Summary
Wir beschreiben eine Methode für die hierbei geführte Lage, Belichtung und Abtragung des auditorischen Kortex bei Ratten. Die Lokalisierung der Ablation wird anhand eine Koordinate Karte Obduktion.
Abstract
Die Ratte auditorischen Kortex (AC) wird immer beliebter unter auditiven Neurowissenschaften Ermittler, die Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmungs-Prozesse und kortikale Kontrolle über Sound-Bearbeitung in den subkortikalen auditiven Kernen interessiert sind. Bewältigung neuer Herausforderungen, ein Verfahren, um genau zu lokalisieren und chirurgisch Expose auditorischen Kortex würde dieser Forschungsanstrengungen zu beschleunigen. Stereotaktische Neurochirurgie wird routinemäßig in der präklinischen Forschung im Tiermodell verwendet, um weiterhin eine Nadel oder Elektrode an einer vordefinierten Position im auditorischen Kortex. In das folgende Protokoll verwenden wir stereotaktische Methoden auf neuartige Weise. Wir identifizieren vier Koordinatenpunkte über die Oberfläche des Temporal bone der Ratte ein Fenster definieren, die nach dem Öffnen genau sowohl die primäre (A1 macht) und sekundäre (Dorsal und Ventral) Cortex des AC mit dieser Methode, führen wir dann eine chirurgische Ablation der AC. Nachdem eine solche Manipulation durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. So beschreiben wir auch eine Methode zum Auffinden der AC Ablation Obduktion eine Koordinate Parkplan konstruiert durch die Cytoarchitectural Grenzen des AC auf der Oberfläche des Gehirns zu übertragen. Die Kombination aus Lage hierbei geführt und Ablation des AC bei der Lokalisierung der verletzte Bereich in eine Obduktion koordinieren Karte erleichtert die Überprüfung von Informationen, die vom Tier und führt zu einer besseren Analyse und Verständnis der Daten.
Introduction
Die Ratte ist eines der am häufigsten verwendeten tierischen Modelle in den auditiven Neurowissenschaften. Die Robustheit der sein Verhalten macht es für Hunderte von Studien pro Tag arbeiten. Seine Sensibilität und spektrale Schärfe für Anhörung1,2und der anatomischen und funktionellen Organisation des zentralen Systems, vergleichbar mit anderen Säugetieren3, machen der Ratte einen geeigneten Tiermodell für die Analyse von einer Vielzahl von Forschungsthemen im auditiven Neurowissenschaften. Die Ratte auditorischen Kortex (AC), wurde vor allem Gegenstand mehrere anatomische und physiologische Untersuchungen, die versucht haben, zu verstehen, seine Struktur, Organisation und Rolle bei der Tonbearbeitung3. Heute hat der AC beliebt unter Neurowissenschaftlern Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmung, die synaptischen Grundlage der rezeptiven Feldorganisation und die kortikale Kontrolle der Klangbearbeitung in die subkortikale auditive interessiert Kerne4,5,6,7,8,9. Zur Bewältigung der Herausforderungen, die diese neuen Ansätze darstellen, werden Verfahren, die genau zu lokalisieren und chirurgisch aussetzen der AC können Forschungsbemühungen beschleunigen. Stereotaktische Techniken machen es einfach, bestimmte Regionen im Gehirn ohne Physiologie Tests zu lokalisieren. Obwohl die Größe des Gehirns leicht variiert zwischen Tieren, kann von jedem Bereich des Gehirns ermittelt werden, wo mit stereotaktischen Koordinaten festlegen von Sehenswürdigkeiten auf den Schädel des Gehirns Ratte.
