Summary
Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.
Abstract
Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada pela destruição parenquimatosa pulmonar e limitação de persistente do fluxo de ar. Tem uma incidência muito alta no envelhecimento das populações. As terapias convencionais atuais para DPOC foco principalmente no sintoma-drogas; assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais qualificados de DPOC poderiam ajudar a caracterizar os mecanismos subjacentes e podem ser usados para o rastreio de drogas novas. Modelos atuais de DPOC, tais como lipopolissacarídeo (LPS) ou a elastase pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema induzido, gerar a DPOC, como lesões nos pulmões e vias aéreas mas não caso contrário se assemelham a patogênese da DPOC humana. Fumo um cigarro (CS)-modelo induzido continua a ser um dos mais populares porque não só simula DPOC-lesões no sistema respiratório, mas também é baseado em um dos principais materiais perigosos que causa a DPOC em seres humanos. No entanto, os aspectos demorados e trabalhosos do modelo CS-induzido limitam drasticamente sua aplicação na despistagem de drogas novas. Neste estudo, geramos com êxito um novo modelo de DPOC, expondo os ratos a altos níveis de ozônio. Este modelo demonstrou o seguinte: 1) diminuiu o volume expiratório forçado 25, 50 e 75/forçado capacidade vital (VEF25observou, VEF50observou e VEF75observou), indicando a deterioração da função pulmonar; 2) alvéolos pulmonares alargada, com destruição parenquimatosa pulmonar; 3) redução do tempo de fadiga e distância; e 4) aumento da inflamação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o modelo de exposição (OE) de ozônio é um modelo animal confiável que é semelhante aos seres humanos porque superexposição de ozônio é um dos fatores etiológicos da DPOC. Além disso, só demorou 6-8 semanas, com base no nosso trabalho anterior, para criar um modelo de OE, Considerando que requer 3-12 meses para induzir o modelo de fumaça de cigarro, indicando que o modelo de OE pode ser uma boa escolha para a investigação de DPOC.
Introduction
Estima-se que a DPOC, incluindo enfisema e bronquite crônica, pode ser a terceira principal causa de morte no mundo em 20201,2. A potencial incidência de DPOC em uma população de mais de 40 anos de idade é estimada em 12,7% no sexo masculino e 8,3% nas fêmeas dentro os próximos 40 anos3. Não há medicamentos dispõem reverter a deterioração progressiva em pacientes de DPOC4. Modelos animais confiáveis de DPOC não só exigem a imitação do processo patológico da doença mas também requerem um período curto de geração. Modelos atuais de DPOC, incluindo os LPS ou um modelo de EPI-induzida, podem induzir sintomas de enfisema, como5,6. Uma única administração ou um desafio da semana de LPS ou PPE ratos ou ratos resulta em neutrofilia marcada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), aumentos de mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, TNF-α e IL-1 β) no LBA ou soro, produz o pulmão espaços de ar parenquimatosos destruição-ampliado e limites do fluxo de ar5,6,7,8,9,10. No entanto, LPS ou PPE não são causas de DPOC humana e, portanto, não imitar o processo patológico11. Um modelo CS-induzido produziu uma limitação do fluxo de ar persistente, destruição parenquimatosa pulmonar e reduzida capacidade de exercício funcional. No entanto, um protocolo de CS tradicional requer pelo menos 3 meses para gerar um modelo do DPOC12,13,14,15. Assim, é importante gerar um novo modelo animal mais eficiente que atenda os dois requisitos.
Recentemente, além de fumar de cigarro, poluição do ar e exposição ocupacional tornaram-se as causas mais comuns de DPOC16,17,18. O ozônio, como um dos principais poluentes (embora não é o principal componente da poluição do ar), diretamente pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido pulmonar de crianças e jovens adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozônio, bem como outros estimuladores incluindo LPS, PPE e CS, estão envolvidos em uma séria de caminhos bioquímicos de estresse oxidativo pulmonar e danos ao DNA e estão ligados ao início e à promoção da DPOC26,27. Outro fator é que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após ser exposto ao ozônio, indicando que o ozônio pode interromper pulmão função18,28,29. Portanto, geramos um novo modelo de DPOC, repetidamente, expondo ratos a concentrações elevadas de ozono por 7 semanas; Isto resultou em fluxo de ar defeitos e danos pulmonares parenquimatosas semelhantes de investigações anteriores30,31,32. Nós estendido o protocolo de OE para ratos fêmeas neste estudo e reproduzido com sucesso o enfisema observado em ratos masculinos em nossos anteriores estudos30,31,32. Porque a mortalidade da DPOC diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em muitos países,33, um modelo de DPOC em fêmeas é necessário para estudar os mecanismos e desenvolver métodos terapêuticos para pacientes de DPOC. A aplicabilidade do modelo para todos os gêneros OE presta apoio adicional ao seu uso como um modelo de DPOC.
