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Bioengineering

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ チップは、クロス汚染せず異なる試薬の共存に注目を必要とする任意の生化学的な反作用に使用できます。

Abstract

多重蛋白質の分析は優れた診断感度と単一蛋白質と比較して精度を示しています。抗体のマイクロ アレイ マイクロ スケール イムノアッセイ単一チップ上で同時に実行の数千人を可能にします。サンドイッチ試金形式 2 抗体各ターゲットを検出することによりアッセイの特異性を向上させるが、したがって、多重化機能、制限試薬の交差反応性に苦しんでいます。抗体マイクロ アレイの共存 (ACM) 多重化タンパク質の架橋反応性無料検出用に開発されたアッセイ中マイクロ アレイ作製のため、高価なスポッター敷地内が必要です。この作品で一緒に、こうして偵察する必要はありませんサンプルの培養と検出抗体 (指紋) に後続のアプリケーションの間に単にスナップ 2 つのチップによってマイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を転送スナップ チップ技術を紹介します。試金の実行からのスライドの準備を解離斑点を付けられた前のスライドのストレージ。2 つのマイクロ アレイ間の正確な配置を達成するために両方のシングルとダブルの転送方法と両方の方法のスライド作製を説明しました。結果を示す < 40 μ m の位置合わせは、二重譲渡、625 スポット/cm2の配列密度に到達を達成されています。多重化されたタンパク質解析のスナップ チップの使いやすさを実証する 50 plexed 免疫測定法を実施しています。35 蛋白質の検出限界は、範囲の pg/mL にあります。

Introduction

高い感度と特異度癌1,2のような複雑な疾患の診断における単一マーカーよりも複数のタンパク質を含むバイオ マーカーのパネルがあります。酵素結合抗体法 (ELISA) はゴールド スタンダード技術を臨床研究所プラズマにおける低 pg/ml 検出限界がアッセイ3,4,5あたり 1 つのターゲットに制限を達成するために使用されています。抗体のマイクロ アレイは、単一顕微鏡スライド6,7、8に並行して実施小型の試金の何千もの収容のために開発されています。ただし、このメソッドの多重化機能は、指紋の混合物のアプリケーションから生じる試薬駆動の交差反応によって制限されます、それはターゲット9,10数の増加により問題となります。,11. Plaら。多重サンドイッチ試金の結果として脆弱性スケール N は目標12の番号 4N(N-1) として表明しています。

抗体のマイクロ アレイ、抗体の共存のマイクロ アレイでの交差反応性を軽減するために (ACM) 多重サンドイッチ試金12の私たちの研究室で開発しました。キャプチャー抗体 (タクシー) はマイクロ アレイのスポッターと基板上斑点を付けられます。ブロック サンプルが表面に適用され、cAb 抗原複合体と同じスポットに個々 の指紋を発見し。抗体と抗原との間のすべての交差反応性シナリオことができます ACM、軽減して pg/ml 検出限界が達成されています。ただし、試金のプロトコルは高価で時間のかかる配置目的のため精度の高い敷地内マイクロ アレイ スポッターを使用して、この技術の広い適用を制限する実験中に、指紋をスポッティングの準備と必要になりますその他の研究所。スナップ チップの名前、ハンドヘルド ACM は架橋反応性自由のために開発されている、サンドイッチ免疫測定13,14,15を多重化スポッター無料します。タクシーや指紋は事前の試金スライドとマイクロ アレイ フォーマットのそれぞれ転送スライドに斑点を付けるし、格納されています。アッセイ中にスライドを取得、指紋のマイクロ アレイは単に 2 つのチップを一緒に撮ってアッセイのスライドにまとめてに転送されます。スナップの装置は、信頼性の高い試薬転送に使用されます。比較的大きな抗体結合能を持つニトロセルロース コーティング スライドは、液体の液滴を吸収するアッセイ スライドとして使用されている、ため、試薬譲渡が容易、しかし、スライドがより規則的なガラスのスライドとマイクロ アレイよりも高価です非透明スライドと互換性のあるスキャナー信号集録が必要です。

この作品は、スナップ チップを搭載した多重サンドイッチ免疫測定法を実行するプロトコルを示す.新しいスナップイン装置マイクロ アレイ-マイクロ アレイからより便利で信頼性の高い試薬譲渡しました。重要なは、ここでスナップ チップと通常のガラス スライド上に試薬転送法を確立しました。1024 点は正常に移され、ほとんどの実験室でこの技術の使用を大幅に広げてスライド ガラス上に配置されます。

