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Bioengineering

क्रॉस-जेट-मुक्त और निशानदेही मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच Immunoassays के लिए स्नैप चिप

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

हम बस दो स्लाइड तड़क द्वारा क्रॉस-जेट-मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassays प्रदर्शन के लिए एक स्नैप चिप प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन । एक स्नैप उपकरण मज़बूती से microarray-से-microarray स्थानांतरण के लिए उपयोग किया जाता है । स्नैप चिप क्रॉस-संदूषण के बिना विभिन्न रिएजेंट के colocalization की आवश्यकता होती है किसी भी जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

मल्टीप्लेक्स प्रोटीन विश्लेषण बेहतर नैदानिक संवेदनशीलता और एक प्रोटीन की तुलना में सटीकता दिखाया गया है । एंटीबॉडी microarrays सूक्ष्म पैमाने पर immunoassays के हजारों के लिए अनुमति एक ही चिप पर एक साथ प्रदर्शन किया । सैंडविच परख प्रारूप दो एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक लक्ष्य का पता लगाने के द्वारा परख विशिष्टता में सुधार, लेकिन पार से एजेंट के बीच जेट इस प्रकार अपने मल्टीप्लेक्स क्षमताओं को सीमित से ग्रस्त है । एंटीबॉडी colocalization microarray (ACM) को क्रॉस-रिजेट-फ़्री मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन डिटेक्शन के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इसकी आवश्यकता है एक महंगी निशानदेही पर-microarray निर्माण के लिए साइट की परख के दौरान । इस काम में, हम एक तस्वीर चिप प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन है कि स्थानांतरण microarray से microarray बस दो चिप्स एक साथ तड़क द्वारा, इस प्रकार कोई निशानदेही का नमूना मशीन और बाद में आवेदन का पता लगाने के एंटीबॉडी (dAbs) के दौरान की जरूरत है पूर्व-देखे गए स्लाइडों का संग्रहण, स्लाइड तैयारी को परख निष्पादन से dissociating । दोनों एकल और दोहरे हस्तांतरण तरीकों दो microarrays और दोनों तरीकों के लिए स्लाइड निर्माण के बीच सटीक संरेखण को प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत कर रहे है वर्णित हैं । परिणाम बताते हैं कि & #60; ४० माइक्रोन संरेखण डबल हस्तांतरण के साथ प्राप्त किया गया है, ६२५ धब्बे की एक सरणी घनत्व तक पहुँचने/ एक ५०-plexed immunoassay को मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन विश्लेषण में स्नैप चिप की प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए आयोजित किया गया है । ३५ प्रोटीन का पता लगाने की सीमाएं स्नातकोत्तर की श्रेणी में हैं/

Introduction

कई प्रोटीन शामिल करने वाले विमार्क्स का एक पैनल1,2जैसे जटिल रोगों के निदान में एक एकल स्मार्कर की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान कर सकता है । एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) स्वर्ण मानक नैदानिक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है कम स्नातकोत्तर में पता लगाने की एक सीमा पर प्राप्त करने/प्लाज्मा में एमएल, लेकिन परख3,4,5प्रति एक लक्ष्य के लिए सीमा । एंटीबॉडी microarrays एक एकल माइक्रोस्कोप पर समानांतर में आयोजित की लघुकृत परख के हजारों समायोजित करने के लिए विकसित किया गया है6,7,8. हालांकि, इस विधि के मल्टीप्लेक्स क्षमता dAbs का एक मिश्रण के आवेदन से उत्पन्न होने वाली, एजेंट चालित पार-जेट द्वारा सीमित है, और यह लक्ष्य की बढ़ती संख्या के साथ और अधिक समस्याग्रस्त हो जाता है9,10 , 11. पीएलए एट अल. ने कहा है कि 4N के रूप में एक मल्टीप्लेक्स सैंडविच परख तराजू के परिणामस्वरूप भेद्यता (एन-1) जहां n लक्ष्य की संख्या12है ।