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Protocol
Nota: OE o modelo foi gerado e usado em pesquisa anteriormente relatados 30 , 31 , 32. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Shanghai Jiaotong.
1. ratos
instalação- casa isentos de organismos patogénicos, de 7 a 9-semana-idade BALB/c ratos fêmeas em gaiolas individuais ventilados um animal sob controlados temperatura (20 ° C) e humidade (40-60%). Fornece uma luz 12 h e ciclo escuro de 12 h na instalação. Providenciar comida e água ad libitum.
2. Ozônio ou exposição de ar
- gerar ozônio com um gerador elétrico em uma caixa de acrílico (por exemplo, Perspex) a vedação. Sopre o ar fora da caixa usando um soprador de ar pequeno através de uma tubulação do respiradouro de ar que está conectado no lado de dentro e fora da caixa. Controlar a concentração de ozônio na caixa usando uma sonda de ozônio. Espere até que a concentração de ozônio na caixa atinge 2,5 partes por milhão (ppm).
Nota: A sonda do ozônio pode alternar automaticamente o gerador de ozônio ou desligar e pode manter o nível de ozônio na caixa a 2,5 ppm. - Coloque os ratos no caixa quando o nível de ozônio atinge 2,5 ppm. Manter os ratos na caixa para 3h cada vez de expô-las ao ozônio.
Nota: A caixa pode manter um nível de ozônio de 2,5 ppm durante a 3h comutando automaticamente o gerador de ozônio, ligado ou desligado e soprar o CO 2 que é produzido pelos ratos fora da caixa. - Dar duas exposições de ozônio (cada exposição durando 3h) por semana (uma vez a cada 3 dias) por 7 semanas; expor os ratos controle ao ar ao mesmo tempo e no mesmo período.
3. Microtomografia computadorizada
- no fim de semana 7, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o mouse não responder a uma pitada do dedo do pé. Monitor e mantenha o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.
- Coloque os ratos anestesiados na câmara de uma microtomografia computadorizada (µCT).
- Calibrar o µCT usando o protocolo padrão e o fabricante ' instruções s. Conjunto do tubo de raio x em 50 kV e a corrente em 450 µA.
Nota: Tanto o raio-x e o detector giram em torno do ratos. - Realizar a análise µCT adquirindo 515 projeções com um tamanho de pixel eficaz de 0,092 mm, tempo de exposição de 300 ms para uma fatia e uma espessura da fatia de 0,093 mm.
- Reconstruir o pulmão com as imagens adquiridas usando um software. Ajustar o brilho da imagem em tons de cinza, definindo o mínimo e máximo, a escala de cinza em unidades de Hounsfield-750 e -550, respectivamente.
Nota: O software automaticamente irá calcular os volumes do parênquima pulmonar e a área do baixo-atenuação (LAA) 34 , 35. - Calcular a porcentagem de LAA (LAA %) dividindo o volume LAA pelo volume total do pulmão.
4. teste de esteira
- dão os ratos uma adaptação testar em uma velocidade de 10 m/min por 10 minutos em uma execução esteira máquina. Nota: A eletricidade está sempre desligado quando o processo está sendo conduzido.
- administrar um teste de fadiga para os ratos.
- Aquecer os ratos a uma velocidade de 10 m/min 5 min.
- Aumentar a velocidade de 15m/min durante 10 min.
- Aumentar a intensidade do exercício: aumentando a velocidade de 5 m/min, começando com 20 m/min, a cada 30 min até ratos não pode continuar a executar 36.
- Gravar o total, correndo a distância e tempo de execução como fadiga de distância e tempo de fadiga, respectivamente.
