Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Bu çalışmada art arda fareler için ozon yüksek konsantrasyonda açarak yeni bir kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hayvan modeli başarılı nesil açıklar.

Abstract

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) tarafından kalıcı hava akımı sınırlama ve akciğer parenkima imha karakterizedir. Nüfus yaşlanma içinde bir çok yüksek insidansı vardır. Geçerli geleneksel tedaviler KOAH odak çoğunlukla açık belirti-modifiye ilaçlar için; Böylece, yeni tedavilerin geliştirilmesi acilen ihtiyacı vardı. KOAH nitelikli hayvan modelleri temel mekanizmaları karakterize etmek için yardımcı olabilir ve yeni ilaç tarama için kullanılabilir. Lipopolysaccharide (LPS) gibi geçerli KOAH modelleri veya domuz pankreas elastase (PPE)-indüklenen amfizem modeli, akciğerler ve airways KOAH benzeri lezyonlar oluşturur ancak aksi takdirde insan KOAH patogenezinde benzer değil. Bir sigara dumanı (CS)-indüklenen model kalır en popüler çünkü sadece solunum sistemi lezyonlarının KOAH gibi taklit eder, ama bu da insanlarda KOAH neden ana tehlikeli madde birini dayanır. Ancak, CS kaynaklı modeli zaman alıcı ve emek yoğun yönlerini önemli ölçüde kendi uygulamasında yeni uyuşturucu tarama sınırı. Bu çalışmada, biz başarıyla yeni KOAH manken fareler için ozon yüksek düzeyde maruz tarafından oluşturulan. Bu modeli aşağıda gösterilmiştir: 1) zorunlu Ekspiratuar cilt 25, 50 ve 75/zorla vital kapasite azalmıştır (FEV25/FVC, FEV50/FVC ve FEV75/FVC), akciğer fonksiyonu; bozulma gösteren 2) büyütülmüş akciğer alveoller akciğer parenkima imha ile; 3) yorgunluk zaman ve mesafe azalır; ve 4) artış iltihabı. Birlikte ele alındığında, bu veriler ozon pozlama (OE) modeli ozon dozun KOAH etyolojik faktörlerden biri olduğu için insanlara benzer bir güvenilir hayvan modeli olduğunu ispat. Ayrıca, sadece 6-8 hafta, 3-12 ay OE modeli KOAH araştırma için iyi bir seçim olabilir gösteren sigara dumanı modeli ikna etmek için gerektirir, ancak bir OE modeli oluşturmak için önceki çalışmalarımız, temel aldı.

Introduction

KOAH, Amfizem ve kronik bronşit gibi ölüm üçüncü önde gelen nedenidir 20201,2dünyada olabilir tahmin ediyor. KOAH potansiyel insidansı 40 yıldır eski bir popülasyondaki erkeklerde % 12,7 ve dişilerde3önümüzdeki 40 yıl içinde % 8.3 olduğu tahmin edilmektedir. Hiçbir ilaç KOAH hastaları4ilerleyici bozulma tersine çevirmek şu anda mevcuttur. KOAH güvenilir hayvan modelleri sadece hastalık patolojik süreci taklit talep ediyorum ama aynı zamanda kısa nesil süresi gerektirir. LPS veya bir PPE kaynaklı modeli de dahil olmak üzere geçerli KOAH modelleri amfizem benzeri semptomlar5,6tetikleyebilir. Tek bir yönetim veya işaretli neutrophilia bronchoalveolar lavaj sıvı (BALF), artar pro-inflamatuar aracılar (Örneğin, TNF-α ve IL-1β) BALF veya serum, fare ya da sıçan sonuçlarında LPS veya KKE bir haftalık meydan okuma akciğer üretir parenkimal imha genişlemiş hava boşluk ve sınırları hava akımı5,6,7,8,9,10. Ancak, LPS veya KKE insan KOAH nedenleri değildir ve böylece patolojik süreç11taklit değil. CS kaynaklı manken üretilen bir kalıcı hava akımı sınırlama, akciğer parenkima yıkım ve fonksiyonel egzersiz kapasitesi düşük. Ancak, geleneksel bir CS Protokolü KOAH model12,13,14,15oluşturmak için en az 3 ay gerekir. Böylece, iki gereksinimlerini karşılayan yeni, daha etkili bir hayvan modeli oluşturmak önemlidir.