Die eingeschränkte Ablation des AC ist die chirurgische Entfernung der sensorischen Region der Hirnrinde, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem Gehör. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um die Aktivität des AC, wie z. B. Kühl- oder lokale Lidocain-Injektionen10,11,12, die chirurgische Ablation der AC Ergebnisse in den chronischen Verlust der Funktion blockieren. Damit eignen sich AC Ablationen mehr für das Studium, die langfristigen Auswirkungen der kortikalen Entbehrung, sowie die anschließende Phänomene der Läsion Plastizität. Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit chirurgischen Ablationen des AC hat erfolgreich zur Untersuchung der physiologischen, Verhaltens- und molekularen Auswirkungen der kortikalen Kontrolle Entbehrung13,14,15 ,16,17,18,19. Zum Beispiel wurde einem Rattenmodell mit bilateralen AC Ablationen zur Untersuchung der Auswirkungen der kortikalen Ablation im auditiven Startle Reflex und auditory Brainstem Antworten (ABR)16. Vor kurzem haben wir die Auswirkungen, dass einseitige gegenüber bilateralen Ablationen Ratte AC Produkte in ABR Schwellen, Amplituden und Latenzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung18verglichen. Darüber hinaus hat Rattenmodell der restriktiven AC Ablation auch verwendet worden, die Wirkung der Corticofugal Weg Degeneration in den minderwertigen Collicus13,14,15 und das Innenohr17 zu studieren ,19. Nachdem eine solche Manipulation im Gehirn durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. Obwohl sehr nützlich, die wichtigste Einschränkung der tonotopen Karten basierend auf neuronalen Antworten20,21 sind die elektrophysiologischen Techniken erforderlich um den auditiven Bereichen im Rattengehirn zu suchen. Da nicht alle Labors haben die notwendige Ausrüstung und/oder Know-how, solche Aufnahmen zu machen, haben wir eine Koordinate Karte basierend auf die Übertragung der Cytoarchitectural Grenzen des AC zu einem Bild des Gehirns Oberfläche18. Diese Karte kann sehr nützlich, die AC ohne Physiologie Tests zu finden sein.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die hierbei geführten Lage, chirurgische Exposition und Abtragen des AC bei Ratten. Es beschreibt auch unsere Koordinaten Karte18 verwenden, um der Ausdehnung der Läsion über ein Bild von der Oberfläche der abgetragenen Köpfe leicht zu lokalisieren.
Protocol
dieser Studie erfolgte in strikter Übereinstimmung mit beiden spanischen Vorschriften (Königliche Dekret 53/2013 - Gesetz 32/2007) und EU-Richtlinien (Richtlinie 2010/63/EU) auf die Pflege und Verwendung von Tieren in der biomedizinischen Forschung.
1. Vorbereitung der Ratte
Hinweis: die Experimente führten wir bei männlichen Ratten hormonellen Veränderungen zu vermeiden.
- Anesthetize das Tier mit einem Mix von Ketamin Hydrochlorid (30 mg/kg) und Xylazin-Hydrochlorid (5 mg/kg) intramuskulär injiziert; mit dieser Dosis, die Ratte tief für ca. 1 h. betäubt werden sollte
- Kneifen die Ratte ' s Zehe; Abwesenheit eines Rückzugs Reflex zeigt an, dass das Tier völlig unbewusst ist. Wenn die Ratte auf die Prise antwortet, geben zusätzliche Narkose bei einem Drittel der Anfangsdosis.
- Die Kopfhaut rasieren und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit Povidon-Jod.
- Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen zu eine Temperatur von 38 ° C erhalten und stabilisieren das Tier ' Kopf in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohr-Bars und eine Snack-Bar. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden das Trommelfell mit dem Ohr piercing.
- Die Augen schützen, indem Sie jedes Auge einen Tropfen ophthalmologischen Gel oder Serum Kochsalzlösung zuweisen.
2. Lage des AC in das Felsenbein der Ratte
- mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels aussetzen und zurückziehen der Knochenhaut auf der Oberfläche des Schädels machen.