5. medidas de função pulmonar
- anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o rato faz Não responde a uma pitada de dedo do pé e esperar até que os ratos têm mantido respiração espontânea. Monitor e mantém o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.
- Cuidadosamente tracheostomize os ratos e os coloque em um pletismógrafo de corpo que está ligado a um ventilador controlado por computador.
Nota: A ventilação é controlada através de uma válvula localizada proximalmente ao tubo endotraqueal. A instalação oferece diferentes manobras semiautomáticas, incluindo a manobra do volume pressão quase estático e a manobra do volume fluxo rápido. - Impor uma média de frequência de 150 respirações por minuto para o rato anestesiado por meio de ventilação de pressão controlada até um padrão de respiração regular de respiração e expiração completa em cada ciclo de respiração é obtida.
- Executar a manobra de pressão-volume quase estático com o dispositivo usando as pressões negativas geradas na pletismografia.
- Executar a manobra de volume de fluxo rápido dentro dos loops de pressão-volume quase estático para gravar a CVF e o VEF. Inflar o pulmão para + 30 cm H 2 O e imediatamente depois, conecte-o a uma pressão altamente negativa para impor a expiração até o volume residual é a-30 cm H 2 O. Record o VEF nos primeiros 25, 50 e 75 ms de exalação (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, respectivamente). Rejeite as manobras de qualidade inferior. Para cada teste com cada único rato, realizar um mínimo de três manobras aceitáveis para obter uma média confiável para todos os parâmetros numéricos.
6. BALF coleção
- após anestesia terminal com pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8 a 2,4 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver o que o rato não responder a uma pitada de dedo do pé e perder o fôlego), lavagem do ratos com 2 mL de PBS através de um tubo endotraqueal de 1 mm de diâmetro e em seguida, recuperar o LBA 10.
- Reunir as alíquotas de lavagem obtida e centrifugá-los a 4 ° C e 250 x g durante 10 min.
- Recolher o sobrenadante para uso imediato e guarde o restante no-80 ° C ou líquido nitrogênio.
- Conte o número total de células usando um hemocytometer.
- Ressuspender as células em PBS e então girar (1.400 x g, 6 min) 250 µ l de células ressuspensa em slides utilizando uma centrífuga de girador de slide.
- Wright aplicar coloração para células nos slides de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
- Contar 200 células por rato; identificar as células como macrófagos ou neutrófilos, de acordo com a morfologia padrão, com ampliação de X 400; e contar os números deles.
7. Amostragem de sangue cardíaco
- coletar sangue através de punção cardíaca, carregá-lo para tubos de 1,5 mL e mantê-lo no gelo por 30 min.
- Centrifugar as amostras de sangue por 5 min em 2.000 x g e 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante (soro) para um tubo novo e armazená-lo no-80 ° C ou líquido nitrogênio.
- Preparar o soro para IL-1 β, IL-10 e testes de detecção de TNF-α usando os respectivos kits ELISA.
8. Análise morfométrica de pulmão
- dissecar os pulmões e tracheas de ratos.
- Posicionar cada rato euthanized em uma placa cirúrgico imediatamente após o sacrifício.
- Distância dissecar a platisma e músculos traqueais anteriores para visualizar e acessar os anéis traqueais. Cavidade
- aberto até a torácica. Dissecar os pulmões e a traqueia, mas não separe o coração dos pulmões.
- Se conectar o cateter endotraqueal para uma seringa contendo paraformaldeído 4%, através de um tubo de polietileno PE90.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Usar luvas e óculos de segurança e usar a solução dentro de uma coifa. - Inflar o pulmão completamente usando paraformaldeído 4% (10 gotas, ~ 200 µ l) através do cateter endotraqueal. Remover o coração após a conclusão da inflação.
- Manter o pulmão em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h.
- Incorporar o pulmão em parafina. Obter as seções 5-µm por bloco de parafina com um micrótomo rotativo de corte. Durante o corte, expor a área máxima da superfície do tecido pulmonar dentro da área da árvore brônquica.
- Para Análise morfométrica, executar hematoxilina e eosina (H & E) coloração sobre as seções.
- As seções de imagem com um microscópio de campo claro vertical (lente objetiva, 20 X; tempo de exposição, ms 1,667).
