Summary
Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.
Abstract
Multiplex Protein-Analyse ergab höhere diagnostische Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich zu einzelnen Proteine. AntikörperMicroarrays erlauben Tausende Mikromaßstab Immunoassays gleichzeitig auf einem einzigen Chip durchgeführt. Sandwich-Assay-Format Spezifität des Assays erkennt jedes Ziel mit zwei Antikörper verbessert, sondern Kreuzreaktivität zwischen Reagenzien, wodurch ihre multiplexing Fähigkeiten leidet. Antikörper NS1 Microarray (ACM) für cross-reactivity-freie gemultiplexten Proteindetektion entwickelt wurde, aber erfordert eine teure vor-Ort-Spotter für Microarray Herstellung während der Tests. In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine Snap-Chip-Technologie, die Reagenz von Microarray-Microarray überträgt, indem einfach schnappen zwei Chips zusammen, somit kein Spotter während der Inkubation der Probe und Nachanmeldung Erkennung Antikörper (Tupfer) auf benötigt wird Lagerung von Pre-gefleckte Folien, Wehre die Folie Vorbereitung von Assay Ausführung. Sowohl Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden werden vorgestellt, um genaue Ausrichtung zwischen den beiden Microarrays zu erreichen und die Herstellung der Folie für beide Methoden werden beschrieben. Ergebnisse zeigen, dass < mit doppelten Transfer erreichen eine Array-Dichte von 625 Punkte/cm240 μm Ausrichtung erreicht wurde. Ein 50-Plexed-Immunoassay wurde durchgeführt, um die Nutzbarkeit des Snap-Chips in Multiplex Protein-Analyse zu demonstrieren. Nachweisgrenzen von 35 Proteine befinden sich in der Reichweite des Pg/mL.
Introduction
Eine Jury bestehend aus mehreren Proteinen Biomarker können höhere Sensitivität und Spezifität als einen einzigen Biomarker in der Diagnostik von komplexen Krankheiten wie Krebs1,2. Die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) wurde der Goldstandard Technik in klinischen Labors erreichen maximal Erkennung bei niedrigen Pg/mL im Plasma, aber Grenzen auf ein Ziel pro Assay3,4,5. AntikörperMicroarrays sind entwickelt worden, denn Platz für Tausende von miniaturisierten Assays parallel auf einem einzigen Mikroskop Folie6,7,8durchgeführt. Jedoch die multiplexing Fähigkeit dieser Methode wird durch Reagenz-driven Kreuzreaktivität, die aus der Anwendung eines Gemisches aus Spitzen, begrenzt und wird es schwieriger mit einer wachsenden Zahl von Zielen9,10 , 11. Pla Et Al. haben erklärt, dass die resultierende Anfälligkeit eines Multiplex-Sandwich-Assays als 4N(N-1) Schuppen wo N ist die Anzahl der Ziele12.
Um Kreuzreaktivität in AntikörperMicroarrays, Antikörper NS1 Microarray zu mildern wurde in unserem Labor für Multiplex-Sandwich Assay12(ACM) entwickelt. Capture-Antikörper (Kabinen) sind auf einem Substrat mit einem Microarray-Spotter gesichtet. Nach Sperre Proben sind auf der Oberfläche aufgetragen, und dann einzelne Pinselstriche werden an den gleichen Stellen mit dem cAb-Antigen-Komplex gesichtet. Alle Szenarien der Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern und Antigenen mit ACM abgeschwächt werden können, und Nachweisgrenzen bei Pg/mL erreicht wurden. Allerdings erfordert der Assay-Protokoll vorbereiten und Schmierblutungen die Pinselstriche während der Experimente mit einer vor-Ort-Microarray-Spotter mit hoher Präzision zwecks Ausrichtung, die teuer und zeitaufwendig ist, begrenzt die breite Anwendung dieser Technologie in anderen Labors. Ein handheld ACM, benannt Snap-Chip wurde entwickelt für cross-reactivity-frei und Spotter-freie multiplex-Sandwich Immunoassays13,14,15. Kabinen und tupft sind bereits gesichtet auf ein Assay und ein Transfer-Folie bzw. im Microarray-Format gespeichert. Während der Test die Folien abgerufen werden und ein Microarray tupft sind gemeinsam auf der Assay-Folie durch einfach fangen die beiden Chips zusammen übertragen. Ein Snap-Apparat ist für zuverlässige Reagenz Übertragung verwendet. Nitrozellulose, beschichtete Folien mit einer relativ hohen Antikörper-Bindungskapazität als der Assay-Folien verwendet wurden, um die Flüssigkeitströpfchen absorbieren und somit Reagenz Transfer erleichtert, die Folien sind jedoch teurer als normales Glas Folien und microarray Scannern kompatibel mit nicht-transparenten Folien sind für die Signalerfassung notwendig.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Durchführung einer Multiplex-Sandwich-Immunoassay mit einem Snap-Chip. Für bequeme und sichere Reagenz Übertragung von Microarray-Microarray wurde eine neuartige Snap-Apparat entwickelt. Wichtig ist, haben wir hier die Übertragungsmethode Reagenz auf regelmäßiges Glas-Objektträger mit dem Snap-Chip etabliert. 1024 Punkte wurden erfolgreich übertragen und auf einen Objektträger, erheblich erweitern den Einsatz dieser Technologie in den meisten Labors ausgerichtet.