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Protocol

1 作製との貯蔵スナップ チップ

  1. シングル転送メソッド ( 図 1 a)
    1. 400 μ g/mL の抗体を含むスポット cAb 溶液とリン酸緩衝生理食塩水で 20% グリセロール。(PBS)、ニトロセルロース (または機能性ガラス) に 60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッター 13 試金スライド (1.2 各スポットに nL) 800 μ m センター - 間隔。スライドは 1 つのコーナーによるとスポッター デッキの固定を確認してください (ここでは、左下隅を使用).
    2. 相対湿度 60% で 1 時間室温で斑点を付けられたアッセイ スライドをインキュベートします
      3. 。
    3. クランプ 16 井戸に分割するアッセイ スライド 16 区画を持つスライド モジュール ガスケットです。0.1% を含む PBS の 80 μ L を追加することによって、スライドを 3 回リンスそれぞれも、シェーカー、5 分毎回で 450 回転で振動にトゥイーン 20 (pbst;).
    4. もそれぞれ、450 rpm で 1 h に振る解決を妨げるを追加 80 μ L.
    5. ガスケットを外し、乾燥窒素の流れとアッセイ スライドです
      6. 。
    6. はスポッター デッキで転送スライドを修正し、スポッター デッキの左下隅にスライドの左下隅をプッシュします。インク ジェット スポットは、タクシーと同じレイアウトで配置マーク (ポリスチレン ビーズのソリューション) の配列です
      7. 。
    7. は、乾燥アライメント マークをしましょう。転送スライドを反転し、左下隅に対して修正スポッター デッキの上に戻す
      8. 。
    8. DAb 溶液 20 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロールおよび 1 %bsa をスポッティングを準備します
      9. 。
    9. 、スポッターを使用して ' s カメラ、位置合わせマークの写真を取る。基準としてスポッティングのプログラムにこの写真を実装し、最も一番上の左のマークを識別するためにインク ジェット偵察の画像認識システムを取得します。軽打の配列の最初のスポットとしてその座標を使用します。スポット 8 nL あたり 800 μ m の間隔でセンターに液滴
      10. 。
  2. ダブル転送方式 ( 図 1 b)
    1. 左下隅に対してインク ジェット偵察デッキに転送スライド 1 を配置。60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッターとスライドに 400 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むタクシー溶液をスポット (0.4 各スポットに nL と 〜 200 μ m)。センターへの間隔は 400 μ m.
    2. はスナップ スナップ装置 ( 図 2) を使用して試金スライド上に cAb 滴を転送する転送被覆硝酸セルロース (または機能性ガラス) を使用してスライドの試金スライドです。 90 度開いた位置ですべてのプランジャーをロックを取り出してスナップ装置側
      1. ターンすべての六つのボタン。そのコンセントでスライド ホルダーにクリップの角を固定ポゴピンを直面している転送スライドを挿入します。黄金ポゴピンでプランジャーをリリース スライドの位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの最初のセットを有効にします
        2. 。
      2. は、4 ポゴピンの座っているスナップイン装置逆さまに硝酸セルロース コーティング スライドを挿入します。銀のピンでプランジャーをリリースし、スライドが位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの 2 番目のセットを有効にします
        3. 。
      3. スライド ホルダーを配置柱や穴を使用して正確な位置決めのためにトップのシェルを置くことによってスナップ装置を閉じます
        4. 。
      4. そのケージに閉じられたスナップイン装置を挿入し、マイクロ アレイの適切な圧力を適用している間対面させる完全に閉鎖タブを押します。1 分の閉じた状態に保つ
    3. スライドを分離します。アッセイ スライド 60% の相対湿度で 1 時間室温で孵化させなさい。洗ってブロック、およびアッセイ スライドを乾燥で手順に従って 1.1.3 - 1.1.5
      4. 。
    4. はインク ジェット偵察デッキと左下隅にプッシュ転送の別のスライドを配置します。50 または 100 μ g/mL の抗体 (表 1 参照)、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むスポット dAb 溶液。確実に 0.8 各スポット nL とセンターのセンター スポット間隔は 400 μ m.
    5. は、アッセイおよび転送スライドを格納します。乾燥剤を含む密閉袋にアッセイと転送の両方のスライドを密封し、-20 ° C のフリーザーに置く
      6. 。