Son zamanlarda, ek olarak sigara, hava kirliliği ve mesleki maruz kalma KOAH16,17,18daha yaygın nedenleri olmuştur. Ozon, önemli kirletici biri olarak (değil önemli bileşeni hava kirliliği rağmen), doğrudan solunum yolu ile tepki ve çocuklar ve genç yetişkinler19,20,21 akciğer dokusuna zarar ,22,23,24,25. Ozon yanı sıra LPS, KKE ve CS, de dahil olmak üzere diğer uyarıcılar bir ciddi pulmoner oksidatif stres ve DNA hasarı biyokimyasal yolları katılmaktadırlar ve inisiyasyon ve promosyon KOAH26,27bağlantılıdır. Bazı KOAH hastaları belirtileri gösteren ozon Akciğer işlev18,28,29bozabilir ozon için maruz sonra bozulabilir başka bir faktördür. Bu nedenle, biz tekrar tekrar 7 hafta boyunca fareler için ozon yüksek konsantrasyonda açarak yeni bir KOAH model oluşturulan; Bu hava akımı kusurları ve akciğer parenkima hasarı önceki araştırmalar30,31,32benzer sonuçlandı. Biz bu çalışmada kadın farelere OE Protokolü genişletilmiş ve başarılı bir şekilde bizim önceki çalışmalar30,31,32erkek farelerde gözlenen amfizem çoğaltılamaz. KOAH ölüm oranı erkeklerde azaldı ama birçok ülkede33kadınlarda artmıştır çünkü KOAH manken dişilerde mekanizmaları çalışmaya ve kadın KOAH hastaları için tedavi yöntemleri geliştirmek için gereklidir. Tüm cins OE modeline uygulanabilirliği KOAH manken olarak kullanmak için daha fazla destek ödünç.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: OE model oluşturulan ve daha önce bildirilen araştırma 30 , 31 , 32 yılında kullanılan. Tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Shanghai Jiaotong Üniversitesi tarafından kabul edildi.

1. fareler

  1. ev patojen ücretsiz, 7 - için 9-hafta-yaşlı kadın BALB/c fareler bir hayvan bireysel havalandırılmış kafeslerde tesis altında kontrollü sıcaklık (20 ° C) ve nem (40-%60). 12 h ışık ve 12 h tesisin karanlık döngüsünde sağlar. Gıda sağlamak ve ad libitum su.

2. Ozon veya hava pozlama

  1. Generate ozon ile sızdırmazlık akrilik (örneğin Perspex) kutusunda bir elektrik jeneratörü. Blow hava iç ve kutunun dışında bağlı bir hava havalandırma borusu aracılığıyla küçük Hava üfleyici kullanarak kutudan. Kutusuna bir ozon sonda kullanarak ozon konsantrasyonu izlemek. Kutusunda ozon konsantrasyonu başına 2.5 parçaları ulaşır kadar bekleyin milyon (ppm).
    Not: Ozon sonda otomatik olarak Ozon Jeneratör açık veya kapalı geçiş yapabilir ve ozon seviyesi 2.5 ppm at kutusundaki koruyabilirsiniz.
    2. Ozon seviyesi 2.5 ppm ulaştığında
  2. fareler ve metin kutusuna yerleştirin. Fareler kutusunda 3 h için her zaman için ozon karşılaşmazlar devam.
    Not: Kutu sırasında 3 h otomatik olarak Ozon Jeneratör açık veya kapalı geçiş yaparak bir ozon düzeyi 2.5 ppm koruyabilirsiniz ve CO 2 üfleme tarafından üretilen farelerin kutunun dışında.
  3. (3 günde bir kez) 7 hafta boyunca haftada iki ozon Etkilenmeler (3 saat süren her maruz kalma) vermek; aynı zamanda ve aynı süre için hava kontrol fareler ortaya çıkarmak.