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Protocol
1. Herstellung und Lagerung von snap Chips
- einzelne Übertragungsmethode ( Abbildung 1a)
- Spot Kabine Lösungen enthält 400 µg/mL Antikörper und 20 % Glycerin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf eine Nitrocellulose (oder einem funktionalisierten Glas) Assay-Folie mit einem Inkjet-Microarray Spotter 13 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (1.2 nL für jeden Fleck) mit 800 µm-Mitte-zu-Mitte-Abstand. Sicherstellen, dass die Folie auf die Spotter-Deck nach einer Ecke fest (hier links unten verwendet wurde).
- Die gefleckte Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren.
- Klemmen eine Folie Modul Dichtung mit 16 Fächern auf der Assay-Folie in 16 Vertiefungen unterteilen. Spülen Sie die Folie dreimal durch Zugabe von 80 µL PBS mit 0,1 % Tween-20 (PBST) in jeweils gut und schütteln bei 450 u/min auf einen Shaker, 5 min jedes Mal.
- Hinzufügen 80 µL blockiert Lösungen für jedes gut und schütteln für 1 h bei 450 u/min.
- Entfernen Sie die Dichtung und die Assay-Folie mit einem Strom von Stickstoff trocknen.
- Fix eine Transfer-Folie auf dem Spotter-Deck und drücken die unteren linken Ecke der Folie gegen links unten auf dem Spotter-Deck. Inkjet vor Ort eine Reihe von Ausrichtungsmarken (eine Lösung von Polystyrol-Mikro-Kügelchen) mit dem gleichen Layout wie die für die Fahrerhäuser.
- Lassen die Ausrichtungsmarken trocknen. Drehen Sie die Transfer-Folie und setzen Sie ihn wieder auf die Spotter-Deck, Befestigung gegen die untere linke Ecke.
- Bereiten die dAb Schmierblutungen Lösungen mit 20 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA.
- Mit dem Spotter ' s Kamera, nehmen Sie ein Bild einer Ausrichtung-Marke. Setzen Sie dieses Bild in das spotting Programm als eine so und bekommen Sie das Bildsystem für die Anerkennung von Inkjet-Spotter, die am obere linken Marke zu identifizieren. Verwenden Sie die Koordinate als den ersten Platz des dAb-Arrays. Platz 8 nL pro Tröpfchen mit einem Abstand von Mitte zu Mitte von 800 µm.
- Double Übertragungsmethode ( Abbildung 1 b)
- eine Transfer-Folie 1 auf dem Inkjet-Spotter-Deck gegen die untere linke Ecke zu platzieren. Vor Ort Taxis Lösungen mit 400 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer auf der Folie mit einem Inkjet-Microarray-Spotter bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (0,4 nL für jeden Fleck und ~ 200 µm im Durchmesser). Der Abstand von Mitte zu Mitte beträgt 400 µm.
- Snap der Transfer Folie mit einem Nitrozellulose beschichtet (oder einer funktionalisierten Glas) Assay Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die Kabine Tröpfchen auf der Assay-Folie übertragen.
- Wende alle sechs Tasten auf der Seite der Snap-Apparat um 90 Grad zu ziehen und die Kolben in der geöffneten Position verriegeln. Einfügen Sie die Transfer-Folie in den Diahalter in die Buchse mit der abgeschnittenen Ecke mit Blick auf die feste Pogo pin Schalten Sie den ersten Satz von drei Tasten lassen Sie die Kolben mit der goldenen Pogo Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.
- Fügen Sie eine Nitrozellulose-beschichtete Folie in der Snap Apparat Upside-Down-auf die 4 Pogo Pins sitzen. Biegen Sie die zweite Gruppe von drei Tasten loslassen Kolben mit dem Silber-Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.
