Summary
本研究では、オゾンの高濃度にマウスを繰り返しさらすことによって新しい慢性閉塞性肺疾患 (COPD) の動物モデルが正しく生成について説明します。
Abstract
慢性閉塞性肺疾患 (COPD) は、永続的な気流制限や肺実質の破壊によって特徴付けられます。それは人口高齢化における発生率が非常に高いです。COPD フォーカスを中心に症状変更薬; 現在の従来の治療法したがって、新しい治療法の開発が急務します。COPD の修飾の動物モデルは基になるメカニズムを特徴付けるために助けることができるし、新しい薬物スクリーニングに使用することができます。リポ多糖 (LPS) など、現在の COPD モデルやブタ膵臓エラスターゼ (PPE)-誘導肺気腫モデル肺と気道における COPD のような病変を生成が、そうでなければ人間 COPD の病因を似ていません。タバコの煙 (CS)-誘導モデルのまま 1 つの最も人気のあるのでそれはだけでなく呼吸器系における COPD のような病変をシミュレートしますが、それは人間の COPD を引き起こす主な有害物質の一つに基づいています。ただし、CS 誘発モデルの時間のかかり、労働集約的な側面は、劇的に新しい創薬スクリーニングへの応用を制限します。この研究では、正常に高濃度のオゾンにマウスを公開することによって新しい COPD モデルを生成しました。このモデルは次を示した: 1) 強制呼気量 25、50、75/強制肺活量の減少 (fev 社25/FVC、fev 社50/FVC と fev 社75/FVC)、肺機能の悪化を示す2) 拡大肺肺胞、肺実質の破壊;3) 削減疲労時間と距離。・ 4) 炎症を増加します。一緒に取られて、これらのデータは、オゾン暴露 (OE) のモデルがオゾン露出オーバーは COPD の病因の要因の一つは、人間に同じような信頼性の高い動物モデルであることを示します。さらに、6-8 週間、OE モデル COPD 研究の良い選択であるかもしれないことを示すタバコの煙モデルを誘発する 3-12 ヶ月を必要とするのに対し、純正モデルを作成する私たちの前の仕事に基づくだけかかった。
Introduction
それは、COPD、肺気腫と慢性気管支炎を含むかもしれない 2020年1,2の世界の死の 3 番目の主要な原因をこと推定されています。人口の 40 歳以上の COPD の潜在的な発生率は、男性で 12.7%、次の 40 年の3で女性の 8.3% と推定されます。COPD 患者4の進行悪化を逆に現在利用できる薬はありません。COPD の信頼性の高い動物モデルだけでなく病気の病理学的プロセスの模倣の需要、また短い世代期間が必要。LPS または PPE 誘発モデルを含む、現在の COPD モデルは、肺気腫のような症状5,6を引き起こすことができます。単回投与または LPS または PPE の一週間にわたる課題著明な BALF の血清、プロ炎症性メディエーター (例えばTNF-α や il-1 β) を増加、気管支肺胞洗浄液 (BALF) でマウスやラットの結果を生成する肺実質の破壊拡大の空気のスペースと制限気流5,6,7,8,9,10。ただし、組合や PPE 人間 COPD の原因ではない、従って11病理学的プロセスを模倣しません。CS 誘起モデルは、永続的な気流制限、肺実質の破壊を生産し、機能的運動能力を削減します。しかし、伝統的な CS プロトコルには、COPD モデル12,13,14,15を生成するため、少なくとも 3 ヵ月が必要です。したがって、2 つの要件を満たしている新しいより効率的な動物モデルを生成する重要です。
最近では、タバコを吸う、に加えて大気汚染や職業暴露は COPD16,17,18のより一般的な原因になっています。主要な汚染物質の一つとして、オゾン (ただし大気汚染の主要なコンポーネントではなく)、することができます直接気道反応し、子供や若い大人19,20,21 の肺組織の損傷 ,22,23,24,25。組合、PPE は、CS などその他の刺激と同様に、オゾン、深刻な肺の酸化ストレスや DNA の損傷の生化学的経路に関与しているし、開始と COPD26,27のプロモーションにリンクしています。別の要因は、オゾン、オゾンが肺機能18,28,29を破壊できることを示すにさらされた後いくつかの COPD 患者の症状が悪化することです。したがって、我々 は繰り返し 7 週間のオゾンの高濃度にマウスを公開することによって新しい COPD モデルを生成これは気流の欠陥や肺実質損傷前調査30,31,32のものと同様で起因しました。本研究では雌マウスに OE プロトコルを拡張し、私たち以前研究30,31,32の雄マウスにみられる肺気腫を再現します。COPD 死亡率は男性で減少したが、多くの国の33の女性で増加、ためメカニズムの研究と女性の COPD 患者の治療法を開発する女性の COPD モデルが必要です。すべての性別に OE モデルの適用性は、COPD モデルとしての使用にさらにサポートを貸します。
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Protocol
注:、純正モデルが生成されて、以前に報告された研究 30 , 31 , 32 で使用します。すべての動物実験は機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海交通大学によって承認されました