- Einer sterilen Wattetupfer verwenden, um entfernen vorsichtig alle Blut bedecken die Oberfläche des Schädels, Bregma, Lambda und interaural 0 nach der Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn 22 zu visualisieren. Einen Einschnitt machen
- im zeitlichen Muskel in der Nähe seiner dorsalen einfügen auf den Schädel mit einem Skalpell. Ziehen Sie den Muskel mit einer Nadel und Faden Material und beheben Sie Nahtmaterial der stereotaktische Rahmen zu; Dadurch wird das Felsenbein ausgesetzt. Wenn Blutungen auftreten, mit kalten sterilen Kochsalzlösung spülen.
- Legen Sie eine sterile Nadel direkte in die stereotaktische Mikromanipulator, um sicherzustellen, dass es vollständig gesichert ist.
- Senken Sie langsam die Nadel bis es über der Oberfläche des Schädels, stimmt, so dass die Spitze der Nadel auf interaural 0 gesetzt ist. Legen Sie diesen Punkt als Null und Koordinaten ab diesem Zeitpunkt bestimmen.
- Je nach Interessengebiet Gehirn variieren die stereotaktischen Koordinaten. Bestimmen Sie durch die Nutzung des Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn 22 diese Koordinaten. Sobald die Koordinaten bestimmt sind, bewegen Sie die Nadel um diese Koordinaten entsprechen.
- Ziel der AC unter Verwendung der Koordinaten für die folgenden vier Punkte: A: A / P =-5,80 mm, M/L = + / 6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + / 6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 8,67 mm. unten die Nadel nach rechts oberhalb des Schläfenbeins, jeder dieser vier Punkte zu visualisieren. Mit einem Filzstift, markieren Sie die Punkte auf dem Felsenbein und verbinden sie zu, um ein Rechteck zu zeichnen; das Rechteck dient als eine Anleitung zum Öffnen eines Fensters im Knochen ( Abbildung 1).
3. Chirurgische Exposition des AC
- öffnen das Fenster mithilfe einer elektrischen Bohrmaschine und einem kleinen Bohrer bit (0,6 mm Ø). Bohren Sie den Umfang des Rechtecks bei 8.000 u/min, bis die Knochen verschenkt. Cool Bohrfläche durch Spülen mit kaltem sterile Kochsalzlösung zu subkortikalen Strukturen verhindern. Wenn die Knochen weicht, kann ein Tropfen im Widerstand erkannt werden. Seien Sie vorsichtig, nicht das Gehirn bohren.
- Wenn die Grenzen locker sind, Hochziehen der Bedeckung Knochen mit feinen Zangen und im kalte sterile Kochsalzlösung aufbewahren.
4. Abtragen des AC
- mit einem Operationsmikroskop (10 X), sanft die Hirnhaut mit einem mikrochirurgischen Messer schneiden und entfernen Sie diese mit zwei feinen Spitzen Pinzette. Wenn Blutungen auftreten, mit kalten sterilen Kochsalzlösung spülen.
- Aspirieren Sie sanft die AC mit einer chirurgischen Saugvorrichtung (-0.24 Druckbalken) gekoppelt mit einer sterilen 20 G stumpfe Spitze Nadel. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung und muss sehr sorgfältig durchgeführt werden: aspirieren Sie nur die sechs kortikalen Schichten und nicht die zugrunde liegende weiße Substanz.
- Aspirieren Sie bis die perforierende Arterien Blutung zu stoppen.
- Nach Abschluss die Aspiration decken Sie den verletzten Bereich mit dem extrahierten Knochen und beantragen eine resorbierbare blutstillende Gaze.
- Lassen Sie den zeitlichen Muskel wieder seine ursprüngliche Position, und dann Naht der Haut mit Wunde Clips (9 mm). Antibiotische Salbe (siehe die Tabelle der Materialien). Salbe auf die Wunde zweimal täglich für drei Tage gelten weiterhin.