- Tem dois investigadores cegos para o protocolo de tratamento independentemente as secções histológicas. Use a interceptação linear média (L m) como um parâmetro para medir a distância da parede do septo inter alveolar. Determinar a L m usando as seguintes etapas:
- abrir as imagens das seções no Photoshop e desenhe uma reticule-grade na imagem com longas filas de cinco 550 µm.
- Contar o número de alvéolos através da linha de grade.
- Calcular a L m dividindo o comprimento da linha de grade pelo número de alvéolos. Para quantificação, imagem cinco seções por rato. Adquirir dez imagens de cada seção (uma imagem por campo) e avaliar aleatoriamente. Durante a seleção do campo, evitar áreas de vias aéreas e vasos movendo um campo à frente ou em outra direção.
Nota: Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou Um teste t não-pareado foi realizado para comparação entre ar-expostos ratos e camundongos expostos de ozônio. Três animais de cada grupo foram usados para calcular a diferença significativa. Um p-valor de < 0,05 foi considerado significativo.
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Representative Results
Exemplos de imagens 3D µCT de cada grupo são exibidos na Figura 1um. Os ratos expostos de ozônio tinham um volume de pulmão total significativamente maior (Figura 1a e b) e LAA % (Figura 1c) do que os ratos controle expostas ao ar. O volume pulmonar e LAA % manteve-se elevado após seis semanas de ozônio exposição31,32. Volume pulmonar aumentada e LAA % representam o fenótipo de enfisema. Exemplos de alargamento alveolar do pulmão na Figura 2um ilustram a formação de enfisema. Aumento a interceptação linear média (Lm) foi observado em camundongos expostos de ozônio (Figura 2b), que confirmou que a destruição parenquimatosa pulmonar ocorreu após exposição ao ozono.
A função pulmonar foi medida pelos parâmetros de taxa de fluxo de ar, mostrados como FEV25observou, VEF50observou e VEF75observou. Os resultados mostraram que todos os parâmetros que diminuíram em camundongos expostos de ozônio (Figura 3a-c) foram consistentes com os defeitos funcionais típicas do pulmão em pacientes de DPOC4,37. Para avaliar mais o modelo de OE, foi realizado um teste de tolerância exercício que substituiu para a caminhada de 6 min teste (TC6)38,39, que é comumente usado para avaliar as mudanças na capacidade funcional de exercício em doentes com DPOC. A exposição ao ozono diminuiu significativamente a distância de tempo e cansaço fadiga (Figura 4um e b).
Para lidar com a patogênese da DPOC no modelo de OE, os macrófagos e os neutrófilos foram contados a partir do BALFs dos ratos; citocinas pró-inflamatórias (IL-1 β e TNF-α) e citocinas anti-inflamatórias (IL-10) foram detectadas em soros de rato. Os ratos expostos de ozônio mostraram um aumento significativo de células inflamatórias, incluindo macrófagos e neutrófilos (Figura 5a-c), bem como uma diminuição significativa no IL-10 e um aumento de IL-1 β e TNF-α (Figura 6um-c ). Todos os dados demonstraram que o OE modelo recapitulados humana DPOC-como sintomas.
Figura 1. Exposição de ozônio aumentou o volume pulmonar e LAA % detectado pelo µCT. (um) imagens 3D representante, mostrando os pulmões de ratos expostos a ar ou ozônio em 7 semanas após a respectiva exposição. (b) volumes de pulmão total individuais dos dois grupos foram extraídas as imagens 3D para as estatísticas. Ozônio-expostos ratos mostraram um aumento significativo no volume pulmonar total. (c) individual e médio LAA % dos dois grupos. Ozônio-expostos ratos mostraram um aumento significativo na LAA %. A cor vermelha indica LAA (voxels com densidades de 2.550-2.700 unidades de Hounsfield). A traqueia e brônquios, mostrados em vermelho nesta figura foram removidos para calcular o pulmão LAA. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * * P < 0,01, * * * P < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exposição de ozônio aumentou o Lm. (a) representante micrografias de espaços alveolar pulmonar nas seções manchada de ratos expostas ao ar ou expostas ao ozônio. (b) individuais valores de Lm foram quantificados das seções pulmão dos dois grupos para as estatísticas. Um aumento na Lm foi observado em ratos expostos de ozônio. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * * P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Exposição ao ozono ao diminuição da função pulmonar. (a-c) Para as expostas ao ar e os ozono-expostos ratos, o VEF individual na primeira 25, 50 e 75 ms de rápida expiração (FEV25FEV50e FEV75, respectivamente), bem como a CVF, foram todos registrados. As percentagens de FEV25FEV50e FEV75 a CVF foram calculadas separadamente. FEV25observou, VEF50observou e VEF75observou todos diminuíram significativamente em ratos de ozônio-expostos. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0.05, * * P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Exposição ao ozono ao reduzido tempo de cansaço e fadiga distância. (um) execução Individual vezes para ar - ou ozônio-expostos ratos foram gravados. Ozônio-expostos ratos mostraram uma diminuição significativa no tempo de fadiga. (b) individuais executando distâncias dos dois grupos foram gravadas. Ozônio-expostos ratos exibiram um decréscimo significativo na distância de fadiga. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Células inflamatórias contados da BALF. (a) individuais e médios números de células totais (TOTAL) em camundongos expostos a ar ou ozônio. (b) individuais e médios números de macrófagos (MAC) em dois grupos. (c) individuais e médios números de neutrófilos (NEU) nos dois grupos. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0.05, * * P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Deteção de citocinas inflamatórias e antiinflamatórias no soro. (a) individuais e médios valores da quantidade de IL-10 em camundongos expostos a ar ou ozônio. (b) individuais e médios valores da quantidade de IL-1 β nos dois grupos. (c) individuais e médios valores da quantidade de TNF-α nos dois grupos. Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, apresentamos um método confiável para a geração de um novo modelo de DPOC. Comparado a outros modelos (i.e., LPS ou modelos de EPI), este modelo de OE recapitula o processo patológico de doentes com DPOC. Porque a fumaça do cigarro é o principal material perigoso que causa a DPOC em pacientes humanos40, o modelo CS continua a ser o mais popular DPOC modelo41,42. No entanto, o modelo CS requer um R de 3 a 12 meses & período D de novos medicamentos. Em comparação com o modelo CS, o atual modelo de OE reduz o período de geração de 6 a 8 semanas. Temos observado enfisema em ratos masculinos após 6 semanas de exposição ao ozono no nosso anterior estudos30,31,32. Neste estudo, aplicamos o protocolo de OE para ratos fêmeas por 7 semanas e gerado com sucesso um modelo feminino de OE. Porque tem sido relatado que mortalidade da DPOC tem diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em alguns países,33, é necessário estudar os mecanismos de patogenicidade e desenvolver abordagens de cura para pacientes com DPOC femininos usando um modelo feminino de DPOC. Sabemos que os modelos de DPOC acima referidas (i.e., LPS, PPE e CS) podem trabalhar em ambos os animais machos e fêmeas43. O objetivo deste trabalho foi propor um modelo adicional de DPOC que recapitula o processo patológico de doentes com DPOC e requer um período muito curto de geração.
A etapa chave para gerar este modelo estava expondo os ratos ao ozônio (com um nível de 2,5 ppm) duas vezes por semana (uma vez a cada 3 dias) por 6-8 semanas (neste estudo, nós usamos 7 semanas, embora não tentamos escalonamento de dose). Controlando os parâmetros críticos da frequência de exposição e concentração de ozônio, nós com sucesso reproduzida enfisema em machos C57BL/6 ratos31,32, masculino de camundongos BALB/c30e camundongos BALB/c fêmeas (a corrente estudo). O fenótipo de enfisema resultou da exposição de ozono, com a limitação de fluxo de ar e a destruição de parenquimatosa pulmonar semelhante para as alterações observadas na DPOC pacientes44,45.
Ainda existem limitações para este estudo. Por exemplo, porque a patogênese da DPOC humana está relacionada com a anatomia dos pulmões, um modelo ideal de DPOC deve ser gerado em animais que têm uma estrutura anatômica pulmonar semelhante dos humanos. Comparado a grandes animais, animais de pequenos porte possuem vias aéreas ainda menos extensa ramificação do que seres humanos46. Temos de admitir que é mais significativo para gerar um modelo de DPOC em animais de grandes porte. No entanto, é muito difícil estabelecer modelos em larga escala em animais. Outra limitação deste modelo é sua relevância clínica. Embora seja certo de que o ozônio pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido de pulmão19,22, e embora não haja evidência de que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após a exposição ao ozônio,28, o ozônio não é a principal causa da DPOC em pacientes. No entanto, ainda estamos propondo e usando esse modelo de OE, porque tanto o ozônio como o CS causam danos ao sistema respiratório através da indução de inflamação e levam ao estresse oxidativo26,27. Assim, uma nova droga que pode curar a DPOC na lata modelo OE assumably também funciona no modelo CS e, portanto, potencialmente ser desenvolvido para pacientes com DPOC.
Aplicações do modelo OE não são restritas a decifrar os mecanismos moleculares e celulares da DPOC. Nossos dois trabalhos recentes também investigaram a eficácia de N-acetilcisteína (NAC)31 e NaHS32 (doador exógeno de H2S) no tratamento da DPOC através da administração exógena das duas drogas para o modelo de OE. No primeiro estudo, encontramos uma reversão de vias aéreas hiper-responsividade e uma redução da massa do músculo liso das vias aéreas após a administração de NAC. Estes efeitos podem indicar a base de potenciais benefícios clínicos do NAC em pacientes de DPOC31. No segundo estudo do modelo de OE, encontramos que a administração de NaHS exógena inverteu a inflamação pulmonar e reverteu parcialmente as características do enfisema. Assim, com este modelo de OE, nós demonstrado em um estudo preliminar que NaHS poderia ser desenvolvido como um candidato potencial de drogas para os pacientes de DPOC32. Portanto, o modelo de OE tem aplicações potenciais para a pesquisa de mecanismo tanto e despistagem de droga para DPOC.
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Disclosures
Z.W.S. e W.W. são empregados atuais e detentores de opção de ações do grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Outros autores a declaram que eles têm não tem interesses concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de expressar gratidão ao Sr. Boyin Qin (Shanghai clínicos centro de saúde) para a assistência técnica com a avaliação de µCT neste protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Slac Laboratory Animal,Shanghai, China | N/A | 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study. |
| Individual ventilated cages | Suhang, Shanghai, China | Model Number: MU64S7 | The cages were used for housing mice in the animal facility. |
| Sealing perspex-box | Suhang, Shanghai, China | N/A | The box was used to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box. |
| Electric generator | Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany | Model 500 | The device was used for generating ozone. |
| Ozone probe | ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK | Ozone 300 | The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone. |
| Pelltobarbitalum natricum | Sigma, St. Louis, MO, USA | P3761 | Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum. |
| Micro-Computed Tomography | GE Healthcare, London, ON, Canada | RS0800639-0075 | This device was used for acquiring images of the lung. |
| Micro-view 2.01 ABA software | GE Healthcare, London, ON, Canada | Micro-view 2.01 | This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung. |
| Treadmill machine | Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China | DSPT-208 | This machine was usd for fatigue test. |
| Body plethysmograph | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Ventilator | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Slide spinner centrifuge | Denville Scientific, Holliston, MA, USA | C1183 | It was used to spin BALF cells onto slides. |
| Wright Staining | Hanhong, Shanghai, China | RE04000054 | It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF. |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, Horsham, PA, USA | 4000 | It was used to count cells. |
| IL-1β | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100704 | They were used to test the respective factors in serum. |
| IL-10 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab46103 | They were used to test the respective factors in serum. |
| TNF-α | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100747 | They were used to test the respective factors in serum. |
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO, USA | P6148 | The lung was inflated by 4% paraformaldehyde. |
| Paraffin | Hualing, Shanghai, China | 56# | It was used to embed the lung. |
| Rotary Microtome | Leica, Wetzlar, Hesse, Germany | RM2255 | It was used for sectioning the lung. |
| Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution | Solarbio, Beijing, China | G1120 | H&E staining was done for morphometric analysis. |
| Upright bright field microscope | Olympus, Center Valley, PA, USA | CX41 | It was used to image the H&E staining slides. |
| Adobe Photoshop 12 | Adobe, San Jose, CA, USA | Adobe Photoshop 12 | It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images. |
| GraphPad prism 5 | Graphpad Software Inc., San Diego, CA | GraphPad prism 5 | It was used for data analysis and production of figures. |
References
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