。1 です。 マウス
- 家病原体フリー、7-9 週齢女性 BALB/c マウスで動物の個別換気ケージ施設制御温度 (20 ° C) と湿度 (40-60%)。12 h 光と施設で 12 h 暗いサイクルを提供します。食品を提供し、広告自由 水します 。
2。オゾンや大気暴露
- シール (例えば 風防) アクリル ボックスに電動発電機とオゾンを生成します。内側に、箱の外側に接続されているエアコン通気管を通じて小さな空気送風機を使用して箱から出して空気を吹きます。オゾン プローブを使用してボックスにオゾン濃度を監視します。ボックスでのオゾンの濃度に達するあたり 2.5 部品までを待つ百万 (ppm) です
。 注: オゾン プローブ オンまたはオフに自動的にオゾン発生器を切り替えることができます、2.5 ppm のボックスにオゾン レベルを維持できます 。
- は、2.5 ppm のオゾンのレベルに達したら、ボックスにマウスを配置します。オゾンにそれらを公開するたびに 3 h のボックスにマウスを保持します
。 注: ボックスは自動的にオンまたはオフにオゾン発生器を切り替えることにより 3 h 中に 2.5 ppm のオゾン濃度を維持できるし、箱から出してマウスによって生成される CO 2 を吹いています 。
- 7 週間 (3 日に 1 回) 週 2 つのオゾン露出 (3 時間を持続させるそれぞれの暴露) を与える; 同時にそして同じ期間の空気コントロール マウスを公開します 。
3。マイクロ コンピューター断層撮影
- 7 週の終わりには、pelltobarbitalum natricum の腹腔内注入マウスを麻酔 (1%、0.6 - 0.8 ml/100 g) マウスがないことを確認する個々 の状況に応じて投与量を調整つま先ピンチ。 モニターに対応し、安定した呼吸の頻度でマウスを維持手続き中に自主的な動きがないかどうかを確認します 。
- マイクロ コンピューター断層撮影 (µCT) の商工会議所に麻酔下のマウスを配置します 。
- 調整、メーカー標準のプロトコルを使用して µCT ' の指示。X 線管を設置 50 kV と 450 μ A の電流
。 注: 両方、マウスを中心に x 線と検出器回転します 。
- µCT 解析を行う 1 つのスライスの 300 ms の露光時間と 0.093 mm スライス厚 0.092 mm 有効画素サイズ 515 予測を取得します 。
- は、ソフトウェアを使用して取得した画像で肺を再構築します。それぞれ-750 -550 ハンス台で最小値とグレースケールの最大を設定することでグレースケール画像の明るさを調整します
。 注: ソフトウェアが自動的に肺実質と低吸収域 (LAA) 34 , 35 のボリュームを計算します 。
- LAA ボリューム総肺気量で割ることによって LAA (LAA %) の割合を計算します
4 トレッドミル テスト
- 適応マウスの上実行しているトレッドミル マシン注 10 分間 10 m/分の速度でテストを与える: 電気は、常にオフの手順が実施されている場合。
- 管理、。マウスに疲労試験。
- ウォーム アップ 5 分 10 m/分の速度でマウス
- 15 m/分で 10 分間に速度を上げる
- 運動強度を高める: 20 m/分、開始 5 m/分まで速度を上げるマウスまで 30 分毎の 36 を実行する続行できません 。
- 走行距離、距離疲労と疲労時間として時間を実行すると、それぞれの合計を記録します
5 肺機能測定
- pelltobarbitalum natricum の腹腔内注入マウスの麻酔 (1%、0.6 - 0.8 ml/100 g) マウスを見るのは個々 の状況に応じて投与量を調整。つま先のピンチに応答しないと、マウスは自発呼吸。 モニターを維持し、安定した呼吸の頻度でマウスを維持するを待つ手続き中に自主的な動きがないかどうかを確認します 。
- は慎重にマウスを tracheostomize し、コンピューター制御の人工呼吸器に接続されている体プレチスモ グラフでそれらを配置します
。 注: 換気、気管内チューブに近位に位置する弁を介して制御されます。セットアップは、準静的圧力ボリュームの演習、高速水流量の演習を含む別の半自動操縦を提供します 。
- 平均通常呼吸パターンまで圧力制御の換気麻酔下マウスに 150 の呼吸/分の呼吸を課すし、各呼吸サイクルの完全な有効期限を取得します 。
- プレチスモで生成された負圧を使用して、デバイスと準静的圧力ボリューム操作を実行します 。
- は、声帯と fev 社を記録する準静的圧容積ループ内で速い流れボリューム操作を実行します。+30 cm H 2 肺を膨らませる O およびすぐにその後まで残留量-30 cm H 2 o ・ レコードで、最初の 25、50、75 ms 呼気 (fev 社 25 の fev 社は有効期限を設けるに高い負圧に接続、Fev 社 50、と fev 社 75、それぞれ)。最適な演習を拒否します。ひとつひとつのマウスと各テストでは、すべての数値パラメーターの信頼できる平均を取得する 3 つの許容される作戦の最低です 。
6。BALF コレクション
- pelltobarbitalum natricum ターミナル麻酔後 ((1%、1.8 2.4 ml/100 g)、マウスはないつま先ピンチに対応し、息を失うことを参照してくださいに個々 の状況に応じて投与量を調整)、洗浄、2 ml の PBS の 1 mm の気管内チューブと、取得 BALF 10 を介してマウスします 。