- Das Snap-Gerät schließen, indem man die Oberschale auf den Diahalter mit der Ausrichtung Säulen und Löcher für eine präzise Positionierung.
- Legen Sie den geschlossenen Snap-Apparat in seinem Käfig und die Registerkarte "Schließung" vollständig nach unten drücken um die Microarrays von Angesicht zu Angesicht beim Anwenden der entsprechenden Drucks zu bringen. Für 1 Minute geschlossen halten,
- Die Folien zu trennen. Die Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren. Waschen, blockieren und trocknen die Assay-Folie wie 1.1.3 - 1.1.5 beschrieben.
- Legen Sie einen anderen Transfer Folie auf dem Inkjet-Spotter Deck und drücken gegen die untere linke Ecke. Vor Ort dAb Lösungen mit 50 oder 100 µg/mL von Antikörpern (siehe Tabelle 1), 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer. Sicherzustellen, dass jeder einzelne Strahler 0,8 ist nL und der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Spots beträgt 400 µm.
- Speichern der Assay und der Transfer-Folie. Versiegeln-Assay und Transfer Folien in einem luftdichten Beutel mit Trockenmittel und legte in einem Gefrierschrank-20 ° C.
2. Gemultiplext Immunoassays mit Snap-Chips
- Abrufen der Assay-Folie aus dem Gefrierfach. Lassen Sie den Beutel versiegelt für 30 min, bis die Folie auf Raumtemperatur kommt.
- Prepare 7-Punkt seriell verdünnt Beispiellösungen von Spick Proteine in PBS mit 0,05 % Tween-20.
Hinweis: Hier wird ein 5-fold Verdünnungsfaktor verwendet. Die ab Konzentrationen für jedes Protein sind in Tabelle 1 aufgeführt. - Vorbereiten Beispiellösungen je nach Bedarf. Z. B. Humanserum 4mal in PBST Puffer verdünnen.
- Eine 16-fach-Dichtung auf der Assay-Folie spannen.
- Füllen Sie eine Spalte von 8 Brunnen mit den 7 Proteinlösungen Verdünnung und eiweißfreie PBST Pufferlösung durch pipettieren. Pipette Beispiellösungen in die weiteren 8 Bohrungen auf derselben Folie.
Hinweis: 80 µL Lösungen passen Sie in jedem gut. Weitere Folien können verwendet werden, um bei Bedarf zusätzliche Proben messen. - Brüten die Proben auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min für 1 h bei Raumtemperatur oder für eine Nacht bei 4 ° c waschen der Folie dreimal mit PBST auf den Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie unter dem Strahl des Stickstoffgas.
- Abrufen die Transfer-Folie mit Tupfer aus der Tiefkühltruhe. Halten Sie den Beutel versiegelt für 30 min bei Raumtemperatur. Dann die Folie in einer geschlossenen Kammer (z.B. leere Tipps Box) mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 20 min für Rehydrierung inkubieren.
- Snap die Transfer-Folie mit der Assay-Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die dAb-Tröpfchen übertragen. Siehe Abschnitt 1.2.2 für den Betrieb des Geräts Snap.
- Trennen die Folien. Die Assay-Folie in einer geschlossenen Kammer mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 1 h. Klemme der Assay-Folie mit einer 16-fach Dichtung brüten und spülen Sie die Folie 4 Mal mit PBST auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal.
- Pipette 80 µL Lösungen mit 2,5 µg/mL Streptavidin Fluorophor in PBS in jede Vertiefung. 20 min auf einen Shaker bei 450 u/min inkubieren.
- Der Folie 3 Mal mit PBST und einmal mit destilliertem Wasser auf den Shaker mit 450 u/min spülen. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie mit Stickstoffgas.
3. Dia scannen und Datenanalyse
- die Assay-Folie mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner mit dem 635-nm-Laser scannen.
- Extrahieren die net Intensität von jedem Ort mit einer Analyse-Software (z.B. Array-Pro Analyzer) 16.
- Der Nachweisgrenze (LOD) jedes Proteins mit einer Statistiksoftware zu berechnen und die Proteinkonzentrationen in den Proben zu bestimmen.
Hinweis: Die Detailgenauigkeit ist definiert als der Y-Achsenabschnitt der Norm cuRVE erhöht durch drei Mal die Standardabweichung von drei unabhängigen Assays.
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Representative Results
Das Testverfahren für Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden ist in Abbildung 1dargestellt. In einzelnen zu übertragen die Kabinen sind direkt auf der Folie Assay gesichtet und die Farbtupfer auf der Assay-Folie bei Verwendung in einem Spiegel-Muster der Kabinen (Abbildung 1a) übertragen. Nur ein Übertragungsverfahren ist erforderlich, aber diese Methode leidet Fluchtungsfehler zwischen den zwei Microarrays, hauptsächlich bedingt durch die eckigen Versatz zwischen der Folie und der Inkjet-Gantry (Abbildung 2). Ein Ansatz, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, Kabinen und tupft nacheinander auf der Assay-Folie nach aufspüren und beheben die Folien in der Snap-Apparat richtig zu übertragen (Abbildung 1 b). Mit dieser Methode werden beide Microarrays in der exakt gleichen Position übertragen. Kein Bild Anerkennung System oder Ausrichtung Marker ist erforderlich für die doppelte Übertragungsmethode. Die Fehlausrichtung für 98 % der Flecken war innerhalb von 41 µm, 6-fold Verbesserung im Vergleich zu den einzelnen Transfer Methode14.
Der Snap-Apparat ist einfach zu bedienen, ohne Schulung und minimieren das Risiko von Array Fehlausrichtung konzipiert. Die Folien sind mit genaue Positionierung Dank Passstifte üblich, Assay und Transfer-Folien zusammengeführt. Die Transfer-Folie ist etwas kleiner, passen unterhalb der Assay-Folie, wenn durch die Pogo Pins, angehalten, bis das Snap-Gerät geschlossen wird. Ein Spacer ist enthalten auf der Transfer-Folie, die Aufrechterhaltung einer Mikrometer Größe Lücke, die es zuverlässige Tröpfchen-Übertragung auf dem Objektträger erlaubt. Schließlich sollen den Käfig und seine Schließung Registerkarte Druck für die wirksame Übertragung auf jede Snap für reproduzierbare, qualitativ hochwertige Übertragung benötigt. Ein Foto von der Snap-Apparat ist in Abbildung 3dargestellt.
Repräsentative Bilder illustrieren die Ergebnisse des Reagens auf eine Nitrozellulose-Folie und einem Objektträger übertragen sind in Abbildung 4dargestellt. Alexa 532 beschriftet IgGs dienten als das erste Reagenz und Alexa 647 beschriftet IgGs dienten als dem zweiten Reagenz. Nach der Übertragung wurde das Dia gescannt mit 532 nm und 635 nm Laser. Das Ergebnis zeigt, dass 3136 (für die Nitrozellulose-Folie) oder 1024 (für die Glas-Folie) Microspots mit Null Fehler auf der Assay-Objektträger übertragen wurden und keine Kreuzkontamination wurde nach der Übertragung der zweiten Reagens beobachtet. Bei der Verwendung von Glas-Objektträger ist es möglich, mehr hydrophobe Oberfläche durch Funktionalisierung, damit jeder Spot zu verkleinern und Verringerung den Punkt-zu-Punkt-Abstand für die Übertragung einer größeren Anzahl von Flecken zu schaffen. Diese Arbeit erweitert die Anwendung der Snap-Chip-Technologie für häufig verwendete Glassubstrate.
Standardkurven von einer 50-Plex Immunoassay targeting Brustkrebs verwandte Proteine in Abbildung 5, entspricht das größte Multiplex-Sandwich Antikörper Microarray bisher ohne Kreuzreaktivität dargestellt sind. Doppel-Transfer-Methode wurde in diesem Test verwendet, das Dia gescannt wurde, und der Fluoreszenzintensität wurde quantifiziert, um die standard Kurven zu erzeugen. 35 von 50 Proteine LODs bei Pg/mL erreicht (siehe Tabelle 1) und kann weiter verbessert werden, indem der Assay-Bedingungen zu optimieren. NS1 Reagenzien erleichtert die Verwendung von mehreren Antikörper-Paare auf einer einzelnen Folie ohne Kreuzreaktivität und ermöglicht die Optimierung jedes Paares unabhängig mit keine Störungen auf andere Paare12. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Snap-Chip ist eine skalierbare Technologie für Multiplex Protein Quantifizierung verwendet werden können.
