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Medicine

Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56634
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Physiology, Justus Liebig University Giessen

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement et la culture du rat adulte cardiomyocytes ventriculaires (CVDA). CVDA isolé peut être utilisé pour la culture à courte et à long terme. L’isolement et la culture de CVDA peuvent jouer un rôle clé dans l’élaboration de nouveaux schémas thérapeutiques pour les maladies cardiaques.

Abstract

Dans un coeur intact, cellules adjacentes influencent les cardiomyocytes adultes. Avec la méthode d’isolement et culture des cardiomyocytes adultes, une enquête précise sur le comportement de ces cellules sous traitements spécifiques et des environnements est possible. Ce manuscrit présente un protocole pour la réussite de l’isolement et culture des cardiomyocytes ventriculaires de rat adulte (CVDA).

Le rat est sacrifié par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Puis, le cœur est extraite et l’aorte est découvert. Par la suite, une perfusion sur le système de perfusion de Langendorff avec épuisement de calcium et le traitement de la collagénase est effectuée. Par la suite, tissu ventriculaire obtient haché, rediffusée et filtré, suivi de trois étapes de centrifugation avec ajout graduel de CaCl2 jusqu'à ce que la concentration de calcium physiologique est atteinte. CVDA sont plaquées sur les récipients de culture cellulaire. Après avoir actualisé le milieu de culture cellulaire, CVDA peut être cultivé pendant six jours, sans changer le milieu de culture contenant du sérum. Isolement de CVDA est un processus délicat de calcium. Petits changements dans la concentration de calcium intracellulaire provoque une diminution de la qualité et la viabilité des cellules isolées.

Fraîchement isolées CVDA sont en forme de tige. Dans les premiers jours de culture, ils perdent les bâtonnet morphologie et forme pseudopodes structures semblables (propagation). Au cours de cette formation morphologique CVDA dégrader initialement leurs éléments contractiles, suivies d’une réforme par le biais de fibres de stress d’actine et de novo sarcomerogenesis. Après une semaine de la culture, la plupart CVDA montrent un aspect généralisé avec une striation transversale clairement décelable. Ce processus est sensible à la concentration de calcium intracellulaire, comme traitement avec ionomycine atténue la propagation. Les marqueurs clés dans ce processus de - et re - differentiation sont la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), oncostatine M (OSM) et swiprosin-1 (EFHD2). Des études récentes ont suggéré que cardiaque re - et de - differentiation survenant dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque. Par conséquent, l’isolement et culture des CVDA jouent un rôle clé dans la compréhension de la biologie des cardiomyocytes.

Introduction

Les cardiomyocytes adultes en vivo fonctionne comme un syncytium électrique basé sur les contacts des cellules entre les myocytes. En outre, ils sont influencés par des cellules adjacentes comme les fibroblastes cardiaques, cellules endothéliales, les neurones et les cellules inflammatoires1. Afin d’étudier la capacité des cardiomyocytes à adapter leur organisation intracellulaire à modifié les conditions de charge, comme on le voit au cours de l’hypertrophie cardiaque, qui est une première étape conduisant à une insuffisance cardiaque, l’isolement et la culture du rat ventriculaire adulte cardiomyocytes (CVDA) est nécessaire2,3,4. Historiquement, les cardiomyocytes ont d’abord été isolés de l’embryon de poulet coeurs5,6. Quelques années plus tard, le premier isolement des cardiomyocytes différenciées en phase terminale a été décrite à l’aide de calcium appauvrissement de la couche7. Toutefois, ces cardiomyocytes adultes n’étaient pas calcique tolérant et ne pouvait donc pas être utilisés pour les tests fonctionnels. Enfin, en 1976, un nouveau protocole activé Powell et Twist d’enquêter sur des cardiomyocytes ventriculaires adultes sous des conditions physiologiques8. Dans un premier temps, ils ont isolement les cardiomyocytes adultes sous de faibles concentrations de calcium et par la suite une augmentation de calcium à des concentrations physiologiques dans une procédure par étapes. Aujourd'hui, la plupart des protocoles d’isolement et de culture des cardiomyocytes adultes travaillent avec ce protocole de calcium et utilisent collagénase pour la digestion enzymatique de la cellule-cellule dense contacts1.

Pour une culture réussie, sérum de veau foetal (FCS) ou oncostatine M (OSM) est requise. CVDA exécute une de - et re - differentiation avec les importants changements structurels dont sarcomère démontage et réforme9,10,11,12. Ce processus s’accompagne d’un re-expression des gènes de type fœtal, comme la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), comme dans une hypertrophie et une formation de structures ressemblant à des pseudopodes, également appelé épandage4,11, 13. en outre, swiprosin-1 (EFHD2), une protéine nouvellement identifiée, joue un rôle majeur dans le processus de re-différenciation des cultivés CVDA11. En conséquence, CVDA dans culture transformer en cellules généralisées, polymorphes, qui montrent spontanément des contractions après deux ou trois semaines dans la culture2,4,14.