3. Mikro bilgisayarlı tomografi

  1. pelltobarbitalum natricum mayi enjeksiyonu ile fareler 7 haftanın sonunda, anestezi (% 1, 0.6 - 0.8 ml/100 g) göre fare değil görmek için bireysel durumlarda doz ayarlama bir ayak çimdik. için monitör yanıt ve fare sürekli nefes frekansta tutun; ve gönüllü yok hareketleri var işlemler sırasında olduğundan emin olun.
  2. Bir mikro Bilgisayarlı Tomografi (µCT) odasında imzalat fareler yer.
  3. Kalibre standart protokol ve üreticinin kullanma µCT ' s yönergeleri. X-ışını tüpü 50 ayarla kV ve 450 µA mevcut.
    Not: Her ikisi de x-ışını ve Dedektör fareler döndürmek.
  4. Bir dilim için 300 MS bir çekim hızı ve bir dilim kalınlığı 0,093 mm etkili piksel boyutunu 515 projeksiyonlar 0.092 mm, kazanılması by µCT çözümlemesi yapma.
  5. Akciğer alınan görüntüleri bir yazılım kullanarak yeniden. En az ve en çok gri tonlamalı sırasıyla-750 ve-550 Hounsfield daxilində ayarlayarak gri tonlamalı görüntü parlaklığını ayarlayın.
    Not: Yazılım otomatik olarak akciğer parankimi ve düşük-zayıflama alan (LAA) 34 , 35 hacimleri hesaplar.
  6. Toplam akciğer hacmi LAA hacimce bölerek LAA (LAA %) yüzdesini hesaplamak.

4. koşu bandı Test

  1. fareler adaptasyon bir test üzerinde bir koşma koşu bandı makine. Not 10 m/dk 10 dk hızında vermek: yordamı yürütülen elektrik her zaman kapalı olduğunda.
  2. yönetici bir yorgunluk testi fareler için.
    1. Fare hızı 10 m/dak 5 dakika süreyle ısınmak
    2. Artmak belgili tanımlık hız 15 m/dk 10 dakika süreyle
    3. Egzersiz yoğunluğu artırmak: 5 m/dak, 20 m/dak başlangıç tarafından hızı artan fareler kadar her 30 dk. 36 çalıştırmak devam edemiyor.
  3. Çalışan mesafe ve çalışma süresi yorgunluk mesafe ve yorgunluk zaman, anılan sıraya göre toplam kayıt.

5. pulmoner fonksiyon ölçümleri

  1. pelltobarbitalum natricum mayi enjeksiyonu ile fareler anestezi (% 1, 0.6 - 0.8 ml/100 g) göre fare yaptığını görmek için bireysel durumlarda doz ayarlama bir ayak çimdik değil yanıt vermek ve fareler spontan solunum. monitör korumuştur ve fare sürekli nefes frekansta tutun kadar bekleyin; ve gönüllü yok hareketleri var işlemler sırasında olduğundan emin olun.
  2. Dikkatle fareler tracheostomize ve bilgisayar kontrollü bir vantilatöre bağlı bir vücut Pletismograf yerleştirebilirsiniz.
    Not: Havalandırma proksimale endotrakeal tüp bulunan bir vana ile kontrol edilir. Belgili tanımlık tertibat yarı statik basınç birimi manevra ve manevra hızlı akış hacminin de dahil olmak üzere farklı yarı otomatik manevralar sağlar.
  3. Her nefes döngüsü tam bitiminde elde edilir ve ortalama 150 nefes/dk düzenli nefes desen kadar basınç kontrollü havalandırma yoluyla imzalat fare sıklığını nefes empoze.
  4. Yarı statik basınç-hacim manevra aygıtla Pletismograf içinde oluşturulan negatif basınç kullanarak gerçekleştirmek.
  5. Hızlı Akış birim manevra FVC ve FEV kaydetmek için yarı statik basınç-hacim döngüler içinde gerçekleştirin. + 30 cm H 2 akciğer şişirmek O ve hemen sonrasında kalan birim FEV ilk 25, 50 ve soluk verme (FEV 25 75 ms-30 cm H 2 de O. kayıt olana sona erme zorlamak için son derece olumsuz bir basınç bağlanmak FEV 50 ve FEV 75, sırasıyla). Suboptimal manevralar reddetmek. Her tek fare ile her test için düzenleyeceği en az tüm sayısal parametreler için güvenilir bir ortalaması elde etmek için üç kabul edilebilir manevralar.