एंटीबॉडी microarrays में क्रॉस-रिजेट को कम करने के लिए, एंटीबॉडी colocalization microarray (ACM) को हमारी प्रयोगशाला में मल्टीप्लेक्स सैंडविच परख12के लिए विकसित किया गया है । कैद एंटीबॉडी (कैब) एक microarray निशानदेही के साथ एक सब्सट्रेट पर देखा जाता है । ब्लॉकिंग नमूने सतह पर लागू होते हैं, और उसके बाद व्यक्तिगत dAbs cAb-antigen जटिल के साथ एक ही स्थान पर देखा जाता है के बाद । एंटीबॉडी और एंटीजन के बीच सभी क्रॉस-जेट परिदृश्यों ACM के साथ कम किया जा सकता है, और स्नातकोत्तर/एमएल पर पता लगाने की सीमा हासिल की गई है । हालांकि, परख प्रोटोकॉल की तैयारी और प्रयोग के दौरान dAbs खोलना की आवश्यकता है एक ऑन-साइट संरेखण उद्देश्य है, जो महंगा है और समय लेने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ microarray निशानदेही का उपयोग कर, में इस प्रौद्योगिकी के व्यापक आवेदन सीमित अंय प्रयोगशालाओं । एक handheld ACM, नाम स्नैप चिप क्रॉस-जेट मुक्त और निशानदेही मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassays13,14,15के लिए विकसित किया गया है । कैब और dAbs पूर्व एक परख स्लाइड और microarray प्रारूप में क्रमशः एक स्थानांतरण स्लाइड पर देखा और संग्रहीत कर रहे हैं । परख के दौरान, स्लाइड प्राप्त कर रहे है और dAbs के एक microarray सामूहिक बस दो चिप्स एक साथ तड़क द्वारा परख स्लाइड पर स्थानांतरित कर रहे हैं । एक तस्वीर उपकरण विश्वसनीय रिएजेंट हस्तांतरण के लिए प्रयोग किया जाता है । Nitrocellulose एक अपेक्षाकृत बड़ी एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता के साथ लेपित स्लाइडें परख स्लाइड के रूप में तरल बूंदों को अवशोषित और इस तरह reagent स्थानांतरण की सुविधा के रूप में इस्तेमाल किया गया है, तथापि, स्लाइड नियमित रूप से कांच स्लाइड और microarray से अधिक महंगे है गैर-पारदर्शी स्लाइड के साथ संगत स्कैनर संकेत प्राप्ति के लिए आवश्यक हैं ।

इस काम में, हम एक तस्वीर चिप के साथ एक मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassay प्रदर्शन के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । microarray-टू-microarray से अधिक सुविधाजनक और विश्वसनीय रिएजेंट स्थानांतरण के लिए एक उपंयास स्नैप उपकरण विकसित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, यहां हम स्नैप चिप के साथ नियमित रूप से गिलास स्लाइड पर एजेंट स्थानांतरण विधि की स्थापना की है । १०२४ स्पॉट सफलतापूर्वक हस्तांतरित और एक गिलास स्लाइड पर गठबंधन किया गया, काफी ज्यादातर प्रयोगशालाओं में इस तकनीक के उपयोग का विस्तार ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. निर्माण और स्नैप चिप्स का भंडारण

  1. एकल अंतरण विधि (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a )
    1. स्पॉट कैब सॉल्यूशन युक्त ४०० & #181; छ/एमएल एंटीबॉडी और फॉस्फेट-बफर खारा में 20% ग्लिसरॉल (पंजाब) एक nitrocellulose पर (या एक कार्यात्मक ग्लास) एक inkjet microarray निशानदेही के साथ स्लाइड परख < सुप वर्ग = "xref" > 13 के सापेक्ष आर्द्रता पर ६०% (प्रत्येक स्थान के लिए १.२ nL) ८०० & #181; m केंद्र-से-मध्य रिक्ति. सुनिश्चित करें कि स्लाइड एक कोने (यहां, नीचे बाएं कोने का इस्तेमाल किया गया था) के अनुसार निशानदेही डेक पर तय की है ।
    2. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर ६०% की एक रिश्तेदार आर्द्रता के साथ देखा परख स्लाइड मशीन ।
    3. के साथ एक स्लाइड मॉड्यूल गैसकेट क्लैंप स्लाइड पर 16 डिब्बों यह 16 कुओं में विभाजित करने के लिए । तीन बार जोड़कर स्लाइड कुल्ला ८० & #181; प्रत्येक कुआं में ०.१% के बीच-20 (PBST) युक्त पंजाबियों के एल, और एक शेखर पर ४५० rpm पर मिलाते हुए, 5 मिनट हर बार ।
    4. Add ८० & #181; प्रत्येक कुआं को अवरुद्ध समाधान का L और 1 ज के लिए ४५० rpm पर शेक करें ।
    5. निकालें गैसकेट और नाइट्रोजन की धारा के साथ परख स्लाइड सूखी ।
    6. निशानदेही डेक पर एक स्थानांतरण स्लाइड को ठीक करने और निशानदेही डेक के नीचे बाएँ कोने के खिलाफ स्लाइड के नीचे बाएँ कोने धक्का. Inkjet उस कैब के लिए के रूप में एक ही लेआउट के साथ संरेखण के निशान (polystyrene सूक्ष्म मोतियों का एक समाधान) की एक सरणी हाजिर ।
    7. संरेखण चिह्नों को सूखने दें । स्थानांतरण स्लाइड फ्लिप और इसे वापस डाल निशानदेही डेक पर, नीचे बाएं कोने के खिलाफ फिक्सिंग ।
    8. 20 & #181; जी/एमएल एंटीबॉडी, 20% ग्लिसरॉल, और 1% BSA.
      9. युक्त ढाब खोलना समाधान तैयार
    9. का उपयोग करते हुए निशानदेही & #39; s कैमरा, एक संरेखण चिह्न का एक चित्र ले । एक फिड्यूशियल के रूप में खोलना कार्यक्रम में इस तस्वीर को लागू करने और सबसे ऊपर छोड़ दिया निशान की पहचान करने के लिए inkjet निशानदेही की छवि पहचान प्रणाली मिलता है । ढाब सरणी के पहले स्थान के रूप में अपने समंवय का प्रयोग करें । ८०० & #181 के केंद्र-से-मध्य रिक्ति के साथ 2 छोटी बूंद प्रति nL स्पॉट; m.
  2. दोहरे अंतरण विधि (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b )
    1. एक अंतरण स्लाइड 1 नीचे बाएं कोने के खिलाफ inkjet निशानदेही डेक पर रखें । स्पॉट कैब सॉल्यूशन युक्त ४०० & #181; जी/एमएल एंटीबॉडी, 20% ग्लिसरॉल, और पंजाब में 1% BSA एक inkjet microarray निशानदेही के साथ स्लाइड पर ६०% के सापेक्ष आर्द्रता पर (प्रत्येक स्थान के लिए ०.४ nL और ~ २०० & #181; एम व्यास में). केंद्र-से-मध्य रिक्ति ४०० & #181; m.
    2. एक nitrocellulose लेपित (या एक कार्यात्मक ग्लास) परख स्लाइड एक स्नैप उपकरण का उपयोग कर के साथ स्थानांतरण स्लाइड स्नैप (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) परख स्लाइड पर टैक्सी की बूंदों के हस्तांतरण के लिए ।
      1. तस्वीर तंत्र की ओर से सभी छह बटन ९० डिग्री द्वारा पुल और खुले स्थान में सभी plungers ताला बारी । स्थानांतरण स्लाइड होल्डर को उसके संदूक में स्लाइड धारक में निश्चित पोगो पिन का सामना करते हुए काटा हुआ कोना डालें । plungers को गोल्डन पोगो पिन के साथ रिलीज़ करने के लिए तीन बटनों का पहला सेट चालू करें और सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स संरेखण पिन के विरुद्ध धकेली गई हैं.
      2. स्नैप तंत्र में एक nitrocellulose-लेपित स्लाइड संमिलित करें उल्टा 4 पोगो पिन पर बैठे । सिल्वर पिन के साथ plungers जारी करने के लिए तीन बटनों का दूसरा सेट चालू करें और सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स संरेखण पिन के विरुद्ध धकेली गई हैं.
      3. एक सटीक स्थिति के लिए संरेखण खंभे और छेद का उपयोग कर स्लाइड धारक पर शीर्ष खोल रखकर स्नैप तंत्र को बंद करें ।
      4. अपने पिंजरे में बंद स्नैप उपकरण डालने और बंद टैब पूरी तरह से धक्का करने के लिए microarrays चेहरा लाने के लिए, जबकि उचित दबाव लागू करने के चेहरे । 1 min.
        5. के लिए बंद रखें
    3. अलग स्लाइड । ६०% की एक रिश्तेदार आर्द्रता के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर परख स्लाइड मशीन । धोने, ब्लॉक, और सूखे चरणों में वर्णित के रूप में परख स्लाइड 1.1.3-1.1.5.
    4. inkjet निशानदेही डेक पर एक और स्थानांतरण स्लाइड जगह और नीचे बाएँ कोने के खिलाफ धक्का. स्पॉट ढाब समाधान युक्त ५० या १०० & #181; जी/एंटीबॉडी के एमएल (तालिका 1 देखें), 20% ग्लिसरॉल, और पंजाब में 1% BSA । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्थान ०.८ nL है और स्पॉट के बीच केंद्र-से-मध्य रिक्ति है ४०० & #181; m.
    5. स्टोर परख और स्थानांतरण स्लाइड । जलशुष्कक युक्त एक वाटरप्रूफ बैग में दोनों परख और स्थानांतरण स्लाइड सील और एक-20 & #176 में डाल; सी फ्रीजर.
< p class = "jove_title" > 2. immunoassays स्नैप चिप्स के साथ मल्टीप्लेक्स

  1. फ्रीजर से परख स्लाइड पुनः प्राप्त । 30 मिनट के लिए सील बैग छोड़ जब तक स्लाइड कमरे के तापमान के लिए आता है ।
  2. ०.०५% के बीच युक्त पंजाब में spiking प्रोटीन द्वारा 7 सूत्री धारावाहिक पतला नमूना समाधान तैयार-20.
    नोट: यहां, एक 5 गुना कमजोर पड़ने कारक प्रयोग किया जाता है । प्रत्येक प्रोटीन के लिए शुरू सांद्रता तालिका में सूचीबद्ध हैं 1.
  3. उपयुक्त के रूप में नमूना समाधान तैयार करें । उदाहरण के लिए, PBST बफर में मानव सीरम 4 बार पतला.
  4. एक 16 की परख स्लाइड पर डिब्बे गैसकेट दबाना ।
  5. 7 प्रोटीन कमजोर पड़ने समाधान और pipetting द्वारा एक प्रोटीन मुक्त PBST बफर समाधान के साथ 8 कुओं के एक कॉलम भरें । इसी स्लाइड पर अन्य 8 कुओं में नमूना समाधान पिपेट ।
    नोट: ८० & #181; L समाधान प्रत्येक कुआं में फ़िट हो सकता है । अधिक स्लाइड्स आवश्यक होने पर अतिरिक्त नमूनों को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  6. ४५० rpm पर एक शेखर पर नमूनों की मशीन या तो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 & #176 पर रात भर के लिए; C. स्लाइड धो तीन बार PBST के साथ ४५० rpm, 5 मिनट पर हर बार में शेखर पर । गैसकेट निकालें और नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत स्लाइड सूखी ।
  7. फ्रीज़र से dAbs के साथ स्थानांतरण स्लाइड पुनर्प्राप्त करें । बैग को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सील रखें । फिर, एक बंद चैंबर में स्लाइड मशीन ( जैसे खाली युक्तियां बॉक्स) निर्जलीकरण के लिए 20 मिनट के लिए ६०% आर्द्रता स्थिरीकरण मोती युक्त ।
  8. एक स्नैप उपकरण का उपयोग कर परख स्लाइड के साथ स्थानांतरण स्लाइड स्नैप (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) ढाब बूंदें हस्तांतरण करने के लिए । स्नैप उपकरण के संचालन के लिए अनुभाग 1.2.2 देखें.
    9. स्लाइड्स को अलग
  9. । एक बंद एक 16-डिब्बे गैसकेट के साथ परख स्लाइड क्लैंप और स्लाइड 4 बार ४५० rpm, 5 मिनट में हर बार एक शेखर पर PBST का उपयोग कर कुल्ला के लिए ६०% आर्द्रता स्थिरीकरण मोती युक्त कक्ष में परख स्लाइड ।
  10. पिपेट ८० & #181; L समाधानों से युक्त २.५ & #181; g/mL streptavidin fluorophore में प्रत्येक कुआं में । ४५० rpm.
    11. पर एक शेखर पर 20 मिनट के लिए मशीन
  11. PBST के साथ स्लाइड 3 बार कुल्ला और एक बार ४५० rpm पर शेखर पर आसुत पानी के साथ । गैसकेट निकालें और स्लाइड नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर सूखी ।
< p class = "jove_title" > 3. स्लाइड स्कैनिंग और डेटा विश्लेषण

  1. एक प्रतिदीप्ति microarray स्कैनर ६३५-एनएम-लेजर का उपयोग कर के साथ परख स्लाइड स्कैन ।
  2. एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे ऐरे-प्रो विश्लेषक) का उपयोग कर प्रत्येक स्थान की शुद्ध तीव्रता निकालें < सुप क्लास = "xref" > १६ .
  3. एक आंकड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक प्रोटीन का पता लगाने (लोद) की सीमा की गणना और नमूनों में प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं ।
    नोट: लोद मानक मुद्रा के Y-अवरोधन के रूप में परिभाषित किया गया हैrve तीन बार तीन स्वतंत्र परख के मानक विचलन से वृद्धि हुई है ।

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Representative Results

दोनों एकल और दोहरे हस्तांतरण विधियों के लिए परख प्रक्रिया चित्रा 1में दिखाया गया है । एकल हस्तांतरण में, कैब परख स्लाइड पर सीधे देखा जाता है और dAbs कैब (चित्र 1a) के एक दर्पण पैटर्न में उपयोग पर परख स्लाइड पर स्थानांतरित कर रहे हैं । केवल एक स्थानांतरण प्रक्रिया की आवश्यकता है, लेकिन यह विधि दो microarrays के बीच ग़लत संरेखण से ग्रस्त है, मुख्य रूप से स्लाइड और inkjet गैन्ट्री के बीच कोणीय ग़लत संरेखण की वजह से (चित्र 2) । एक दृष्टिकोण इस चुनौती से निपटने के लिए दोनों कैब और dAbs क्रमिक रूप से परख स्लाइड पर खोलना के बाद हस्तांतरण करने के लिए है, और ठीक से स्नैप उपकरण में स्लाइड फिक्सिंग (चित्र 1b) । इस विधि का उपयोग कर, दोनों microarrays सटीक एक ही स्थिति में स्थानांतरित कर रहे हैं । दोहरे स्थानांतरण पद्धति के लिए कोई छवि पहचान प्रणाली या संरेखण मार्कर की आवश्यकता नहीं है । स्पॉट के ९८% के लिए ग़लत संरेखण ४१ µm, एकल स्थानांतरण विधि14की तुलना में 6 गुना सुधार के भीतर था ।

स्नैप तंत्र किसी भी प्रशिक्षण के बिना उपयोग करने के लिए आसान हो सकता है और सरणी ग़लत संरेखण के जोखिम को कम करने के लिए डिजाइन किया गया है । स्लाइड संरेखण पिन दोनों परख और स्थानांतरण स्लाइड के लिए आम के लिए सटीक स्थिति धंयवाद के साथ एक साथ लाया जाता है । स्थानांतरण स्लाइड पोगो पिन द्वारा निलंबित जब तक तस्वीर तंत्र बंद कर दिया है, जब तक परख स्लाइड के नीचे फिट करने के लिए थोड़ा छोटा है । एक स्पेसर स्थानांतरण स्लाइड एक माइक्रोमीटर-आकार अंतराल है कि विश्वसनीय छोटी बूंद के गिलास स्लाइड को हस्तांतरण परमिट बनाए रखने पर शामिल है । अंत में, पिंजरे और उसके बंद टैब प्रतिलिपि, उच्च गुणवत्ता हस्तांतरण के लिए हर तस्वीर पर प्रभावी हस्तांतरण के लिए आवश्यक दबाव लागू करने के लिए तैयार कर रहे हैं । तस्वीर तंत्र की एक तस्वीर चित्रा 3में दिखाया गया है ।

nitrocellulose स्लाइड पर रिएजेंट स्थानांतरण के परिणामों को दर्शाने वाली प्रतिनिधि छवियां और एक ग्लास स्लाइड आरेख 4में दिखाई गई हैं । alexa ५३२ लेबल IgGs पहले रिएजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और alexa ६४७ लेबल IgGs दूसरा एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया । स्थानांतरण के बाद, स्लाइड ५३२ एनएम और ६३५ एनएम पराबैंगनीकिरण के साथ स्कैन किया गया था । परिणाम से पता चलता है कि ३१३६ (nitrocellulose स्लाइड के लिए) या १०२४ (ग्लास स्लाइड के लिए) microspots परख स्लाइड पर शूंय विफलता के साथ स्थानांतरित कर रहे थे और कोई पार-संदूषण दूसरा एजेंट के स्थानांतरण पर मनाया गया । कांच स्लाइड का उपयोग करते समय, यह functionalization द्वारा और अधिक hydrophobic सतह बनाने के लिए संभव है, इस प्रकार प्रत्येक स्थान के आकार को कम करने और स्पॉट की एक बड़ी संख्या को स्थानांतरित करने के लिए जगह-जगह दूरी कम. यह काम आमतौर पर इस्तेमाल किया कांच सब्सट्रेट करने के लिए स्नैप चिप प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग का विस्तार ।

एक ५०-plex immunoassay के मानक curves स्तन कैंसर से संबंधित प्रोटीन को लक्षित कर रहे है चित्रा 5में सचित्र, पार-जेट के बिना तारीख को सबसे बड़ा मल्टीप्लेक्स सैंडविच एंटीबॉडी microarray के लिए इसी । डबल हस्तांतरण विधि इस परख में इस्तेमाल किया गया था, स्लाइड स्कैन किया गया था, और प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक curves उत्पन्न करने के लिए मात्रा था. ३५ से ५० प्रोटीन्स LODs पर पहुंच गए स्नातकोत्तर/एमएल (देखें तालिका 1) और आगे परख शर्तों के अनुकूलन द्वारा सुधार हो सकता है । रिएजेंट के Colocalization पार जेट के बिना एक ही स्लाइड पर एकाधिक एंटीबॉडी जोड़े के उपयोग की सुविधा है और स्वतंत्र रूप से अन्य जोड़े12पर कोई हस्तक्षेप के साथ प्रत्येक जोड़ी के अनुकूलन की अनुमति देता है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि स्नैप चिप एक स्केलेबल प्रौद्योगिकी है कि मल्टीप्लेक्स प्रोटीन ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. परख प्रक्रिया की तुलना (एक) एकल और (ख) डबल हस्तांतरण तरीकों की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. योजनाबद्ध एकल और दोहरे हस्तांतरण के बीच अंतर दिखा । (a) स्थानांतरण रिएजेंटों का मिरर करने से स्लाइड और inkjet XY स्टेज के बीच कोणीय संरेखण को प्रवर्धित किया जाता है । (ख) डबल हस्तांतरण विधि कोणीय संरेखण काबू । संदर्भ से अनुकूलित 14 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. तस्वीर उपकरण का फोटो । (a) खोला गया डिवाइस । (ख) बंद युक्ति । (ग) डिवाइस के परिप्रेक्ष्य दृश्य । संक्षेप में, (i) स्थानांतरण स्लाइड्स स्लाइड धारक में स्थित हैं और plungers पर घुड़सवार pogopin का उपयोग करके संरेखण पिन के विरुद्ध धकेले जाते हैं. (ii) परख स्लाइड pogopins के शीर्ष पर रखा जाता है और संरेखण पिन के खिलाफ धक्का दिया plungers का एक दूसरा सेट का उपयोग कर । (iii) शीर्ष शेल स्लाइड धारक के शीर्ष पर स्थित है और पिंजरे में डाला गया है । एक दबाव pogopin सेक और स्लाइड एक साथ लाने के लिए बंद टैब का उपयोग कर लागू किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक स्नैप चिप का उपयोग कर स्पॉट के सामूहिक हस्तांतरण । प्रतिदीप्ति ५३२ एनएम और ६३३ एनएम पराबैंगनीकिरण का उपयोग करने के लिए एक (एक) nitrocellulose स्लाइड पर एंटीबॉडी के हस्तांतरण का प्रदर्शन (अनुमति के साथ संदर्भ 14 से अनुकूलित) और (ख) ग्लास स्लाइड स्कैन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. एक परख स्लाइड और ५० प्रोटीन के मानक curves के प्रतिदीप्ति छवि दोहरे हस्तांतरण पद्धति का उपयोग कर समानांतर में मापा । (एक) एक मानक वक्र पैदा करने के लिए एक परख स्लाइड के प्रतिदीप्ति छवि । (b) किसी सरणी का क्लोज़-अप । स्केल बार = 2 मिमी. (ग) ५० प्रोटीन के लिए मानक घटता । त्रुटि पट्टियों के रूप में तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन की गणना की गई । संदर्भ से अनुकूलित 14 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटीन का नाम एकाग्रता शुरू (एनजी/ लोद (pg/एमएल) प्रोटीन का नाम एकाग्रता शुरू (एनजी/ लोद (pg/एमएल)
ANG2 ५०० १.३ × 104 आईएल-6बी 1 २.१ × 102
बीडीएनएफ ५०० १.० × 102 आईएल-5 ५० ७७ सीए 15-3 * 1 ४.९ × 103 आईएल-4 १००० १.५ × 104 सीईए १००० ५.४ × 103 आईएल-2 ५० ७६ CXCL10/IP-10 ५० १.७ × 102 एलईपी २०० ४.० × 102 सीआरपी २०० ४४ मिग ५०० 11 × 102 eng १००० ६.२ × 102 CCL3/मिप-1α ५० ३.३ egf ५० १.८ × 102 CCL4/मिप-1β ५० 12 egfr २०० १.९ × 102 एमएमपी-3 ५०० १.० × 102 फास-L ५०० ४.५ × 102 एम-सीएसएफ ५०० ८.२ × 103 FGF ५०० १.० × 103 एमएमपी-9 २०० ३.१ × 102 जी सीएसएफ ५०० ३९ CCL2/एमसीपी-1 ५० ५५ जीएम-सीएसएफ ५० ३.८ NCAM-1 ५०० १.७ × 103 मूह-α ५० ३.० × 102 β-NGF २०० १.४ × 103 her2 ५०० ३.५ × 103 NT-3 २०० ५.८ × 102 PDGF-बीबी २०० ७३ opn ५०० १.९ × 103 IL-1β ५०० ७.९ × 102 RBP4 २०० १.२ × 102 IL-1ra २०० १.१ × 103 sparc १००० ४.६ × 104 आईएल-15 ५० ८.२ × 102 TNF-α ५० ४.४ आईएल-12 1 30 TNF-री ५० १.३ × 102 आईएल-11 ५०० १.२ × 103 TNF-RII ५० 12 आईएल-10 ५०० ६.१ × 102 फास/TNFRSF6 २०० २.८ × 102 आईएल-8 ५० ६.६ upa २०० 24 आईएल-7 २.५ 26 uPAR (CD87) २०० ७६ आईएल-6ए १००० ८४ वीईजीएफ़ २०० ६.७ × 102

तालिका 1. प्रोटीन सांद्रता और बफर में LODs से ५०-plex परख । सीए 15-3 के लिए लोद यू/एमएल (*) में है । संदर्भ से अनुकूलित 14 अनुमति के साथ ।

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Discussion

इस काम में, हमने एक स्नैप चिप तकनीक प्रस्तुत की है जो बुनियादी प्रायोगिक सेटअप के साथ शोधकर्ताओं के लिए क्रॉस-जेट-मुक्त मल्टीप्लेक्स immunoassays को व्यापक रूप से उपलब्ध कराती है । मौजूदा एंटीबॉडी microarrays से अलग, अंत उपयोगकर्ताओं के लिए कोई microarray निशानदेही की जरूरत है । दोनों एकल और दोहरे हस्तांतरण तरीकों का प्रदर्शन कर रहे हैं, और डबल हस्तांतरण बेहतर संरेखण सटीकता के नीचे ९८% स्थानों के लिए ~ ४० माइक्रोन, ६३ µm14का सबसे बड़ा ग़लत संरेखण के साथ । एक उपंयास तस्वीर तंत्र को आसानी से लगातार दबाव के साथ दो स्लाइड स्नैप, इस प्रौद्योगिकी शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के लिए विकसित किया गया था । विश्वसनीय रिएजेंट स्थानांतरण न केवल nitrocellulose-लेपित स्लाइड पर, लेकिन यह भी नियमित रूप से ग्लास स्लाइड पर, काफी व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता के बिना इस तकनीक के आवेदन का विस्तार एहसास हुआ है । स्नैप चिप की प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए, एक ५०-plex immunoassay पूर्व-देखा और संग्रहीत स्लाइड का उपयोग कर आयोजित किया गया था, और ७०% प्रोटीन की श्रेणी में LODs हासिल की है/एमएल14। मौजूदा मल्टीप्लेक्स immunoassays कि एक मिश्रण के रूप में dAbs लागू की तुलना में, ACM और स्नैप चिप प्रौद्योगिकी का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक चिप पर परख एक दूसरे से स्वतंत्र हैं, इस तरह जोड़ने या बिना किसी भी एंटीबॉडी जोड़े को हटाने के लिए अनुमति किसी भी अंय जोड़े के साथ हस्तक्षेप । दसियों प्रोटीन के सैकड़ों करने के लिए एक साथ एक तस्वीर चिप के साथ मापा जा सकता है, इस प्रकार इस तरह अनुक्रमिक गर्मी जो प्रत्येक एंटीबॉडी के सीरियल आवेदन की आवश्यकता है द्वारा स्वचालित धारावाहिक माप के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में परख समय छोटा 17. प्रत्येक एंटीबॉडी के केवल उप-nanoliter स्नैप चिप निर्माण के लिए आवश्यक है, यह पारंपरिक immunoassays से अधिक आर्थिक बना रही है ।

एंटीबॉडी सांद्रता इस्तेमाल किया और प्रतिजन गर्मी कदम उच्च परख संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । स्नैप चिप्स के निर्माण में, एंटीबॉडी एकाग्रता एंटीबॉडी जोड़े के संबंध और परख स्लाइड (nitrocellulose या गैर nitrocellulose) के प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है । प्रत्येक एंटीबॉडी स्पॉट के वॉल्यूम को निशानदेही क्षमता और संरेखण सटीकता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, और धब्बों के बीच केंद्र-से-मध्य रिक्ति तदनुसार परिवर्तित की जा सकती है । परख स्लाइड को कैब स्थानांतरित करने के बाद, हम कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की मशीन के लिए परख स्लाइड मशीन बेहतर एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता दे सकता है । BSA मुक्त स्थिरता समाधान (सामग्री की तालिका देखें) यहाँ इस्तेमाल किया गया था मशीन कैब के बाद परख स्लाइड ब्लॉक करने के लिए. पशु सीरम या दूध के रूप में अन्य ब्लॉकिंग रिएजेंट भी इस आवेदन के लिए काम कर सकते हैं.

मल्टीप्लेक्स्ड immunoassays में, विभिन्न सरफेस केमिस्ट्री के साथ नॉन-nitrocellulose स्लाइड के लिए चलत विकसित और ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है । एक अलग कमजोर पड़ने कारक मानक curves लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अलग fluorophores dAbs लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और स्लाइड संकेत संग्रह के लिए एक अलग तरंग दैर्ध्य पर एक लेज़र का उपयोग कर स्कैन किया जा सकता है ।

वर्तमान में, ६२५ धब्बे/2 का घनत्व डबल हस्तांतरण विधि14के साथ प्राप्त किया गया है । स्नैप चिप की मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता को और बेहतर बनाने के लिए, कई कार्यनीतियां उपलब्ध हैं । सबसे पहले, छोटे संस्करणों के धब्बे के आकार को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार छोटे केंद्र के लिए अनुमति देता है धब्बे और वृद्धि की सरणी घनत्व के बीच केंद्र दूरी । दूसरे, एक अधिक hydrophobic सतह के साथ एक स्थानांतरण स्लाइड का चयन करने के लिए स्थान का आकार कम कर सकते हैं । तीसरे, दो microarrays के बीच बेहतर संरेखण inkjet निशानदेही के ठीक समायोजन प्रदर्शन से प्राप्त किया जा सकता है, और आगे नलिका और स्लाइड की सतह के बीच की दूरी के रूप में खोलना मानकों का अनुकूलन ।

सभी एंटीबॉडी आधारित immunoassays के लिए के रूप में, स्नैप चिप immunoassay के प्रदर्शन की उपलब्धता और एंटीबॉडी की गुणवत्ता के अधीन है । स्नैप चिप एक सैंडविच परख प्रारूप है, जो उच्च संवेदनशीलता और विशेष दोहरी, अलग epitopes लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी की एक जोड़ी के अनुक्रमिक बाध्यकारी द्वारा afforded के कारण एलिसा में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख प्रारूप है का उपयोग कर संचालित है, लेकिन यह पर निर्भर है संगत पर कब्जा करने और लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की एक जोड़ी की उपलब्धता ।

स्नैप चिप प्रौद्योगिकी के मूल्य immunoassays के लिए स्थापित किया गया है, और यह उम्मीद है कि यह किसी भी रासायनिक और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न रिएजेंट लागू करने की आवश्यकता के बिना पार-दूषण18,19 , 20 , 21 , 22. वास्तव में, स्नैप चिप microarray-microarray से विभिंन पूर्व-देखा एजेंट देने के लिए एक सामांय समाधान प्रदान करता है, इस प्रकार परख प्रक्रिया के साथ चिप निर्माण असंबद्धता, और इसलिए को संबोधित में मदद करता है " स्थूल-माइक्रो "सामना चैलेंज23। एक उदाहरण के रूप में, स्नैप चिप एक 4-plex सजातीय एंजाइम संकोच परख के लिए इस्तेमाल किया गया है सटीक समय के साथ १२८ शर्तों का विश्लेषण, और बड़ी मात्रा में प्रयोगों के लिए तुलनीय परिणाम14। इसके लिए मल्टीप्लेक्स ऊतक धुंधलाने के लिए भी आवेदन किया गया है । इसके अलावा, यह विभिंन बैक्टीरिया या कोशिकाओं पर रसायनों का परीक्षण करने के लिए दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए योगदान कर सकते हैं, एकल सेल विश्लेषण के लिए21,24, या एकल या बहु-चरणीय रसायन में विभिन्न स्थितियों का परीक्षण करने के लिए प्रतिक्रियाओं.

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Disclosures

मैकगिल विश्वविद्यालय के अंवेषकों के रूप में Huiyan ली और डेविड Juncker के साथ इस काम के कुछ पहलुओं पर एक पेटेंट आवेदन दायर किया है ।

Acknowledgments

हम inkjet निशानदेही के उपयोग के लिए डॉ रोब Sladek धंयवाद । हम स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से अंतिम समर्थन स्वीकार (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (NSERC), कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान और कनाडा के नवाचार के लिए फाउंडेशन (CFI) । शलया एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी से धंयवाद समर्थन करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

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References

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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