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Artigo de método

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

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DOI:

10.3791/56095

⸱

25 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

Resumo

Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada pela destruição parenquimatosa pulmonar e limitação de persistente do fluxo de ar. Tem uma incidência muito alta no envelhecimento das populações. As terapias convencionais atuais para DPOC foco principalmente no sintoma-drogas; assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais qualificados de DPOC poderiam ajudar a caracterizar os mecanismos subjacentes e podem ser usados para o rastreio de drogas novas. Modelos atuais de DPOC, tais como lipopolissacarídeo (LPS) ou a elastase pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema induzido, gerar a DPOC, como lesões nos pulmões e vias aéreas mas não caso contrário se assemelham a patogênese da DPOC humana. Fumo um cigarro (CS)-modelo induzido continua a ser um dos mais populares porque não só simula DPOC-lesões no sistema respiratório, mas também é baseado em um dos principais materiais perigosos que causa a DPOC em seres humanos. No entanto, os aspectos demorados e trabalhosos do modelo CS-induzido limitam drasticamente sua aplicação na despistagem de drogas novas. Neste estudo, geramos com êxito um novo modelo de DPOC, expondo os ratos a altos níveis de ozônio. Este modelo demonstrou o seguinte: 1) diminuiu o volume expiratório forçado 25, 50 e 75/forçado capacidade vital (VEF25observou, VEF50observou e VEF75observou), indicando a deterioração da função pulmonar; 2) alvéolos pulmonares alargada, com destruição parenquimatosa pulmonar; 3) redução do tempo de fadiga e distância; e 4) aumento da inflamação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o modelo de exposição (OE) de ozônio é um modelo animal confiável que é semelhante aos seres humanos porque superexposição de ozônio é um dos fatores etiológicos da DPOC. Além disso, só demorou 6-8 semanas, com base no nosso trabalho anterior, para criar um modelo de OE, Considerando que requer 3-12 meses para induzir o modelo de fumaça de cigarro, indicando que o modelo de OE pode ser uma boa escolha para a investigação de DPOC.

Introdução

Estima-se que a DPOC, incluindo enfisema e bronquite crônica, pode ser a terceira principal causa de morte no mundo em 20201,2. A potencial incidência de DPOC em uma população de mais de 40 anos de idade é estimada em 12,7% no sexo masculino e 8,3% nas fêmeas dentro os próximos 40 anos3. Não há medicamentos dispõem reverter a deterioração progressiva em pacientes de DPOC4. Modelos animais confiáveis de DPOC não só exigem a imitação do processo patológico da doença mas também requerem um período curto de geração. Modelos atuais de DPOC, incluindo os LPS ou um modelo de EPI-induzida, podem induzir sintomas de enfisema, como5,6. Uma única administração ou um desafio da semana de LPS ou PPE ratos ou ratos resulta em neutrofilia marcada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), aumentos de mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, TNF-α e IL-1 β) no LBA ou soro, produz o pulmão espaços de ar parenquimatosos destruição-ampliado e limites do fluxo de ar5,6,7,8,9,10. No entanto, LPS ou PPE não são causas de DPOC humana e, portanto, não imitar o processo patológico11. Um modelo CS-induzido produziu uma limitação do fluxo de ar persistente, destruição parenquimatosa pulmonar e reduzida capacidade de exercício funcional. No entanto, um protocolo de CS tradicional requer pelo menos 3 meses para gerar um modelo do DPOC12,13,14,15. Assim, é importante gerar um novo modelo animal mais eficiente que atenda os dois requisitos.

Recentemente, além de fumar de cigarro, poluição do ar e exposição ocupacional tornaram-se as causas mais comuns de DPOC16,17,18. O ozônio, como um dos principais poluentes (embora não é o principal componente da poluição do ar), diretamente pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido pulmonar de crianças e jovens adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozônio, bem como outros estimuladores incluindo LPS, PPE e CS, estão envolvidos em uma séria de caminhos bioquímicos de estresse oxidativo pulmonar e danos ao DNA e estão ligados ao início e à promoção da DPOC26,27. Outro fator é que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após ser exposto ao ozônio, indicando que o ozônio pode interromper pulmão função18,28,29. Portanto, geramos um novo modelo de DPOC, repetidamente, expondo ratos a concentrações elevadas de ozono por 7 semanas; Isto resultou em fluxo de ar defeitos e danos pulmonares parenquimatosas semelhantes de investigações anteriores30,31,32. Nós estendido o protocolo de OE para ratos fêmeas neste estudo e reproduzido com sucesso o enfisema observado em ratos masculinos em nossos anteriores estudos30,31,32. Porque a mortalidade da DPOC diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em muitos países,33, um modelo de DPOC em fêmeas é necessário para estudar os mecanismos e desenvolver métodos terapêuticos para pacientes de DPOC. A aplicabilidade do modelo para todos os gêneros OE presta apoio adicional ao seu uso como um modelo de DPOC.

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Protocolo

Nota: OE o modelo foi gerado e usado em pesquisa anteriormente relatados 30 , 31 , 32. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Shanghai Jiaotong.

1. ratos

instalação
  1. casa isentos de organismos patogénicos, de 7 a 9-semana-idade BALB/c ratos fêmeas em gaiolas individuais ventilados um animal sob controlados temperatura (20 ° C) e humidade (40-60%). Fornece uma luz 12 h e ciclo escuro de 12 h na instalação. Providenciar comida e água ad libitum.

2. Ozônio ou exposição de ar

  1. gerar ozônio com um gerador elétrico em uma caixa de acrílico (por exemplo, Perspex) a vedação. Sopre o ar fora da caixa usando um soprador de ar pequeno através de uma tubulação do respiradouro de ar que está conectado no lado de dentro e fora da caixa. Controlar a concentração de ozônio na caixa usando uma sonda de ozônio. Espere até que a concentração de ozônio na caixa atinge 2,5 partes por milhão (ppm).
    Nota: A sonda do ozônio pode alternar automaticamente o gerador de ozônio ou desligar e pode manter o nível de ozônio na caixa a 2,5 ppm.
  2. Coloque os ratos no caixa quando o nível de ozônio atinge 2,5 ppm. Manter os ratos na caixa para 3h cada vez de expô-las ao ozônio.
    Nota: A caixa pode manter um nível de ozônio de 2,5 ppm durante a 3h comutando automaticamente o gerador de ozônio, ligado ou desligado e soprar o CO 2 que é produzido pelos ratos fora da caixa.
  3. Dar duas exposições de ozônio (cada exposição durando 3h) por semana (uma vez a cada 3 dias) por 7 semanas; expor os ratos controle ao ar ao mesmo tempo e no mesmo período.

3. Microtomografia computadorizada

  1. no fim de semana 7, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o mouse não responder a uma pitada do dedo do pé. Monitor e mantenha o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.
  2. Coloque os ratos anestesiados na câmara de uma microtomografia computadorizada (µCT).
  3. Calibrar o µCT usando o protocolo padrão e o fabricante ' instruções s. Conjunto do tubo de raio x em 50 kV e a corrente em 450 µA.
    Nota: Tanto o raio-x e o detector giram em torno do ratos.
  4. Realizar a análise µCT adquirindo 515 projeções com um tamanho de pixel eficaz de 0,092 mm, tempo de exposição de 300 ms para uma fatia e uma espessura da fatia de 0,093 mm.
  5. Reconstruir o pulmão com as imagens adquiridas usando um software. Ajustar o brilho da imagem em tons de cinza, definindo o mínimo e máximo, a escala de cinza em unidades de Hounsfield-750 e -550, respectivamente.
    Nota: O software automaticamente irá calcular os volumes do parênquima pulmonar e a área do baixo-atenuação (LAA) 34 , 35.
  6. Calcular a porcentagem de LAA (LAA %) dividindo o volume LAA pelo volume total do pulmão.

4. teste de esteira

  1. dão os ratos uma adaptação testar em uma velocidade de 10 m/min por 10 minutos em uma execução esteira máquina. Nota: A eletricidade está sempre desligado quando o processo está sendo conduzido.
  2. administrar um teste de fadiga para os ratos.
    1. Aquecer os ratos a uma velocidade de 10 m/min 5 min.
    2. Aumentar a velocidade de 15m/min durante 10 min.
    3. Aumentar a intensidade do exercício: aumentando a velocidade de 5 m/min, começando com 20 m/min, a cada 30 min até ratos não pode continuar a executar 36.
  3. Gravar o total, correndo a distância e tempo de execução como fadiga de distância e tempo de fadiga, respectivamente.

5. medidas de função pulmonar

  1. anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o rato faz Não responde a uma pitada de dedo do pé e esperar até que os ratos têm mantido respiração espontânea. Monitor e mantém o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.
  2. Cuidadosamente tracheostomize os ratos e os coloque em um pletismógrafo de corpo que está ligado a um ventilador controlado por computador.
    Nota: A ventilação é controlada através de uma válvula localizada proximalmente ao tubo endotraqueal. A instalação oferece diferentes manobras semiautomáticas, incluindo a manobra do volume pressão quase estático e a manobra do volume fluxo rápido.
  3. Impor uma média de frequência de 150 respirações por minuto para o rato anestesiado por meio de ventilação de pressão controlada até um padrão de respiração regular de respiração e expiração completa em cada ciclo de respiração é obtida.
  4. Executar a manobra de pressão-volume quase estático com o dispositivo usando as pressões negativas geradas na pletismografia.
  5. Executar a manobra de volume de fluxo rápido dentro dos loops de pressão-volume quase estático para gravar a CVF e o VEF. Inflar o pulmão para + 30 cm H 2 O e imediatamente depois, conecte-o a uma pressão altamente negativa para impor a expiração até o volume residual é a-30 cm H 2 O. Record o VEF nos primeiros 25, 50 e 75 ms de exalação (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, respectivamente). Rejeite as manobras de qualidade inferior. Para cada teste com cada único rato, realizar um mínimo de três manobras aceitáveis para obter uma média confiável para todos os parâmetros numéricos.

6. BALF coleção

  1. após anestesia terminal com pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8 a 2,4 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver o que o rato não responder a uma pitada de dedo do pé e perder o fôlego), lavagem do ratos com 2 mL de PBS através de um tubo endotraqueal de 1 mm de diâmetro e em seguida, recuperar o LBA 10.
  2. Reunir as alíquotas de lavagem obtida e centrifugá-los a 4 ° C e 250 x g durante 10 min.
  3. Recolher o sobrenadante para uso imediato e guarde o restante no-80 ° C ou líquido nitrogênio.
  4. Conte o número total de células usando um hemocytometer.
  5. Ressuspender as células em PBS e então girar (1.400 x g, 6 min) 250 µ l de células ressuspensa em slides utilizando uma centrífuga de girador de slide.
  6. Wright aplicar coloração para células nos slides de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
  7. Contar 200 células por rato; identificar as células como macrófagos ou neutrófilos, de acordo com a morfologia padrão, com ampliação de X 400; e contar os números deles.

7. Amostragem de sangue cardíaco

  1. coletar sangue através de punção cardíaca, carregá-lo para tubos de 1,5 mL e mantê-lo no gelo por 30 min.
  2. Centrifugar as amostras de sangue por 5 min em 2.000 x g e 4 ° C.
  3. Transferir o sobrenadante (soro) para um tubo novo e armazená-lo no-80 ° C ou líquido nitrogênio.
  4. Preparar o soro para IL-1 β, IL-10 e testes de detecção de TNF-α usando os respectivos kits ELISA.

8. Análise morfométrica de pulmão

  1. dissecar os pulmões e tracheas de ratos.
    1. Posicionar cada rato euthanized em uma placa cirúrgico imediatamente após o sacrifício.
    2. Distância dissecar a platisma e músculos traqueais anteriores para visualizar e acessar os anéis traqueais.
      3. Cavidade
    3. aberto até a torácica. Dissecar os pulmões e a traqueia, mas não separe o coração dos pulmões.
  2. Se conectar o cateter endotraqueal para uma seringa contendo paraformaldeído 4%, através de um tubo de polietileno PE90.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Usar luvas e óculos de segurança e usar a solução dentro de uma coifa.
  3. Inflar o pulmão completamente usando paraformaldeído 4% (10 gotas, ~ 200 µ l) através do cateter endotraqueal. Remover o coração após a conclusão da inflação.
  4. Manter o pulmão em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h.
  5. Incorporar o pulmão em parafina. Obter as seções 5-µm por bloco de parafina com um micrótomo rotativo de corte. Durante o corte, expor a área máxima da superfície do tecido pulmonar dentro da área da árvore brônquica.
  6. Para Análise morfométrica, executar hematoxilina e eosina (H & E) coloração sobre as seções.
  7. As seções de imagem com um microscópio de campo claro vertical (lente objetiva, 20 X; tempo de exposição, ms 1,667).
  8. Tem dois investigadores cegos para o protocolo de tratamento independentemente as secções histológicas. Use a interceptação linear média (L m) como um parâmetro para medir a distância da parede do septo inter alveolar. Determinar a L m usando as seguintes etapas:
    1. abrir as imagens das seções no Photoshop e desenhe uma reticule-grade na imagem com longas filas de cinco 550 µm.
    2. Contar o número de alvéolos através da linha de grade.
    3. Calcular a L m dividindo o comprimento da linha de grade pelo número de alvéolos. Para quantificação, imagem cinco seções por rato. Adquirir dez imagens de cada seção (uma imagem por campo) e avaliar aleatoriamente. Durante a seleção do campo, evitar áreas de vias aéreas e vasos movendo um campo à frente ou em outra direção.
      Nota: Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou Um teste t não-pareado foi realizado para comparação entre ar-expostos ratos e camundongos expostos de ozônio. Três animais de cada grupo foram usados para calcular a diferença significativa. Um p-valor de < 0,05 foi considerado significativo.

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Resultados

Exemplos de imagens 3D µCT de cada grupo são exibidos na Figura 1um. Os ratos expostos de ozônio tinham um volume de pulmão total significativamente maior (Figura 1a e b) e LAA % (Figura 1c) do que os ratos controle expostas ao ar. O volume pulmonar e LAA % manteve-se elevado após seis semanas de ozônio exposição31,...

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Discussão

Neste estudo, apresentamos um método confiável para a geração de um novo modelo de DPOC. Comparado a outros modelos (i.e., LPS ou modelos de EPI), este modelo de OE recapitula o processo patológico de doentes com DPOC. Porque a fumaça do cigarro é o principal material perigoso que causa a DPOC em pacientes humanos40, o modelo CS continua a ser o mais popular DPOC modelo41,42. No entanto, o modelo CS requer um R de 3 a 12 meses ...

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Divulgações

Z.W.S. e W.W. são empregados atuais e detentores de opção de ações do grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Outros autores a declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Agradecimentos

Os autores gostaria de expressar gratidão ao Sr. Boyin Qin (Shanghai clínicos centro de saúde) para a assistência técnica com a avaliação de µCT neste protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos BALB/cSlac Laboratory Animal, Shanghai, China/ACamundongos BALB/c fêmeas de 7 a 9 semanas de idade foram usados neste estudo.
Gaiolas ventiladas individuaisSuhang, Shanghai, ChinaNúmero do modelo: MU64S7As gaiolas foram usadas para abrigar ratos nas instalações para animais.
Vedação de perspex-boxSuhang, Shanghai, ChinaN/AA caixa foi usada para conter o gerador de ozônio. Os ratos foram expostos ao ozônio dentro da caixa.
Gerador elétricoSander Ozoniser, Uetze-Eltze, AlemanhaModelo 500 O dispositivo foi usado para gerar ozônio.
Sonda de ozônioATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Grande Manchester, Reino UnidoOzônio 300O dispositivo foi usado para monitorar e controlar a geração de ozônio.
Pelltobarbitalum natricumSigma, St. Louis, MO, EUAP3761Camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum.
Microtomografia ComputadorizadaGE Healthcare, Londres, ON, CanadáRS0800639-0075Este dispositivo foi usado para aquisição de imagens do pulmão.
Micro-view 2.01 Software ABAGE Healthcare, Londres, ON, CanadáMicro-view 2.01 Este dispositivo foi utilizado para reconstruir o pulmão e analisar o volume, AAE do pulmão.
Máquina de esteiraDuanshi, Hangzhou, Zhejiang, ChinaDSPT-208Esta máquina foi usd para teste de fadiga.
Pletismógrafo corporaleSpira™ Sistema de Manobras Forçadas, EMMS, Edimburgo, Reino UnidoSistema de Manobras ForçadasEste dispositivo foi usado para testar a função pulmonar da espirometria.
VentiladoreSpira™ Sistema de Manobras Forçadas, EMMS, Edimburgo, Reino UnidoSistema de Manobras ForçadasEste dispositivo foi usado para testar a função pulmonar da espirometria.
Centrífuga giratória deslizanteDenville Scientific, Holliston, MA, USAC1183 Foi usado para girar células BALF em lâminas.
Wright StainingHanhong, Xangai, ChinaRE04000054  Foi usado para corar macrófagos, neutrófilos no BALF suspenso.
HemocitômetroHausser Scientific, Horsham, PA, EUA4000Foi usado para contar células.
IL-1βAbcam, Cambridge, MA, EUAab100704Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.
IL-10Abcam, Cambridge, MA, EUAab46103Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.
TNF-&alfa;Abcam, Cambridge, MA, EUAab100747Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.
Paraformaldeído Sigma, St. Louis, MO, EUAP6148O pulmão foi inflado com paraformaldeído a 4%.
ParafinaHualing, Xangai, China56#Foi usado para incorporar o pulmão.
Micrótomo RotativoLeica, Wetzlar,  Hesse, AlemanhaRM2255Foi usado para seccionar o pulmão.
Hgaematoxilina e Eosina (H& E) solução de coloraçãoSolarbio, Pequim, ChinaG1120H & A coloração E foi feita para análise morfométrica.
Microscópio vertical de campo brilhanteOlympus, Center Valley, PA, EUACX41Foi usado para obter imagens do H& Lâminas de coloração E.
Adobe Photoshop 12Adobe, San Jose, CA, EUAAdobe Photoshop 12Foi usado para contar o número de alvéolos no H& E imagens manchadas.
GraphPad prisma 5GraphPad Software Inc., San Diego, CAGraphPad prism 5Foi usado para análise de dados e produção de figuras.
N

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