6. BALF koleksiyonu

  1. ardından terminal anestezi ile pelltobarbitalum natricum ((%1, 1,8-2.4 ml/100 g) fareyi bir ayak çimdik cevap değil ve nefes kaybetmek görmek için bireysel durumlarda göre doz ayarlamak), lavaj PBS 2 mL 1 mm çaplı endotrakeal tüp ve sonra al BALF 10 üzerinden ile fareler.
  2. Erişim tarihi lavaj aliquots havuz ve onlara 4 ° C ve 250 x g 10 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
  3. İçin acele kullanma süpernatant toplamanız ve kalan-80 ° C ya da sıvı azot,.
  4. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri toplam sayısını saymak.
  5. PBS ve sonra spin (1400 x g, 6 dk.) 250 µL slayta bir slayt spinner santrifüj kullanarak resuspended hücrelerinin hücre Pelet resuspend.
  6. İçin geçerli Wright boyama hücreleri slaytlara üreticiye göre ' s protokolü.
  7. Fare başına 200 hücreleri saymak; 400 X büyütme altında; Standart Morfoloji göre hücreleri makrofajlar veya nötrofil, tanımlamak ve sayıları saymak.

7. Kalp kan örnekleme

  1. kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplamak, 1.5 mL tüpler, içine yük ve buz 30 dakika süreyle devam et
  2. 2000 g x ve 4 5 min için kan örnekleri santrifüj kapasitesi ° C.
  3. Süpernatant (serum) için yeni bir tüp aktarın ve-80 ° C ya da sıvı azot depolayın.
  4. IL-1β için serum hazırlamak IL-10 ve ilgili ELISA Kitleri kullanarak TNF-α algılama testleri.