Hinweis: Jede Anwendung besteht aus einer dünnen Schicht auf die Wunde aufgebracht. - Inject Buprenorphin subkutan im hinteren Teil der Ratte (0,05 mg/kg) als eine analgetische 1 h nach dem Eingriff und dann alle 8 Std. bei 72 h.
- Das Heizkissen das Tier behalten, bis er aufwacht, und senden Sie es an seinem Gehäuse Käfig zu erholen.
- Haus Tiere einzeln zu verhindern, dass Käfig Kumpels Berührung genähten und bieten einige Bereicherung Gegenstände. Das Sägemehl täglich ändern, um Infektionen zu verhindern, und vergewissern Sie sich, dass das Tier richtig erholt und keine Anzeichen von Unbehagen zeigt.
5. Gewebe-Sammlung
Vorsicht: beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), festen und wässrigen tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) und verwenden Sie ein Sicherheitsschrank.
Hinweis: bereiten Sie 750 mL Formaldehyd-Lösung durch Auflösen von 4 % (w/V) PFA in 1 x Phosphat gepufferte Lösung (PBS) mit Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehyd-Lösung mit Filterpapier. Bereiten Sie Ringer ' s Lösung von 8,5 g NaCl, 0,25 g KCl und 0,2 g Nahco3 3 in 1.000 mL Wasser auflösen (Lösung pH = 6,9).
- Lassen Sie das Tier überleben, solange sie für das Studium benötigt wird. Nach Abschluss der Forschungsarbeiten mit der AC abgetragene Ratte betäuben Sie es unheilbar durch Intra peritoneale Injektion von 0,1 mL Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg). Die Tiefe der Narkose durch Zeh kneifen und das Fehlen von Rückzug Reflex zu bewerten.
- Wenn das Tier tief betäubt ist, führen Sie eine intrakardiale Perfusion 23 von 125 mL Ringer ' s Lösung gefolgt von 750 mL Formaldehyd-Lösung mithilfe einer Nadelstärke von 1,8 mm Innendurchmesser.
- Nach Abschluss der Perfusion enthaupten die Ratte an der erste Halswirbel.
- Mit einer Schere entfernen die Haut und Muskeln von Kopf und setzen den Schädel. Mit einer Schere schneiden und das Foramen Magnum zu öffnen und entfernen die Rückseite des Schädels.
- Stellen eine transversale in den Augenhöhlenknochen mit Spencer Schere schneiden, und verwenden Sie Rongeurs, an den oberen Rändern des Schädels, das Gehirn aussetzen zu schneiden. Achten Sie darauf, dass nicht das Gehirn beschädigt.
- Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, entfernen Sie vorsichtig die Dura Mater mit feinen Spitzen Pinzette. Verwenden Sie einen Finger zu sanft unter schöpfen und das Gehirn zu erhöhen. Erhöhen Sie das Gehirn zu und schneiden Sie die Nerven untIl ist es kostenlos. Das Gehirn in Formaldehyd-Lösung Tauchen und speichern es bei 4 ° C für 24 h
6. Lokalisation der Läsionen AC
- nach Post-Fixierung, legen Sie sorgfältig das Gehirn in einer sagittalen Ratte Gehirn Matrix Freilegung der Mantelfläche des Gehirns.
- Legen Sie eine Kamera 21 cm über der Kortex-Oberfläche mit einem Kamerahalter, wählen Sie die " super Makro-Aufnahmen "-Modus, und nehmen Sie ein Bild von der Oberfläche des Gehirns.
- Das Gehirn in einen koronalen Ratte Gehirn Matrix Freilegung der dorsalen Oberfläche des Gehirns, und nehmen Sie ein anderes Bild.