2。スナップ チップを用いた免疫を多重

  1. 冷凍庫からアッセイ スライドを取得します。スライドに部屋の温度になるまで 30 分間密封袋のままにします
    2. 。
  2. 準備 7 点シリアル 0.05% を含む PBS でタンパク質を打ちつけることによって試料溶液を希釈したトゥイーン 20
    。 注: ここでは、割増の希釈係数が使用されます。蛋白質ごとの開始濃度が表 1 に記載されています
    3. 。
  3. 適切なサンプル ソリューションを準備します。たとえば、4 回 PBST バッファーでひと血清を希釈します
    4. 。
  4. 試金スライド 16 コンパートメント ケットをクランプします
    5. 。
  5. は、ピペッティングして 7 タンパク質の希釈溶液とタンパク質無料 pbst; 緩衝液 8 井戸の 1 つの列を入力します。同じスライド上の他の 8 の井戸の試料溶液をピペットします
    。 注: 80 μ L ソリューションはそれぞれに合うことができるも。さらにスライドを使用して、必要に応じて追加のサンプルを測定できます
    6. 。
  6. は、室温で 1 時間、または一晩 3 回で 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; 4 ° C 洗うスライドで 450 rpm でシェーカーでサンプルをインキュベートします。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスの流れの下でスライドです
    7. 。
  7. は、冷凍庫から指紋と転送スライドを取得します。室温で 30 分間密封された袋をしてください。その後、水分補給のために 20 分間 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉容器 (例えば 空ヒント ボックス) のスライドをインキュベートします
    8. 。
  8. は、アッセイのスライドがスナップ装置 ( 図 2) を使用して軽く水滴を転送する転送スライドをスナップします。セクション 1.2.2 スナップ装置の操作を参照してください
    9. 。
  9. は、スライドを区切ります。1 h. クランプ 16 コンパートメント ケットとアッセイ スライド用 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉室内で試金スライドをインキュベートし、4 回スライドをすすいでください 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; を使用しています
    10. 。
  10. 溶液を各ウェルに PBS で 2.5 μ g/mL ストレプトアビジン fluorophore のピペット 80 μ L。450 rpm でシェーカーで 20 分間インキュベートします
    11. 。
  11. は、450 rpm でシェーカーの PBST で 3 回スライドと蒸留水をすすいでください。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスを用いたスライドです
    12. 。

3。スキャンとデータ分析をスライド

  1. 635 nm レーザーを用いた蛍光マイクロ アレイ スキャナーでアッセイ スライドをスキャンします
    2. 。
  2. 解析ソフトウェア (例えば配列 pro アナライザー) 16 を使用して各スポットのネットの強度を抽出します
    3. 。
  3. 統計解析ソフトウェアを使用して各蛋白質の検出 (LOD) の制限を計算して試料中のタンパク質の濃度を決定します
    。 注: LOD は銅の標準の Y 切片の値として定義されています。3 つの独立した測定の標準偏差を 3 回ずつ rve
    4. 。

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Representative Results

両方のシングルとダブルの転送方法の試金プロシージャは図 1に示します。単一の転送でアッセイ スライドに直接タクシーを発見され、指紋は、タクシー (図 1 a) のミラー パターンで使用時に試金のスライドに転送されます。1 つだけ転送手順が必要ですがズレ、スライドとインク ジェット ガントリー (図 2) との間の角度のミスアラインメントによって主に引き起こされる 2 つのマイクロ アレイ、苦しんでいるこのメソッド。この課題に取り組む方法の 1 つ、スポッティング スコープと適切にスナップイン装置でスライドを修正後タクシーとアッセイ スライドの順に指紋を転送することです (図 1 b)。このメソッドを使用して、両方のマイクロ アレイは、正確に同じ位置に転送されます。画像認識システムまたはアライメント マーカーは二重譲渡方法の必要ありません。スポットの 98% のずれは、単一の転送方法14に比較して 6 の改善 41 μ m 以内だった。

スナップの装置は、トレーニングなしに使いやすくて、配列ズレのリスクを最小限に抑えるために設計されています。スライドは、アッセイと転送の両方のスライドに共通の位置合わせピンのおかげで正確な位置決め一緒に持っています。転送スライドはアッセイ スライド スナップ装置が閉じられるまで、ポゴピンによって中断されたときの下に収まる小さめです。スペーサーは、スライド ガラスに信頼性の高い液滴の転送を許可するミクロン サイズのギャップを維持する転送スライドに含まれています。最後に、ケージとその閉鎖] タブは、再現性の高い、高品質の転送のすべてのスナップで効果的な転送のために必要な圧力を適用する設計されています。スナップの装置の写真を図 3に示します。