8. Akciğer xarakteristikaları analizi

  1. teşrih akciğerler ve fareler üzerinden tracheas.
    1. Cerrahi bir tahta üzerine euthanized her fare hemen kurbandan sonra konumlandırın.
    2. Uzak platysma incelemek ve görselleştirmek ve trakeal halkalar erişmek için ön trakeal kaslar.
    3. Açık yukarıya göğüs boşluğuna. Akciğerler ve nefes borusu incelemek, ama kalp akciğerlerden ayırmayın.
  2. %4 paraformaldehyde PE90 polietilen boru aracılığıyla içeren bir şırınga endotrakeal kateter bağlanmak.
    Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. Eldiven ve koruyucu gözlük ve duman başlık içinde çözüm kullanın.
  3. Tamamen %4 paraformaldehyde (10 damla, ~ 200 µL) kullanarak akciğer endotrakeal kateter şişirmek. Kalp enflasyon tamamlandıktan sonra kaldırın.
  4. Bakım için en az 4 h %4 paraformaldehyde 10 mL içeren 15 mL tüp içinde akciğer
  5. Embed parafin akciğerde. 5-µm bölümleri parafin blok bir döner microtome ile kesit elde. Kesit sırasında maruz maksimum yüzey alanı bronş ağacının alanı içinde akciğer dokusunun.
  6. Xarakteristikaları için Hematoksilen ve Eozin çözümlemesi (H & E) bölümleri boyama.
  7. Bölümleri alan parlak dik mikroskopla (objektif lens, 20 X; pozlama süresi, 1.667 ms) görüntü.
  8. İki müfettişler tedavi protokolü kör bağımsız olarak saymak histolojik kesitler var. Ortalama doğrusal kesme noktası (L m) arası alveoler septal duvar mesafe ölçmek için bir parametre olarak kullanmak. Aşağıdaki adımları uygulayarak L m belirlemek:
    1. bölümleri görüntüleri Photoshop açın ve beş 550 µm uzun hatları ile görüntü üzerinde reticule kılavuz çizin.
    2. Alveoller arasında kılavuz çizgisi sayısını.
    3. L m kılavuz çizgisi uzunluğunu alveoller sayısına bölünmesi ile hesaplayın. Miktar için fare başına beş bölüm görüntü. Her bölümün (alan başına bir görüntü) on görüntüleri ve rastgele değerlendirmek. Bir alan önde ya da başka bir yöne hareket ettirerek airways ve gemiler alan seçimi sırasında kaçının.
      Not: Veri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır Un eşleştirilmiş bir t-test hava maruz fareler ve fareler ozon maruz arasında karşılaştırma için gerçekleştirilmiştir. Her grubun üç hayvan önemli farkı hesaplamak için kullanılmıştır. P-değeri < 0,05 olarak önemli kabul.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D µCT görüntüleri her grubun örnekleri şekil 1biriçinde görüntülenir. Önemli ölçüde daha büyük bir toplam akciğer hacim ozon maruz fareler vardı (şekil 1bir ve b) ve LAA % (şekil 1c) hava maruz kontrol fareler daha. Akciğer hacmi ve LAA % ozon pozlama31,32altı hafta sonra yükseltilmiş kaldı. Artan akciğer hacmi ve LAA % amfizem fenotip temsil eder. Şekil 2bir içinde akciğer alveoler genişlemenin örnekler amfizem oluşumu göstermektedir. Farelerde akciğer parenkima imha ozon maruz kaldıktan sonra meydana geldiğini doğruladı ozon maruz (Şekil 2b), ortalama doğrusal kesme noktası (Lm) bir artış gözlenmiştir.

Akciğer işlev FEV25gösterilen hava akımı hızı parametreler tarafından ölçülen /FVC, FEV50/FVC ve FEV75/FVC. Sonuçları tüm ozon Günese maruz kalan farelerde (şekil 3a-c) azalma parametreleri tipik Akciğer işlev hataları KOAH hastaları4,37ile tutarlı olduğunu gösterdi. Daha fazla OE modeli değerlendirmek için biz yerine bir egzersiz tolerans testi KOAH hastalarında fonksiyonel egzersiz kapasitesindeki değişiklikleri değerlendirme için yaygın olarak kullanılan 6 dakika yürüme testi (6MWT)38,39, yürüttü. Ozon pozlama önemli ölçüde zaman ve yorgunluk yorgunluk mesafe azalmıştır (şekil 4bir ve b).

KOAH patogenezinde OE modeli adrese, makrofajlar ve nötrofiller fareler BALFs sayıldı; Pro-inflamatuar sitokinlerin (IL-1β ve TNF-α) ve anti-inflamatuar sitokinlerin (IL-10) fare sera tespit edildi. Ozon maruz fareler yanı sıra IL-10 önemli bir azalma ve IL-1β ve TNF-α artış inflamatuar hücreler, makrofajlar ve nötrofiller (şekil 5a-c), dahil olmak üzere önemli bir artış gösterdi (şekil 6a-c ). Tüm verileri OE recapitulated insan KOAH benzeri belirtiler model gösterdi.

Figure 1
Şekil 1. Ozon pozlama akciğer hacmi ve µCT tarafından algılanan LAA % arttı. (a) 7 hafta ilgili maruz kaldıktan sonra akciğerlere hava veya ozon maruz farelerin gösterilen temsilcisi 3D görüntüler. (b) iki grup bireysel toplam akciğer hacimleri istatistikler için 3D görüntü elde. Ozon maruz fareler toplam akciğer hacmi önemli bir artış gösterdi. (c) iki grup bireysel ve kaba LAA %. Ozon maruz fareler LAA % içinde önemli bir artış gösterdi. Kırmızı renk LAA (voxels 2,550-2.700 Hounsfield birimleri yoğunlukları ile) gösterir. Trakea ve bu rakam Kırmızıyla gösterilen bronşlar akciğer LAA hesaplamak için kaldırılmıştır. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır ** P < 0,01, *** P < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Ozon pozlama Şampiyonlar Ligi arttı. (a) akciğer hava maruz veya ozon maruz kalan farelerin bölümlerde o lekeli alveoler alanlarda temsilcisi filmler. (b) tek tek değerleri LM istatistikler için iki grup akciğer bölümlerden sayısal. Ozon Günese maruz kalan farelerde Lm bir artış gözlenmiştir. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Ozon pozlama pulmoner fonksiyon azaldı. (a-c) Hava maruz ve ozon maruz fareler, ilk 25 içinde bireysel FEV için 50 ile 75 ms hızlı süre sonu (FEV25, FEV50ve FEV75, sırasıyla), FVC yanı sıra tüm kaydedildi. Yüzdeleri FEV25, FEV50ve FEV75 FVC için ayrı ayrı hesaplanır. FEV25/FVC, FEV50/FVC ve FEV75azaldı /FVC tüm önemli ölçüde içinde ozon maruz fareler. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır * P < 0,05, ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Ozon pozlama yorgunluk zaman ve yorgunluk mesafe azaldı. bireysel çalışan (bir) kez hava veya ozon-fareler kaydedildi maruz kalan için. Ozon maruz fareler yorgunluk zaman önemli bir azalma gösterdi. (b) iki grup bireysel çalışan mesafelerde kaydedildi. Ozon maruz fareler yorgunluk mesafe önemli bir düşüş sergiledi. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır * P < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . İnflamatuar hücre sayılan BALF. (a) bireysel ve ortalama sayıları toplam hücre (toplama) hava veya ozon maruz farelerde. (b) makrofajlar (MAC) iki grup bireysel ve kaba numaralarını. (c) bireysel ve ortalama sayıda nötrofil (NEU) iki grup içinde. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır * P < 0,05, ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

ithin-sayfa = "1" >Figure 6
Şekil 6 . Enflamatuar ve anti-inflamatuar sitokin algılama Serumda. (a) IL-10 miktarı hava veya ozon maruz farelerde bireysel ve ortalama değerleri. (b) bireysel ve ortalama değerleri IL-1β tutarın iki gruplar halinde. (c) TNF-α miktarına iki grup olarak bireysel ve ortalama değerleri. Verileri ortalama ± S.E.M. sunulmaktadır * P < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, biz yeni bir KOAH model oluşturmak için güvenilir bir yöntem mevcut. Diğer modeller için (Yani, LPS ya da KKE modelleri) karşılaştırıldığında, bu OE model KOAH hastaları patolojik süreci beyannamedir. Sigara dumanı KOAH insan hasta40neden olan ana tehlikeli madde olduğundan, CS model en popüler KOAH model41,42kalır. Ancak, 3 - 12 ay R CS model gerektirir & D dönem için yeni ilaçlar. CS modeline göre geçerli OE modeli üretimi dönemi 6-8 hafta için azaltır. Biz erkek farelerde amfizem ozon etkilenme 6 hafta sonra bizim önceki çalışmalar30,31,32gözlemledim. Bu çalışmada OE Protokolü dişi fareler için 7 hafta boyunca uygulanan ve başarılı bir şekilde bir kadın OE model oluşturulan. Çünkü KOAH ölüm oranı erkeklerde azaldı ama bazı ülkeler33kadınlarda artış bildirilmiştir, patojenik mekanizmaların çalışmaya ve bir kadın KOAH modeli kullanarak kadın KOAH hastaları için tedavi yaklaşımları geliştirmek için gereklidir. Yukarıda belirtilen KOAH modelleri (Yani, LPS, KKE ve CS) her iki erkek ve dişi hayvanlar43çalıştığını biliyoruz. Bu çalışmanın amacı, hem KOAH hastaları patolojik süreci recapitulates ve çok kısa bir nesil süre gerektiren ek bir KOAH modeli teklif etmekti.