- Öffnen Sie die Bilder mit einem Bildbearbeitungsprogramm, und verkleinern sie 50 % machen es einfacher, mit ihnen zu arbeiten. Identifizieren Sie der Bregma, Lambda und interaural 0 Referenzen auf dem Bild nach Paxinos und Watson Koordinaten 19, und markieren Sie ihre Position in den Bildern ( Abbildung 2). Zeichnen Sie die Kontur der Ablation über die seitlichen Bild des Gehirns. Berechnen den Umfang.
- Import die Koordinate Karte wo sind die primären (A1) und sekundären Regionen (dorsalen und ventralen Cortex) des AC befindet sich 18 bis die Datei des Programms Editor, wo Sie mit den Bildern arbeiten. Klicken Sie auf die Karte und ziehen sie es an den seitlichen Fotos des abgetragenen Gehirns überlagern.
- Machen die Bregma und Lambda-Referenzen der Koordinaten Karte übereinstimmen mit den Bregma und Lambda-Referenzen in das Bild des seitlichen Gehirns identifiziert.
- Den rhinal Riss als Referenz verwenden, um das Bild des Gehirns, um die Karte anzupassen, und machen sie übereinstimmen ( Abb. 2 b).
- Berechnen der Anteil der Läsion bezogen auf die Fläche der AC
Representative Results
Ein hierbei geführte Lage, chirurgische Exposition und einseitige Abtragen des AC durchgeführt in drei Wistar-Ratten. Die Lokalisation der Läsion bestätigte, dass in den drei Ablationen durchgeführt Ratten die Hauptunterteilungen des AC (primäre, dorsalen und ventralen Cortex) eingegriffen, und umfasste eine Reihe von 80 bis 100 % der Gesamtfläche AC (Abb. 2 b).
Das Protokoll hier beschriebenen restriktiven AC Ablationen durchgeführt wurde zuvor in unserem Labor verwendet, um die langfristigen Auswirkungen der kortikalen Kontrolle Deprivation in der auditiven subkortikale Kerne sowie die anschließende Phänomene der Plastizität zu studieren. In diesen Studien wurde das Protokoll vom AC Ablationen validiert durch die Anwendung der physiologischen (ABR), Verhaltensstörungen (Antworten zu erschrecken, prepulse Hemmung; PPI) und molekularen (DNA-Microarrays, qPCR und Western-Blot) Methoden13,14,15,16,17,18,19. Hier, um die Wirksamkeit unseres Protokolls zu demonstrieren, wir lassen die drei AC abgetragen Ratten eine Woche überleben und gesammelten Cochleae während der Gewebe-Sammlung Schritt zu studieren die Veränderungen in der Expression der relevantesten AMPA-Untereinheiten in der Erwachsenen Cochlea vorhanden , GluA2 und GluA3 von qPCR. Der Vergleich zwischen den Protokollen von AC abgetragen Ratten und Sham Kontrolltieren wo der Chirurgie-Prozess aber nicht der kortikalen Ablation durchgeführt wurde zeigte eine Down-Regulierung für GluA2 und ein Up-Verordnung für GluA3 in beiden Cochleae (Abbildung 3) , die ist im Einvernehmen mit unseren bisherigen19studieren.