- 取得した洗浄因数をプール、それら 4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心
- 即座の使用のための上澄みを集め、-80 ° C または液体窒素で残りの部分を格納します 。
- 診断を使用してセルの合計数をカウントします 。
- PBS で、スピン (1,400 x g、6 分) 250 μ L のスライド スピンの遠心分離機を使用してスライド上に細胞を再懸濁細胞ペレットを再懸濁します 。
- 製造業者に従ってスライド細胞適用ライト染色 ' s プロトコル 。
- マウスあたり 200 セルをカウント; 400 倍の倍率での標準的な形態によるとマクロファージや好中球、セルを識別し、その番号をカウントします 。
7。心臓採血
- 心臓穿刺による採血、1.5 mL チューブにそれを読み込む、氷上で 30 分間それを維持
- G × 2,000 と 4 で 5 分間の血液サンプルを遠心分離機 ° C
- 新しいチューブに上清 (血清) を転送し、-80 ° C または液体窒素で保存します 。
- Il-1 β の血清を準備 IL-10 ・ TNF α 検出テストのそれぞれの ELISA キットを使用しています 。
8。肺木股
- マウスから気管、肺を解剖。
- 犠牲後すぐに手術のボードの上にそれぞれの euthanized マウスを配置します 。
- 広頸筋を離れて分析と視覚化し、気管軟骨輪をアクセスする前脛骨気管筋 。
- 、胸部を開く空洞。解剖肺と、気管が肺から心臓を区切らないでください 。
- PE90 ポリエチレン管を通って 4% パラホルムアルデヒドの入った注射に気管内カテーテルを接続します
。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。手袋と安全メガネを着用、ヒューム フード内部ソリューションを使用します 。
- は、気管内カテーテルを 4% パラホルムアルデヒド (10 滴、〜 200 μ L) を使用して完全に肺を膨らませます。インフレの完了後中心部を削除します 。
- 少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 10 mL を含む 15 mL チューブに肺を維持
- はパラフィンに肺を埋め込みます。回転式ミクロトームで、セクショニング パラフィン ブロックで 5 μ m のセクションを取得します。断面、肺の気管支領域内の最大の表面積を公開します 。
- 形態計測学的解析、実行ヘマトキシリンとエオシン (H & E) セクションに染色します 。
- 明るいフィールド正立顕微鏡 (対物レンズ 20 X; 露光時間、1.667 ms) とセクションのイメージします 。
- がある 2 つの調べ治療プロトコルに目がくらんで組織切片を別々 にカウントします。間肺胞中隔の壁までの距離を測定するためのパラメーターとして平均線形インターセプト (L m) を使用します。L m 次の手順を使用してを決定する:
- セクションのイメージを Photoshop で開き、5 550 μ m の長い行のイメージにレティクル グリッドを描画します 。
- グリッド線上に肺胞の数をカウントします 。
- は、グリッドの行の長さを肺胞の数で割ることによって L m を計算します。定量化, 画像のマウスごとの 5 つのセクションを実行します。各セクション (フィールド 1 つのイメージ) の 10 の画像を取得し、ランダムに評価します。フィールド選択中に前方または別の方向に 1 つのフィールドを移動することによって航空・船舶分野を避ける
。 注: データは、平均 ± S.E.M. として記載して非対応の t 検定は空気にさらされたマウスとマウスのオゾン暴露間の比較を行った。各グループの 3 つの動物は、有意の差の計算に使用されました。P-値 < 0.05 が重要視され 。
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Representative Results
各グループの 3 D µCT 画像の例としては、図 1に表示されます。オゾン暴露マウスが大きく総肺気量 (図 1と b) と LAA % (図 1c) 空気露出コントロール マウスよりも。肺気量と LAA % に残ったオゾン露出31,32の 6 週後上昇。LAA % と増加し、肺容積は、肺気腫の表現型を表しています。図 2に肺の肺胞肥大の例では、肺気腫形成を示しています。平均線形インターセプト (Lm) の増加は、ozone 暴露後肺実質の破壊が発生したことを確認したオゾン暴露マウス (図 2b) にみられた.
Fev 社25として示されて、気流速度パラメーターを用いて肺機能/FVC、fev 社50/FVC と fev 社75/FVC。結果、すべてのオゾン暴露マウス (図 3a から c) の減少パラメーターが COPD 患者4,37典型的な肺機能障害と一致しました。純正モデルをさらに評価するため、6 分間歩行テスト (6MWT)38,39、COPD 患者の機能的な運動能力の変化を評価するために用いられる代替運動負荷テストを行った。オゾン暴露が疲労疲労の時間と距離を大幅に減少 (図 4と b)。
純正モデルで COPD の病態に対応するためは、マクロファージや好中球は; マウスの BALFs から数えられました。マウス血清中の炎症性サイトカイン (il-1、TNF-α) と抗炎症性サイトカイン (IL-10) が検出されました。オゾンにさらされたマウスは、IL-10 の重要な減少および il-1、TNF-α が増加炎症性細胞、マクロファージ、好中球 (図 5a から c) などの大幅な増加を示した (図 6a から c).すべてのデータは、OE モデル人間の COPD のような症状を締めくくっていることを示した。
図 1。オゾン露出増加肺気量と µCT によって検出された LAA % 。(a) 代表的な 3 D の画像はそれぞれの露出の後の 7 週間で空気やオゾン暴露マウスの肺を示します。(2 つのグループ b) 個々 の全肺気量は、統計量のための 3 D 画像から抽出されました。オゾン暴露のマウスは、全肺気量の大幅な増加を示した。(c) 個人と平均 2 つのグループの LAA %。オゾン暴露のマウスは、LAA % で有意な増加を示した。赤い色は、LAA (2,550 2,700 ハンス単位の密度のボクセル) を示します。気管と気管支は、この図では赤で表示されますは、肺 LAA を計算する削除されました。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * * P < 0.01 * * * P < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。オゾン露出増加 Lm 。(空気露出やオゾン暴露マウスの彼ステンドのセクションで肺歯槽スペースの a) 代表的な顕微鏡写真。(Lm の b) 個々 の値は、統計量のための 2 つのグループの肺セクションから定量化されました。Lm の増加はオゾン暴露マウスで観察されました。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * * P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.オゾン暴露は肺機能を低下します。(c)大気にさらしたとオゾン暴露のマウス、最初の 25 で個々 の fev 社の 50、および 75 ms 高速有効期限 (FEV fev 社75fev 社50、25それぞれ)、FVC, だけでなく、すべては記録されました。Fev 社25、fev 社50、fev 社75 FVC の比率が算出されます。Fev 社25/FVC、fev 社50/FVC と fev 社75/FVC すべて減少で大幅オゾン暴露のマウス。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * P < 0.05 * * P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.オゾン暴露減った疲労時間と疲労の距離。(a) の個々 の実行時間の空気- またはオゾン暴露マウスを記録しました。オゾン暴露マウス疲労時間の重要な減少を示した。(2 つのグループ b) 個々 の走行距離を記録しました。オゾン暴露のマウスは、疲労の距離の大幅な減少を示した。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * P < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.炎症細胞は BALF からカウントされます。(a) 個人と平均総細胞数 (合計) 空気やオゾン暴露のマウス。(2 つのグループにおけるマクロファージ (MAC) の b) 個人と平均の数値です。(c) 個人と平均 2 つのグループ (ノイ) 好中球の数値です。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * P < 0.05 * * P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.血清中の炎症性と抗炎症サイトカインの検出。(空気やオゾン暴露マウスの IL-10 の量の a) 個人と平均値。(2 つのグループの il-1 β の量の b) 個々 および平均値。(2 つのグループで TNF-α の量の c) 個々 および平均値。データは、平均 ± S.E.M. として表示されます * P < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、COPD の新しいモデルを生成するための信頼性の高い方法を提案する.この OE モデル (すなわち、 LPS または PPE モデル) の他のモデルと比較して、COPD 患者の病理学的プロセスを繰り返します。タバコの煙は、人間の患者40で COPD を引き起こす主な有害物質は、最も人気のある COPD モデル41,42のまま CS モデルです。ただし、CS モデルは 3-12 月 R を必要があります & 新薬の開発期間。CS モデルに比べると、現在の純正モデルは、6-8 週間に生成期間を短縮します。我々 は、私たち以前研究30,31,32オゾン暴露の 6 週間後雄マウスで肺気腫を観察しました。本研究では 7 週間雌マウスに OE プロトコルを適用し、女性 OE モデル生成に成功しました。COPD 死亡率が男性で減少したが、いくつかの国の33の女性の増加が報告されている、ために、病原性のメカニズムを研究し、女性の COPD モデルを用いた女性の COPD 患者の治療アプローチを開発する必要が。上記 COPD モデル (すなわちLPS、PPE は、および CS) が両方オスおよびメス動物43で作業できることがわかっています。この作業の目的は、両方の COPD 患者の病理学的プロセスを繰り返すと非常に短い生成期間を必要とする追加の COPD モデルを提案することでした。
このモデルを生成する重要なステップは、6-8 週間 (3 日に 1 回) 週 2 回 (レベル 2.5 ppm) のオゾンにマウスが公開された (本研究で我々 使用される 7 週間、増量を試していませんが)。露出頻度とオゾン濃度の重要なパラメーターを制御することによって、我々 は正常に雌性 balb/c マウス (現在、男性 BALB/c マウス30、男性 C57BL/6 マウス31,32肺気腫を再現研究)。気流制限と肺実質の破壊 COPD 患者44,45.で見られる変化と同様のオゾン暴露に起因する肺気腫の表現型
まだこの研究に制限があります。たとえば、人間の COPD の病態が肺の解剖学に関連しているので理想的な COPD モデル必要があります人間のような肺の解剖学的構造を持つ動物で生成されます。大型の動物に比べると、小動物は人間46よりも分岐も少なく広範囲気道を所有しています。大型の動物で COPD モデルを生成するより意味のあることを認めなければなりません。ただし、動物の大規模なモデルを確立する非常に困難です。このモデルのもう一つの制限は、その臨床的意義です。オゾン28への暴露後にいくつかの COPD 患者の症状悪化の証拠があるが、オゾンが上気道と反応でき、肺組織19,22に損傷を与えるは確かだがオゾンは、COPD 患者の主な原因ではありません。しかし、まだ提案・ オゾンと CS の両方が炎症を誘導することによって呼吸器系に損傷を与える酸化ストレス26,27につながるのでこの OE モデルを使用します。したがって、新薬 assumably OE モデルすることができますで COPD を治すことができる CS モデルで活躍、したがって潜在的 copd を開発します。
純正モデルのアプリケーションは、COPD の分子・細胞メカニズムの解明に制限はありません。私たちの 2 つの最近の論文では、N-アセチルシステイン (NAC)31 /NaHS32 (H2S の外因性ドナー) 純正モデルに 2 つの薬の外因性投与による COPD の治療での効果についても検討。最初の研究では、気道過敏性の反転と NAC 投与後気道平滑筋質量の減少を発見します。これらの効果は、COPD 患者31で NAC の潜在的な臨床利点のための基礎を可能性があります。純正モデルの 2 番目の研究では、外因性 NaHS の管理が逆に肺の炎症、肺気腫の機能を部分的に反転を発見します。この OE のモデルでは、ことを示した予備研究で NaHS が COPD 患者32の潜在的な薬剤の候補者として開発される可能性があります。したがって、純正モデルが両方のメカニズムの研究のための潜在的なアプリケーションと COPD の薬物スクリーニング。
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Disclosures
Z.W.S. と大戦は、現在の従業員と細胞生物医学グループのストック オプションの保有者 (NASDAQ: CBMG)。他の作家は、彼らが競争の興味あることを宣言します。
Acknowledgments
著者はこのプロトコル µCT の評価に関する技術的な支援を療養 Qin 氏 (上海公共衛生臨床センター) に感謝して思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Slac Laboratory Animal,Shanghai, China | N/A | 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study. |
| Individual ventilated cages | Suhang, Shanghai, China | Model Number: MU64S7 | The cages were used for housing mice in the animal facility. |
| Sealing perspex-box | Suhang, Shanghai, China | N/A | The box was used to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box. |
| Electric generator | Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany | Model 500 | The device was used for generating ozone. |
| Ozone probe | ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK | Ozone 300 | The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone. |