Bu model oluşturmak için önemli bir adım fareler iki kez her hafta (3 günde bir kez) 6-8 hafta (2.5 ppm düzeyinde) ozon için açığa (doz yükseltme deneyin vermedi rağmen bu çalışmada, biz 7 hafta kullanılır). Maruz kalma sıklığı ve ozon konsantrasyonu kritik parametreleri kontrol ederek, başarılı bir şekilde erkek C57BL/6 fareler31,32, erkek BALB/c fare30ve kadın BALB/c fare (geçerli amfizem çoğaltılamaz çalışma). Hava akımı sınırlama ve akciğer parenkima yıkım KOAH hastaları44,45'. görülen değişikliklere benzer ile ozon maruz amfizem fenotip sonuçlandı

Hala bu çalışma için sınırlamalar vardır. Örneğin, akciğerler anatomi insan KOAH patogenezi ile ilgili çünkü hayvanlarda insanlar için benzer bir akciğer anatomik yapıya sahip ideal bir KOAH modeli oluşturulması. Büyük hayvanlar için karşılaştırıldığında, küçük hayvanlar insanlar46dallanma daha az kapsamlı hava yolu sahip. Biz büyük hayvanlarda KOAH modeli oluşturmak için daha anlamlı olacağını itiraf etmeliyim. Ancak, büyük ölçekli modeller hayvanlarda kurmak çok zordur. Bu model başka bir sınırlaması klinik önemi var. Ozon tepki ile solunum yolu ve akciğer doku19,22zarar kesin olmasına rağmen ve ozon28maruz kaldıktan sonra bazı KOAH hastaları belirtileri kötüleşmek kanıt olsa, Ozon ana KOAH hastalarında nedeni değil. Ancak, biz hala teklif ve ozon ve CS solunum sistemi zarar iltihap inducing ve oksidatif stres26,27için neden çünkü bu OE modelini kullanarak. Bu nedenle, KOAH OE modeli olabilir assumably tedavi olabilir yeni bir ilaç da CS modelinde iş ve bu nedenle potansiyel olarak KOAH hastaları için geliştirilecek.

Uygulamalar OE modelinin KOAH moleküler ve hücresel mekanizmaları deşifre için sınırlı değildir. İki son belgeler de N-acetylcysteine (NAC)31 ve OE modeli için iki ilaç eksojen yönetim üzerinden KOAH tedavisi, NaHS32 (H2S eksojen bir donör) etkinliği araştırıldı. İlk çalışmada, hava yolu hiper-yanıt ters ve hava yolu düz kas kitle azaltma NAC yönetim sonra bulduk. Bu efektleri NAC potansiyel klinik yararları KOAH hastaları31yılında temeli olduğunu gösterebilir. OE modelinin ikinci çalışmada akciğer iltihabı ters ve amfizem özelliklerini kısmen tersine eksojen NaHS yönetim bulduk. Böylece, bu OE modeliyle biz NaHS KOAH hastaları32için potansiyel bir uyuşturucu aday olarak geliştirilebilir bir ön çalışmada gösterdi. Bu nedenle, OE model hem mekanizması araştırma için potansiyel uygulamalar ve KOAH için uyuşturucu tarama vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. ve chilling geçerli çalışanları ve hücresel Biyomedikal grup hisse senedi opsiyonu sahipleri vardır (NASDAQ: CBMG). Diğer yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar, bu iletişim kuralını µCT değerlendirilmesinde konusunda teknik yardım almak için Bay Boyin te (Şangay halk sağlığı Klinik Merkezi) için şükran ifade etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

Tags

Tıp sayı: 126 kronik obstrüktif akciğer hastalığı kronik bronşit Amfizem hava akımı sınırlama akciğer parenkima imha ozon pozlama
Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter