Vi beskriver en metode til stereotactically guidede placering, eksponering og ablation af den auditive cortex i rotter. Lokalisering af ablation er vurderet ved hjælp af en koordinere kort postmortem.
Rotte auditive cortex (AC) er ved at blive populær blandt auditive neurovidenskab efterforskere, der er interesseret i erfaring-afhængighed plasticitet, auditive perceptuelle processer og kortikale kontrol af sound processing i subkortikale auditive kerner. For at imødegå nye udfordringer, en procedure til præcist lokalisere og kirurgisk eksponere de auditive cortex vil fremskynde denne forskningsindsats. Stereotactic Neurokirurgi bruges rutinemæssigt i præ-klinisk forskning i dyremodeller til at indpode en nål eller elektrode på en pre-definerede placering i den auditive cortex. I den følgende protokol bruger vi stereotactic metoder i en ny måde. Vi identificerer fire koordinere point over overfladen af temporal bone af rotte at definere et vindue, der når åbnet, præcist udsætter både primære (A1) og sekundære (dorsale og ventrale) cortex af AC. bruger denne metode, vi derefter udføre en kirurgisk ablation af AC. Efter sådan en manipulation er udført, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af læsioner i cortex. Dermed, vi også beskrive en metode for at nemt finde AC ablation postmortem ved hjælp af en koordinere kort fremstillet ved at overføre cytoarchitectural grænserne for AC til overfladen af hjernen. Kombinationen af stereotactically guidede placering og ablation af AC med lokalisering af det skadede område i et koordinere kort postmortem letter valideringen af oplysninger fra dyret, og fører til en bedre analyse og forståelse af data.
Rotten er en af de mest almindeligt anvendte animalske modeller i auditive neurovidenskab. Robusthed ved dets opførsel, gør det i stand til at arbejde for hundredvis af forsøg pr. dag. Dens følsomhed og spektral acuity for høring1,2, og den anatomiske og funktionelle tilrettelæggelse af dets centrale system, sammenlignes med andre pattedyr3, gør rotten en passende dyremodel til at analysere en bred vifte af forskningsemner i auditive neurovidenskab. Rotte auditive cortex (AC), navnlig har været genstand for flere anatomiske og fysiologiske undersøgelser, der har prøvet at forstå dens struktur, organisation og rolle i lydbehandling3. I dag har blevet AC populære blandt neuroforskere interesseret i erfaring-afhængighed plasticitet, auditiv perception, synaptic grundlaget for modtagelige felt organisation og kortikale kontrol af lydbehandling i den subkortikale auditive kerner4,5,6,7,8,9. For at løse de udfordringer, som disse nye tilgange udgør, vil procedurer, der kan præcist lokalisere og kirurgisk udsætte AC fremskynde forskningsindsats. Stereotactic teknikker gør det nemt at lokalisere bestemte områder i hjernen uden fysiologi testning. Selv om hjernen størrelse varierer lidt mellem dyr, kan placeringen af enhver hjerne område bestemmes ved hjælp af stereotactic koordinater angivet fra vartegn på kraniet af rotte hjernen.
Den begrænsede ablation af AC er kirurgisk fjernelse af regionen sensoriske cortex mest direkte forbindelse med hørelse. I modsætning til andre metoder, der anvendes til at blokere aktiviteten af AC, såsom køling eller lokale lidocain injektioner10,11,12, den kirurgisk ablation af AC resulterer i kronisk tab af funktion. Således, AC ablations er mere velegnede til at studere de langsigtede virkninger af kortikale afsavn, samt de efterfølgende fænomener af læsion plasticitet. Kombinationen af stereotactic metoder med kirurgisk ablations af AC har været anvendt med succes til at studere de fysiologiske, adfærdsmæssige og molekylær effekter af kortikale kontrol afsavn13,14,15 ,16,17,18,19. For eksempel, er en rotte model med bilaterale AC ablations blevet brugt til at studere virkningerne af kortikale ablation i auditive overraske refleks og auditive hjernestammen svar (ABR)16. For nylig har vi sammenlignet de virkninger det ensidige kontra bilaterale ablations af rotte AC producere i ABR tærskler, amplituder og ventetid på forskellige tidspunkter efter skade18. Derudover er rotte model af restriktive AC ablation også blevet brugt til at studere effekten af corticofugal pathway degeneration i ringere collicus13,14,15 og indre øre17 ,19. Efter sådan en manipulation er udført i hjernen, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af læsioner i cortex. Selvom meget nyttigt, er den største begrænsning af tonotopic kort baseret på neuronal svar20,21 de elektrofysiologiske teknikker, der kræves for at lokalisere de auditive felter i rotte hjernen. Da ikke alle laboratorier har det nødvendige udstyr og/eller ekspertise til at foretage sådanne optagelser, konstrueret vi en koordinere kort baseret på overførsel af cytoarchitectural grænserne for AC til et billede af hjernens overflade18. Dette kort kan være meget nyttigt at finde AC uden fysiologi testning.
Denne protokol beskriver en metode til stereotactically guidede placering, kirurgiske eksponering og ablation af AC i rotter. Det beskriver også, hvordan du bruger vores koordinere kort18 til nemt lokalisere en udvidelse af læsion over et billede af overfladen af ablated hjerner.
En vellykket hjerneoperation afhænger af to faktorer: at holde dyrene i live under og efter proceduren, og præcist at lokalisere område af interesse. At sikre at rotten er dybt bedøvede under operationen (test tilbagetrækning refleks), og modtager passende analgetika og ikke-ototoksiske antibiotika bør hjælpe overlevelse. Derudover holdes rotter på en varmepude, indtil det vågner fra anæstesi til at undgå hypotermi. Suturering vil falde modtagelighed for infektion, og korrekt teknik er af afgørende betydning: dyr vil samle på deres sår clips, så de skal implanteres stramt nok til at forhindre fjernelse uden at lægge for meget spænding på såret.
Til præcist lokalisere AC (eller enhver anden kortikale område), er det vigtigt at fastlægge placeringen af bregma, lambda og interaural 0 til at bruge dem som referencer til beregning af grænserne for det målrettede område. Eventuelle fejl i beregning af koordinater vil resultere i den delvis ablation af AC eller den uønskede aspiration af andre omkringliggende områder. Således bør nål tip kun røre knoglen på interaural 0, og derefter oversætte antero-posterior og medio-lateral koordinaterne efter hvad der er beskrevet i denne protokol.
I dette håndskrift, har vi også beskrevet hvordan man kirurgisk udsætte og ablate AC. Der er tre vigtige trin: boring-processen, åbning og fjernelse af meninges og ablation af aspiration. Boring bør udføres ved en lav hastighed med minimum pres, som en boring højhastigheds genererer varme, der kan påvirke i nærheden subkortikale strukturer. Dog skal fastholde en lav hastighed og køling boring området med kolde sterilt saltvand forebygge skader. Derudover er minimum pres nødvendigt at undgå en pludselig pause i kraniet og efterfølgende skade den underliggende cortex. Åbning og fjernelse af meninges, der dækker AC skal udføres omhyggeligt for at undgå at bryde blodkarrene. Hvis der opstår blødning, tidligt og sent prognosen er generelt ugunstig, og det er tvivlsomt om sådan et dyr opfylder inklusionskriterierne for en pålidelig undersøgelse. Vi anbefaler eutanasi i dette tilfælde. Endelig skal aspiration (sandsynligvis det vanskeligste aspekt i at udføre en effektiv læsion), være begrænset til det grå materie. Der er to indikatorer, der kan hjælpe med at registrere tilstedeværelsen af den hvide substans: (1) en ændring i farvekontrast, som den hvide substans er lysere end den grå materie; og (2) ophør af blødning fra perforering arterierne.
Efter enhver manipulation udført i hjernen, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af proceduren i cortex til efterfølgende analyse og validering af data indhentet fra dyret. I dette manuskript detalje vi hvor hen til lokalisere den ablation udført i cortex ved hjælp af en koordinere kort tidligere beskrevet af vores gruppe18. Dette kort blev bygget ved hjælp af anatomiske referencer fra seriel afsnit rekonstruktioner af histologiske sektioner, korreleret med Paxinos og Watson atlas af rotte hjernen22. I overensstemmelse hermed, kortet skelner mellem den primære (A1) og sekundære cortex (dorsale og ventrale) af AC. Den største fordel ved denne koordinere kort er, at det giver mulighed for hurtig lokalisering af læsion ved at sammenføje et billede taget fra den laterale overflade af hjernen placeret i en sagittal hjernen matrix. En anden fordel er, at laboratorier med mindre erfaring i anatomi kan bruge kortet ved at tilpasse det til deres dyremodeller. Det er kun nødvendigt at angive afstande mellem bregma, lambda og interaural 0 referencer i en kontrol perfunderet hjerne og skalere kortet op eller ned i overensstemmelse hermed. Brug den Rhinal revne som reference til at justere billedet af hjernen til kortet. Dybden af ablation kan ikke bestemmes i denne koordinere kort, så det bør fastsættes i hjernen histologiske sektioner.
Kombinationen af stereotactic metoder med den kirurgiske eksponering af AC er grundlæggende metoder, som nemt kunne tilpasses af enhver efterforsker, der ønsker at målrette AC i rotter. Dette kan være en akut eksperiment eller én, der kræver implantation af faste enheder. Desuden, den kirurgisk ablation af AC har tidligere er blevet anvendt som model til at studere virkningerne af kronisk kortikale afsavn i høring. AC ablations kunne også bruges til at studere de effekter, som ensidige AC ablations udøve i andre kortikale områder, eller tjene som model for slagtilfælde. De eksperimentelle design beskrevet her er derfor nyttige metoder, der kan anvendes enkeltvis eller i kombination til en bred vifte af eksperimentelle design.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af en bevilling fra ministeriet for økonomi og konkurrenceevne (MINECO) af Spaniens regering, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |