा से अवगत कराया और ओजोन उजागर चूहों के लिए, पहले 25, ५० में व्यक्तिगत फेव, और तेजी से समाप्ति के ७५ ms (फेव₂₅, फेव_५०, और फेव_७५, क्रमशः), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से FVC, सभी दर्ज किए गए । फेव₂₅, फेव_५०, और फेव_७५ का प्रतिशत अलग से गणना की गई । फेव₂₅/FVC, फेव_५०/FVC, और फेव_७५/FVC सभी ओजोन उजागर चूहों में काफी कमी आई. आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.E.M. * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 4 . ओजोन जोखिम कम थकान समय और थकान दूरी । (क) हवा या ओजोन उजागर चूहों के लिए व्यक्तिगत चल समय दर्ज की गई । ओजोन-उजागर चूहों थकान समय में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई । (ख) दो गुटों की व्यक्तिगत चल रही दूरियों को दर्ज किया गया. ओजोन-उजागर चूहों थकान दूरी में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया । आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब ± S.E.M. * P & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 5 . भड़काऊ कोशिकाओं BALF से गिना । (a) वायु या ओजोन-उजागर चूहों में कुल कोशिकाओं (कुल) की व्यक्तिगत और मतलब संख्या । (ख) मैक्रोफेज (मैक) के दो समूहों में व्यक्तिगत और मतलब संख्या । (ग) दोनों गुटों में न्यूट्रोफिल (नेऊ) का व्यक्तिगत और निकृष्ट नंबर. आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.E.M. * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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चित्र 6 . सीरम में भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ cytokine का पता लगाने । (क) हवा में आईएल-१० या ओजोन-उजागर चूहों की मात्रा का व्यक्तिगत और अर्थ मान. (ख) दो समूहों में आईएल-1β की मात्रा का व्यक्तिगत और निकृष्ट मूल्य । (ग) दो समूहों में TNF-α की मात्रा का वैयक्तिक और निकृष्ट मूल्य. आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब ± S.E.M. * P & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस अध्ययन में, हम एक नया सीओपीडी मॉडल पैदा करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करते हैं । अन्य मॉडलों की तुलना में (यानी, एलपीएस या पीपीई मॉडल), इस ँ मॉडल सीओपीडी रोगियों की रोग प्रक्रिया recapitulates. क्योंकि सिगरेट का धुआं मुख्य खतरनाक सामग्री है कि मानव रोगियों में सीओपीडी का कारण बनता है^४०, सीएस मॉडल सबसे लोकप्रिय सीओपीडी मॉडल^{४१,४२}रहता है । हालांकि सीएस मॉडल में नई दवाओं के लिए 3-से 12 माह के आर & #38;D पीरियड की आवश्यकता है । सीएस मॉडल की तुलना में, वर्तमान ँ मॉडल 6-8 सप्ताह पीढ़ी की अवधि को कम कर देता है । हम अपने पिछले अध्ययन में ओजोन के लिए जोखिम के 6 सप्ताह के बाद पुरुष चूहों में वातस्फीति मनाया है^30,31,३२। इस अध्ययन में, हम 7 सप्ताह के लिए महिला चूहों को ँ प्रोटोकॉल लागू किया और सफलतापूर्वक एक महिला ँ मॉडल उत्पंन । क्योंकि यह बताया गया है कि सीओपीडी मृत्यु दर पुरुषों में कमी आई है, लेकिन कुछ देशों में महिलाओं में वृद्धि हुई है^३३, यह रोगजनक तंत्र का अध्ययन करने के लिए और महिला सीओपीडी एक महिला सीओपीडी मॉडल का उपयोग कर रोगियों के लिए इलाज दृष्टिकोण विकसित करने के लिए आवश्यक है । हम जानते है कि abovementioned सीओपीडी मॉडल (यानी, एलपीएस, पीपीई, और सीएस) दोनों पुरुष और महिला जानवरों में काम कर सकते है^४३। इस कार्य का उद्देश्य एक अतिरिक्त सीओपीडी मॉडल का प्रस्ताव करना था कि दोनों recapitulates रोगियों की रोग प्रक्रिया को सीओपीडी और एक बहुत ही कम पीढ़ी की अवधि की आवश्यकता है ।

इस मॉडल को पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण कदम (२.५ पीपीएम के स्तर पर) ओजोन के लिए चूहों को उजागर किया गया प्रति सप्ताह दो बार (एक बार हर 3 दिन) के लिए 6-8 सप्ताह (इस अध्ययन में, हम 7 सप्ताह का इस्तेमाल किया, हालांकि हम खुराक वृद्धि की कोशिश नहीं की) । जोखिम आवृत्ति और ओजोन एकाग्रता के महत्वपूर्ण मापदंडों को नियंत्रित करके, हम सफलतापूर्वक पुरुष C57BL में वातस्फीति reproduced/6 चूहों^31,३२, पुरुष बालब/c चूहों³⁰, और महिला बालब/सी चूहों (वर्तमान अि) । वातस्फीति phenotype ओजोन जोखिम से हुई, airflow सीमा और फेफड़े parenchymal विनाश सीओपीडी रोगियों^{४४,४५}में देखा परिवर्तन के समान के साथ।

इस अध्ययन के लिए अभी भी सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, क्योंकि मानव सीओपीडी के रोगजनन फेफड़ों के एनाटॉमी से संबंधित है, एक आदर्श सीओपीडी मॉडल है कि मनुष्यों के समान एक फेफड़े के संरचनात्मक संरचना है पशुओं में उत्पन्न किया जाना चाहिए । बड़े जानवरों की तुलना में, छोटे जानवरों को भी कम व्यापक airway^४६मनुष्यों की तुलना में शाखाओं में अधिकारी । हमें यह स्वीकार करना होगा कि बड़े पशुओं में सीओपीडी मॉडल उत्पन्न करना अधिक सार्थक होगा । हालांकि, पशुओं में बड़े पैमाने पर मॉडल स्थापित करना काफी मुश्किल होता है । इस मॉडल की एक और सीमा इसके नैदानिक प्रासंगिकता है । हालांकि यह निश्चित है कि ओजोन श्वसन तंत्र और नुकसान फेफड़े के ऊतकों^19,22के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, और हालांकि वहाँ सबूत है कि कुछ सीओपीडी रोगियों के लक्षण ओजोन²⁸के लिए जोखिम के बाद खराब है, ओजोन रोगियों में सीओपीडी का मुख्य कारण नहीं है. लेकिन, हम अभी भी प्रस्ताव कर रहे है और इस ँ मॉडल का उपयोग कर क्योंकि दोनों ओजोन और सीएस सूजन उत्प्रेरण और oxidative तनाव के लिए नेतृत्व द्वारा श्वसन प्रणाली को नुकसान के कारण^26,27। इस प्रकार, एक नई दवा है कि ँ मॉडल में सीओपीडी इलाज कर सकते है assumably भी सीएस मॉडल में काम करते है और इसलिए संभावित सीओपीडी रोगियों के लिए विकसित किया जा सकता है ।

ं मॉडल के आवेदन सीओपीडी के आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए प्रतिबंधित नहीं कर रहे हैं । हमारे दो हाल के कागजात भी एन असेटयलस्यस्थेने (एनएसी)³¹ और नहस्ा^३२ (एच₂एस के एक exogenous दाता) को दो दवाओं के exogenous प्रशासन के माध्यम से सीओपीडी का इलाज करने में की प्रभावकारिता की जांच की । पहले अध्ययन में, हम airway हाइपर-जवाबदेही और एनएसी के प्रशासन के बाद airway चिकनी मांसपेशियों की कमी के एक उत्क्रमण पाया । ये प्रभाव सीओपीडी रोगियों में एनएसी के संभावित नैदानिक लाभों के लिए आधार का संकेत हो सकता है³¹. ँ मॉडल के दूसरे अध्ययन में, हमने पाया कि exogenous नहस्ा के प्रशासन फेफड़ों की सूजन उलट और आंशिक रूप से वातस्फीति की सुविधाओं के उलट । इस प्रकार, इस ँ मॉडल के साथ, हम एक प्रारंभिक अध्ययन में दिखा दिया कि नहस्ा सीओपीडी रोगियों के लिए एक संभावित दवा उंमीदवार के रूप में विकसित किया जा सकता है^३२। इसलिए, ँ मॉडल सीओपीडी के लिए दोनों तंत्र अनुसंधान और दवा स्क्रीनिंग के लिए संभावित अनुप्रयोगों है ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.