Abbildung 1: Bilder von der Ratte Schläfenbeins an drei verschiedenen chirurgischen Schritte. (A) Übertragung der stereotaktischen Koordinaten des AC auf dem Felsenbein. Die Koordinaten der vier Punkte sind: A: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + / 6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + / 8,67 mm. (B) die Koordinaten als Referenz verwendet werden, um ein Rechteck auf der Oberfläche des Schläfenbeins, die die Öffnung eines Fensters führt. (C) zeigt das Fenster nach dem Bohren im Knochen. Die Hirnhaut mit Blutgefäßen können auf der Oberfläche des Gehirns beobachtet werden. R: rostral, D: dorsal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verfahren zur Ortung von Läsionen im Rattengehirn. (A) Foto von der dorsalen Oberfläche eines AC abgetragen Gehirns mit hierbei implantierten Nadeln in Lambda und Bregma (nach Paxinos und Watson Koordinaten19). Gepunktete Linien markieren die Position der Bregma und Interaural 0 im 9 x 9 cm Raster, ebenso wie in der dorsalen Oberfläche des Gehirns. (B) Foto der Mantelfläche des abgetragenen Gehirns zur Koordinate Karte des AC überlagert. Der Umfang der Läsion ist in der Abbildung rot gekennzeichnet. Der Umfang der AC Fläche ist in schwarz in der Karte gekennzeichnet. In diesem Beispiel ist der Prozentsatz der AC Ablation in Bezug auf die Gesamtfläche von AC besetzt 84.79 %. AC: auditorischen Kortex, IA: inter aural, FR: Rhinal Riss. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Veränderungen der mRNA-Niveaus AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA2 und GluA3 nach einseitigen AC Ablationen 7 Tage nach Läsion. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung der Falte Änderung. Änderungen für GluA2 Abschriften sind in blau dargestellt. Veränderung für GluA3 Abschriften sind in rot dargestellt. Eine signifikante Abnahme der GluA2 und eine Zunahme der GluA3 werden in beiden Cochleae beobachtet (Ipsi - und kontralateralen auf die Ablation) relativ zu Schein-Steuerelementen mit keine kortikalen Ablationen 7 Tage nach der Operation; Dies ist im Einvernehmen mit unseren bisherigen Ergebnisse19. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Eine erfolgreiche Gehirnchirurgie hängt von zwei Faktoren ab: das Tier am Leben zu halten, während und nach dem Eingriff und präzise Ortung den Bereich von Interesse. Um sicherzustellen, dass die Ratte ist tief während der Operation (Prüfung des Rücknahme-Reflexes) betäubt, und erhält ausreichend Analgetika und nicht-ototoxische Antibiotika sollte überleben helfen. Darüber hinaus sollte die Ratte auf ein Heizkissen gehalten werden, bis es aus der Narkose wacht um Unterkühlung zu vermeiden. Vernähen verringert sich die Anfälligkeit für Infektionen, und richtige Technik ist wichtig: Tiere holen ihre Wunde Clips, so dass sie fest genug implantiert werden sollte, um zu entfernen ohne dabei zu viel Spannung auf die Wunde zu verhindern.
Zu den AC (oder irgendeinem anderen kortikalen Bereich), genau zu lokalisieren ist wichtig zur Positionsbestimmung von Bregma, Lambda und interaural 0 bis sie als Referenz verwenden, um die Grenzen der Region gezielt zu berechnen. Jeder Fehler bei der Berechnung der Koordinaten führt die teilweise Abtragung des AC oder unerwünschte Aspiration von anderen umliegenden Gebieten. So sollte die Nadelspitze berühren nur die Knochen bei interaural 0 und dann übersetzen die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten entsprechend, was in diesem Protokoll beschrieben ist.
In dieser Handschrift haben wir auch beschrieben, wie Sie chirurgisch freizulegen und Abtragen der AC. Es gibt drei wichtige Schritte: der Bohrvorgang, die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut und die Ablation durch Absaugen. Bohren sollte bei niedriger Drehzahl mit minimaler Druck durchgeführt werden, da eine hohe Bohrgeschwindigkeit Wärme erzeugt, die in der Nähe subkortikalen Strukturen beeinflussen können. Jedoch sollten Beibehaltung einer niedrigen Geschwindigkeit und Bohren Kühlbereich mit kalt sterile Kochsalzlösung eine Beschädigung vermeiden. Darüber hinaus ist Mindestdruck unbedingt zu einen plötzlichen Bruch des Schädels und spätere Verletzungen der zugrunde liegenden Kortex zu vermeiden. Die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut, die die AC abdecken sollte sorgfältig durchgeführt werden, um zu vermeiden, die Blutgefäße zu brechen. Wenn Blutungen auftreten, die frühe und späte Prognose ist im allgemeinen ungünstig und es ist fraglich, ob so ein Tier die Einschlusskriterien für eine zuverlässige Studie entspricht. Wir empfehlen in diesem Fall Euthanasie. Schließlich muss die Aspiration (wahrscheinlich der schwierigste Aspekt bei der Durchführung einer effektiven Läsion), auf die graue Substanz beschränkt. Es gibt zwei Indikatoren, die helfen können das Vorhandensein der weißen Substanz: (1) eine Änderung der Farbkontrast, als die weiße Substanz ist heller als die graue Substanz; (2) die Beendigung von Blutungen aus den perforierende Arterien.