| Pelltobarbitalum natricum | Sigma, St. Louis, MO, USA | P3761 | Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum. |
| Micro-Computed Tomography | GE Healthcare, London, ON, Canada | RS0800639-0075 | This device was used for acquiring images of the lung. |
| Micro-view 2.01 ABA software | GE Healthcare, London, ON, Canada | Micro-view 2.01 | This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung. |
| Treadmill machine | Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China | DSPT-208 | This machine was usd for fatigue test. |
| Body plethysmograph | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Ventilator | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Slide spinner centrifuge | Denville Scientific, Holliston, MA, USA | C1183 | It was used to spin BALF cells onto slides. |
| Wright Staining | Hanhong, Shanghai, China | RE04000054 | It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF. |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, Horsham, PA, USA | 4000 | It was used to count cells. |
| IL-1β | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100704 | They were used to test the respective factors in serum. |
| IL-10 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab46103 | They were used to test the respective factors in serum. |
| TNF-α | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100747 | They were used to test the respective factors in serum. |
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO, USA | P6148 | The lung was inflated by 4% paraformaldehyde. |
| Paraffin | Hualing, Shanghai, China | 56# | It was used to embed the lung. |
| Rotary Microtome | Leica, Wetzlar, Hesse, Germany | RM2255 | It was used for sectioning the lung. |
| Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution | Solarbio, Beijing, China | G1120 | H&E staining was done for morphometric analysis. |
| Upright bright field microscope | Olympus, Center Valley, PA, USA | CX41 | It was used to image the H&E staining slides. |
| Adobe Photoshop 12 | Adobe, San Jose, CA, USA | Adobe Photoshop 12 | It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images. |
| GraphPad prism 5 | Graphpad Software Inc., San Diego, CA | GraphPad prism 5 | It was used for data analysis and production of figures. |
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