ニトロセルロース スライドとスライド ガラスに試薬移転の結果を示す代表的なイメージは図 4のとおりです。最初の試薬として Alexa 532 Igg をラベルを用い、Alexa 647 Igg というラベルの付いた 2 番目の試薬として使われていた。532 でスキャンしたスライド転送後 nm ・ 635 nm レーザー。結果を示す (のニトロセルロース スライド) 3136 または 1024 (スライド ガラス) のマイクロ スポットは、アッセイのスライドにゼロの失敗で転送された、2 番目の試薬を転送する時に交差汚染は認められなかった。スライド ガラスを使用している場合、機能化、したがって各スポットのサイズを削減し、スポットの大きい数を転送するためのスポットを距離を短くより疎水性の表面を作成することが可能です。この作業は、一般的に使用されるガラス基板にスナップ チップ技術のアプリケーションを展開します。

50 プレックス免疫ターゲット乳癌の標準的な曲線関連蛋白質がに示す図 5、交差反応性なしの日付に最も大きいマルチプレックス サンドイッチ抗体のマイクロ アレイに対応します。ダブル転送方式は、この試金で使用されたスライドをスキャンしても、標準曲線を生成するための蛍光強度の定量化を行った。35 のうち 50 タンパク質 pg/mL で Lod に達した (表 1 参照) し、アッセイ条件を最適化することでさらに改善される可能性があります。試薬の共存に注目は容易に交差することがなく 1 つのスライド上の複数の抗体ペアの使用と12の他のペアの干渉を受けずに独立して各ペアの最適化を実現できます。これらの結果は、そのスナップ チップが多重プロテインの定量に使用することができますスケーラブルな技術を示します。

Figure 1
図 1。シングル (a) と (b) 二重転送方法比較試金プロシージャのスケマティック。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2。シングルとダブル転送の間の違いを示す模式。(a) ミラーリング転送試薬のスライドとインク ジェットの XY ステージの角度変位を増幅させます。(b) 二重転送方法は、角度変位を克服します。権限を持つ参照14から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3。スナップ装置の写真。(a) 開かれているデバイス。(b) 閉じられたデバイス。(c) デバイスの斜視。簡単に、(i) 転送してスライド スライド ホルダーに配置やプランジャーにマウントされている製品を使用して位置合わせピンに対してプッシュします。(ii) アッセイのスライドは、pogopins の上に配置、プランジャーの 2 番目のセットを使用して位置合わせピンに対してプッシュします。(iii) トップのシェルはスライド ホルダーの上部に配置、ケージに挿入されます。圧力が、製品を圧縮して一緒にスライドする閉鎖] タブを使用して適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4。スポット スナップ チップを使用しての集団移転。532 を使用して蛍光スキャン nm と (a) のニトロセルロースに抗体を示す 633 nm レーザー (許可を得て参照14から適応) のスライドとスライド ガラス (b)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5。ダブル転送方法を使用して並列に蛍光アッセイのスライドの画像と 50 蛋白質の標準曲線測定します。(標準的な曲線を生成するためのアッセイ スライドの a) 蛍光イメージ。(b) 配列のクローズ アップ。スケール バー 50 タンパク質の 2 ミリメートル。 (c) 標準曲線を =。誤差範囲は、3 つの独立した実験から標準偏差として計算されました。権限を持つ参照14から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

タンパク質名 開始濃度 (ng/ml) LOD (pg/ml) タンパク質名 開始濃度 (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1.0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1.5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 ミグ 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/である MIP-1 50 3.3 EGF 50 1.8 × 102 CCL4/MIP Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP 3 500 1.0 × 102 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1.0 × 103 MMP 9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM 1 500 1.7 × 103 GRO Α 50 3.0 × 102 Β NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3.5 × 103 NT 3 200 5.8 × 102 PDGF BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1 Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 Il-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL 15 50 8.2 × 102 TNF Α 50 4.4 IL 12 1 30 TNF 里 50 1.3 × 102 IL 11 500 1.2 × 103 TNF RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2.8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6、 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

表 1.タンパク質濃度と 50 プレックス アッセイからバッファーに Lod。CA 15-3 の LOD は、U/ml (*) です。権限を持つ参照14から適応。

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Discussion

この作品は、私たちは基本的な実験のセットアップを持つ研究者の多重相互反応性無料イムノアッセイは広く利用可能、スナップ チップ技術を発表しました。既存の抗体のマイクロ アレイとは異なり、マイクロ アレイ スポッターは不要エンドユーザーです。、両方のシングルとダブルの転送方法をデモンストレーションし、二重譲渡提供に優れたアライメント精度 〜 98% スポット、63 μ m14の最大のずれを 40 μ m。新しいスナップイン装置は便利なこの技術を研究者にアクセスできるように、一貫した圧力で 2 つのスライドに合わせて開発されました。信頼性の高い試薬転送を実現硝酸セルロース コーティング スライドのみならず、通常のガラス スライドにも広範なトレーニングを必要とせずこの技術の応用を大幅拡大します。スナップ チップの有用性を示すためには、50-プレックス イムノアッセイを行った事前斑点、ストアドのスライドを使用してと蛋白質の 70% の範囲の pg/mL14で Lod を達成しました。混合物として指紋を適用する既存の多重イムノアッセイと比べ、ACM とスナップ チップ技術の重要な利点はチップ試金は、追加またはなし抗体ペアを削除できるように、お互いに独立していること他のペアを妨げています。蛋白質の数百数十は、各抗体17のシリアル ・ アプリケーションを必要とする連続培養による自動連続測定などの他の方法と比べて測定時間を短縮、スナップ チップで同時に測定できます。各抗体のナノリットルのサブのみは、従来免疫よりも経済それにスナップ チップ作製に必要です。

使用抗体濃度および抗原潜伏ステップ高い測定感度を達成するために重要です。スナップ チップの製造において、親和性抗体ペアとアッセイ スライド (硝酸セルロースまたは非ニトロセルロース) の種類に応じて抗体濃度を最適化できます。各抗体スポットのボリュームは偵察能力とアライメント精度に基づいて調整することができ、センターのセンター スポット間隔をそれに応じて変更することができます。4 ° C で 1 時間一晩インキュベートはより良い抗体結合能を与える可能性がありますのアッセイのスライドにタクシーを転送した後は、室温でアッセイ スライドを培養しました。BSA 無料スタビライザー ソリューションは、タクシーをインキュベート後アッセイ スライドをブロックするここで使用された (資料の表を参照)。動物の血清やミルクなど他のブロッキング試薬は、このアプリケーションのまた働くかもしれません。

多重イムノアッセイ異なる界面化学とニトロセルロース非スライドのプロトコルを開発し、最適化することができます。異なる希釈倍率は、ターゲット蛋白質によって標準曲線を作成する使用できます。異なった fluorophores が付いては、指紋をラベルに使用することができ、信号のコレクションの異なる波長のレーザーを用いたスライドをスキャンすることができます。

現在、二重譲渡法14625 スポット/cm2の密度を実現しています。スナップ チップの多重化機能をさらに向上させるため、いくつかの方法があります。まず、スポットと増加の配列密度の中心に距離が短いので、スポット サイズを小さく小さいボリュームを使用できます。第二より疎水性表面スポット サイズを小さくと転送スライドを選択できます。第三に、2 つのマイクロ アレイとの間の適切な連携をインク ジェット偵察の微調整を実行して、ノズルとすべり面の間の距離などスポッティング パラメーターをさらに最適化によって達成される可能性があります。

すべての抗体を用いたイムノアッセイはスナップ チップ イムノアッセイのパフォーマンスは、空き状況により、抗体の品質です。スナップ チップは、高い感度と特異性抗体が異なるエピトープをターゲットのペアのデュアル、シーケンシャルのバインディングによって与えられるため elisa 法で最も広く使用されている試験形式は、サンドイッチ試金の形式を使用して動作しますが、それは依存キャプチャと標的タンパク質の検出に必要な互換性のある抗体のペアの可用性。

免疫、スナップ チップ技術の価値が確立され、それはダブルガス18,19せず異なる試薬を適用することを必要とする任意の化学および生化学反応の使用できるという期待,20,21,22します実際には、スナップ チップのマイクロ アレイにマイクロ、従って関連付けを解除する試金プロシージャとチップの製造から各種の事前発見試薬を提供する一般的なソリューションを提供しますとアドレス、、」。マクロ ・ ミクロ」インタ フェースに挑戦23を。たとえば、スナップ チップは 128 の条件、正確なタイミングと大量実験14と同等の結果を分析する 4 プレックス均質酵素阻害試金のため使用されています。それは、多重組織染色にも適用されています。さらに、薬剤のスクリーニングの何千もの異なる細菌または単一細胞分析21,24日のための細胞に化学物質をテストするまたは単一または多段階の化学のさまざまな条件をテストするアプリケーションに貢献できます。反応。

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Disclosures

マギル大学は、Huiyan 李とデビッド ユンカーとこの仕事のいくつかの側面に発明者として特許出願を提出は。

Acknowledgments

インク ジェット偵察の使用ありがとう博士ロブ スラデック。我々 は最終的なカナダの機関からのサポート健康研究 (機構)、自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル)、カナダの癌協会の研究・ カナダ基礎技術革新 (CFI) を認めます。D. j. のおかげでは、カナダの研究の椅子からサポートします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

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References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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