Abbildung 1: Schaltplan der Testverfahren Vergleich Single (a) und (b) doppelte Transfermethoden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schaltplan zeigt Unterschiede zwischen Einzel - und Doppel-Transfer. (a) Spiegelung der Übertragung Reagenzien verstärkt die eckigen Versatz zwischen der Folie und der Inkjet-Kreuztisch. (b) Doppel-Transfer-Methode überwindet die eckigen Versatz. Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Foto von der Snap-Apparat. (a) geöffneten Gerät. (b) geschlossenen Gerät. (c) perspektivische Ansicht des Gerätes. Kurz, übertragen (i) Dias in den Diahalter positioniert und drückte gegen Passstifte mit der Pogopin auf Kolben montiert. (Ii) die Assay-Folien sind auf der Pogopins platziert und drückte gegen die Passstifte mit einem zweiten Satz von Kolben. (Iii) die Oberschale ist auf den Diahalter positioniert und eingefügt in den Käfig. Ein Druck ist mithilfe der Registerkarte "Schließung" zu komprimieren, die Pogopin und die Folien zusammenzubringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Kollektive Übertragung von Flecken mit einem Snap-Chip. Fluoreszenz-Scan mit 532 nm und 633 nm Laser, Übertragung von Antikörpern auf ein (a) Nitrozellulose demonstrieren Folie (adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis) und (b) Glas schieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Fluoreszenzbild ein Assay-Folie und Standardkurven 50 Proteine gemessen parallel mit doppelten Übertragungsmethode. (a) Fluoreszenzbild ein Assay-Folie für die Generierung einer Standardkurve. (b) Nahaufnahme eines Arrays. Maßstabsleiste = 2 mm. (c) Standard-Kurven für 50 Proteine. Fehlerindikatoren wurden als Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten berechnet. Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Proteinnamen | Start-Konzentration (ng/ml) | LOD (Pg/ml) | Proteinnamen | Start-Konzentration (ng/ml) | LOD (Pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1.3 × 104 | IL-6b | 1 | 2.1 × 102 |
Tabelle 1. Proteinkonzentrationen und LODs in Puffer aus den 50-Plex-Assay. Die Detailgenauigkeit für CA 15-3 ist in U/ml (*). Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis.
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir eine Snap-Chip-Technologie vorgestellt, die cross-reactivity-freie Multiplex-Immunoassays für die Forscher mit einfachen Versuchsaufbau weithin verfügbar macht. Anders als bei bestehenden AntikörperMicroarrays, benötigt keine Microarray-Spotter für Endnutzer. Sowohl Einzel-als auch Doppelzimmer Transfermethoden demonstriert, und doppelte Übertragung bietet überlegene Ausrichtung Genauigkeit bis zu ~ 40 μm bei 98 % Flecken, mit die größten Fehlausrichtung von 63 µm14. Eine neuartige Snap-Apparat wurde entwickelt, um bequem rasten die beiden Folien mit gleichbleibenden Druck, dass diese Technologie für Forscher zugänglich. Zuverlässige Reagenz Transfer ist nicht nur auf Nitrozellulose-beschichteten Folien, sondern auch auf regelmäßige Glas-Objektträger, erkannte deutlich erweitern die Anwendung dieser Technologie ohne die Notwendigkeit von Schulungen. Um die Nutzbarkeit des Snap-Chips zu demonstrieren, wurde ein 50-Plex-Immunoassay mit Pre-gefleckte und gespeicherte Dias durchgeführt, und 70 % der Proteine LODs in den Bereich des Pg/mL14erreicht. Im Vergleich zu bestehenden Multiplex-Immunoassays, die Pinselstriche als Mischung gelten, ist ein wichtiger Vorteil der ACM und der Snap-Chip-Technologie, dass die Assays auf einem Chip unabhängig zueinander, wodurch zum Hinzufügen oder Entfernen einer Antikörper-Paare ohne alle anderen Paare stören. Dutzende bis Hunderte von Proteinen können gleichzeitig gemessen werden, mit einem Snap-Chip, dadurch Verkürzung Assay im Vergleich zu anderen Methoden wie die automatisierte serielle Messung durch sequentielle Inkubation die seriellen Anwendung jedes Antikörpers 17erfordert. Für die Snap Chip Herstellung, so dass es wirtschaftlicher als herkömmliche Immunoassays ist nur Sub-Nanoliter jeder Antikörper erforderlich.
Die Antikörper-Konzentrationen verwendet und die Antigen-Inkubation-Schritte sind entscheidend für hohen Assay Empfindlichkeit zu erreichen. Bei der Herstellung der Snap-Chips kann Antikörperkonzentration abhängig von der Affinität der Antikörper-Paare und die Art der Assay-Folien (Nitrozellulose oder nicht-Nitrozellulose) optimiert werden. Die Mengen an jeder Antikörper-Spot lässt sich anhand der Spotter Kapazität und Ausrichtung Genauigkeit und der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Spots kann entsprechend geändert werden. Nach der Übertragung von Kabinen auf der Assay-Folie, inkubiert wir die Assay-Folie bei Raumtemperatur für 1 h über Nacht Inkubation bei 4 ° C besser Antikörper-Bindungskapazität geben könnte. BSA-kostenlose Stabilisator-Lösungen (siehe die Tabelle der Materialien) hier dienten die Assay-Folie nach Inkubation Kabinen blockieren. Andere blockierenden Reagenzien wie tierische Seren oder Milch können auch für diese Anwendung arbeiten.
In Multiplex Immunoassays können Protokolle für nicht-Nitrozellulose Folien mit verschiedenen Oberflächenchemie entwickelt und optimiert werden. Ein anderes Verdünnungsfaktor lässt sich Standardkurven abhängig von der Zielproteine zu machen. Verschiedenen Fluorophore einsetzbar, tupft zu kennzeichnen, und das Dia gescannt werden kann mit Hilfe eines Lasers auf einer anderen Wellenlänge für Signal-Sammlung.
Derzeit hat eine Dichte von 625 Punkte/cm2 mit Doppel-Transfer-Methode14erreicht. Zur weiteren Verbesserung der multiplexing Fähigkeit des Snap-Chips gibt es mehrere Strategien. Erstens können kleinere Mengen verwendet werden, die Größe der Flecken, wodurch kürzere Mitte-Mitte-Abstand zwischen Spots und erhöhte Array Dichte zu reduzieren. Zweitens können eine Transfer-Folie mit mehr hydrophobe Oberfläche, die Punktgröße zu reduzieren. Drittens könnte bessere Abstimmung zwischen den beiden Microarrays durch Feinjustierung der Inkjet-Spotter, und weitere Optimierung der spotting Parameter wie der Abstand zwischen Düsen und die Folie Oberfläche erreicht werden.
Wie für alle Antikörper-basierten Immunoassays ist die Leistung der Snap-Chip-Immunoassay vorbehaltlich der Verfügbarkeit und Qualität von Antikörpern. Die Snap-Chip arbeitet mit einem Sandwich Assay Format, das die am häufigsten verwendeten Assay-Format im ELISA durch die hohe Sensitivität und Spezifität gewährten die dual, sequentielle Bindung eines Paares von Antikörper gezielt verschiedene Epitope ist aber es ist abhängig von die Verfügbarkeit eines Paares von kompatibel zur Erfassung und Erkennung des Zielproteins benötigten Antikörper.
Der Wert des Snap-Chip-Technologie ist für Immunoassays etabliert, und es wird erwartet, dass sie für alle chemischen und biochemischen Reaktionen kann, die erfordern genutzt werden, Anwendung von verschiedenen Reagenzien ohne Kreuz-Kontaminationen18,19 , 20 , 21 , 22. eigentlich die Snap-Chip bietet eine allgemeine Lösung für verschiedene Pre-gefleckte Reagenzien von Microarray, Microarray, so distanzieren die Chip-Herstellung mit dem Assay-Verfahren liefern und daher hilft Adressierung der " Makro-Mikro"Interfacing Herausforderung23. Als ein Beispiel wurde der Snap-Chip für einen 4-Plex-homogene Enzym-Hemmung-Assay zur 128 Bedingungen mit präzisem Timing und vergleichbare Ergebnisse zu großvolumigen Experimente14zu analysieren. Es wurde auch für Multiplex Gewebe Färbung angewendet. Darüber hinaus kann es zur Drogen-screening-Anwendungen, Tausenden von Chemikalien auf verschiedene Bakterien oder Zellen, für die einzelne Zelle Analyse21,24, zu testen oder zu verschiedenen Testbedingungen in ein- oder mehrstufigen chemischen beitragen. Reaktionen.
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Disclosures
McGill Universität hat einige Aspekte dieser Arbeit mit Huiyan Li und David Juncker als Erfinder eine Patentanmeldung eingereicht.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Rob Sladek für die Verwendung von Inkjet-Spotter. Wir anerkennen die letzte Unterstützung der kanadischen Institute für Gesundheit Forschung (CIHR), die Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC), die kanadische Krebs Gesellschaft Research Institute und Canada Foundation für Innovation (CFI). D.J. Dank Unterstützung von einem Canada Research Chair.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P.
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