Nachdem jede Manipulation im Gehirn durchgeführt, ist es notwendig, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung des Verfahrens gemacht in der Hirnrinde für die anschließende Analyse und Validierung von Daten, die vom Tier zu beurteilen. In dieser Handschrift die, ausführlich wir die Ablation durchgeführt in der Hirnrinde mit Hilfe einer Koordinaten Karte zuvor beschrieben durch unsere Gruppe18Lokalisierung. Diese Karte wurde gebaut mit anatomischen Referenzen aus seriellen Abschnitt Rekonstruktionen der histologischen Abschnitte, korreliert mit dem Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn22gewonnen. Dementsprechend unterscheidet die Karte zwischen den primären (A1) und sekundäre Rinde (Dorsal und Ventral) des AC. Der Hauptvorteil dieser Koordinaten Karte ist, dass es die schnelle Lokalisierung der Läsion ermöglicht durch die Überlagerung ein Bild aus der Mantelfläche des Gehirns in eine sagittale Gehirn Matrix platziert. Ein weiterer Vorteil ist, dass Labore mit weniger Erfahrung in der Anatomie die Karte verwenden können, durch Anpassung an ihre Tiermodelle. Es ist nur notwendig, die Abstände zwischen Bregma, Lambda und interaural 0 Referenzen in ein Steuerelement durchblutet Gehirn und Skalieren der Karte oben oder unten entsprechend. Verwenden Sie der Rhinal Riss als Referenz, das Bild des Gehirns auf der Karte anpassen. Die Tiefe der Ablation kann nicht in dieser Koordinaten Karte bestimmt werden, so dass es im Gehirn histologischen Abschnitte bestimmt werden sollte.
Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit der chirurgischen Exposition des AC sind grundlegende Methoden, die leicht von jedem Ermittler angepasst werden könnte, möchte das AC bei der Ratte zu richten. Dies wäre für ein akutes Experiment oder der Implantation von permanenten Geräte erfordert. Darüber hinaus wurde die chirurgische Ablation des AC zuvor als Vorbild verwendet Studie zu den Auswirkungen der chronischen kortikalen Deprivation in Verhandlung. AC Ablationen könnte auch verwendet werden, um die Effekte zu studieren, die einseitige AC Ablationen in anderen kortikalen Bereichen ausüben, oder dienen als ein Modell eines Schlaganfalls. Die hier beschriebenen Versuchsanordnungen sind hilfreiche Methoden, die einzeln oder in Kombination mit einer Vielzahl von experimentellen Designs angewendet werden können.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (MINECO) der spanischen Regierung, SAF2016-78898-C2-2-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
| Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
| Heating pad | DAGA | ||
| Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
| Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
| Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
| Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
| Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
| Scalpel | Lawton | ||
| Povidone iodine | Meda | Betadine | |
| sterile saline serum | B.Braun | ||
| 20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
| Cotton tips | |||
| Suture material | B.Braun | ||
| Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough | ||
| Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
| Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
| Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.05 mg/kg |
| Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
| Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
| Rongeurs | Lawton | ||
| Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
| Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
| Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 60 mg/kg | |
| Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
| Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
| Canvas 12 | ACD Systems | ||
| needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
| Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
| GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
| GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
| GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
| GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |
References
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