Des découvertes récentes ont révélé que cardiaque re - et de - differentiation lorsqu’il produit dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque10,15. Remodelage cardiaque est un processus clé lors des maladies cardiaques,16. Comme les maladies cardiaques constituent toujours la principale cause de mortalité dans les sociétés industrialisées, il est important de mieux comprendre la biologie des cardiomyocytes adultes (qui ; 2015). Isolement et culture des CVDA peuvent aider à développer de nouvelles stratégies et médicaments pour le traitement des maladies cardiaques. Ce manuscrit, un protocole pour l’isolement et la culture de CVDA est donné. En outre, certaines parties critiques de cette méthode sont mises en évidence dans la section « discussion ».

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Protocol

l’enquête est menée selon le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publiée par le National Institute of Health (NIH Publication n° 85-23, révisée en 1996). En général, les rats wistar mâles âgés de 3 à 4 mois et avec un poids moyen de 250-350 g, sont utilisées pour ce protocole. Un coeur de rat est suffisant pour 20 Pétri (1 mL par plat ; diamètre intérieur : 35 mm) avec une densité cellulaire approximative de 1,5 x 10 4 cellules/1000 mm 2.

1. préparation des milieux et réactifs

  1. créatine-carnitine-taurine milieu (milieu de la CCT)
    Remarque : milieu de la CCT est un milieu complex issu du milieu 199 additionné de créatine, carnitine et taurine.
    1. Préparer 1 L de milieu 199 : ajouter 3,6 g Hepes et mélanger pendant 1 h. Ajoutez ensuite la créatine 655,5 mg (5 mM), carnitine 395,4 mg (2 mM) et la taurine 625,5 mg (5 mM). Carnitine et taurine changent pH à < 7. Afin d’inhiber la croissance des cellules, par exemple les cellules endothéliales ou fibroblastes contaminantes, ajouter 10 µM cytosine β-D-arabinofuranoside au milieu. Ajuster le pH avec du NaOH (2 mM) à 7,4 et stérile filtre le milieu. Conserver le milieu de la CCT à 4 ° C.
  2. Moyen de Powell
    1. pour 1 moyen L Powell, dissoudre 6,43 g NaCl (110 mM) à 0,19 g KCl (2,5 mM), (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 5,96 g Hepes (25 mM) et 1,98 g D (+ )-Monohydrate de glucose (10 mM) en Aqua stérile. Ajuster le pH avec du NaOH (2 M) au filtre 7,4 et stérile du milieu. Conserver le milieu de Powell à 4 ° C.
  3. Chlorure de Calcium (CaCl 2)
    1. préparer une solution de 100 mM CaCl 2 (50 mL) et de préparer des aliquotes contenant 500 µL CaCl 2. Congeler des aliquotes à -20 ° C.
  4. Préparation du milieu de culture
    1. Prepare trois milieux de culture cellulaire : pré-revêtement médium, médium placage et lavage moyen. Utiliser le moyen du tarif douanier commun comme base pour toutes les trois médiums (tableau 1). Calculer la moyenne du tarif douanier commun avec 1 mL par boîte de Petri. Donc, préparer 20 mL de milieu de CCT pour 20 Pétri (diamètre intérieur : 35 mm).
    2. Cell culture plaques : enduisez chaque plaque de culture cellulaire (diamètre intérieur : 35 mm) avec 1 mL pré-revêtement moyen. Stocker les plaques revêtues à 37 ° C pendant la nuit ou pendant au moins 2 h avant d’utiliser.

2. Isolement des Cardiomyocytes adultes

  1. système de perfusion de préparation de Langendorff
    1. chauffer l’électrodéposition moyen et support de lavage à 37 ° C. Defreeze un tube de 500 µL CaCl 2 et pèsent de 25 mg de collagénase.
    2. Ras le système de perfusion de Langendorff avec aqua stérile, laisser ensuite moyen de Powell circulent le système pendant 5 min.
    3. Remplir le système de perfusion de Langendorff avec 80 mL de milieu de Powell, sans aucun air bulles et gaz le milieu avec 95 % d’oxygène.
    4. Préparer un tube (50 mL) avec 40 mL de milieu de Powell, chauffez-le à 37 ° C et il gaz avec 95 % d’oxygène.
    5. Préparer un fil d’environ 25 cm de longueur pour fixer le cœur enlevé à la canule.
    6. Dégraisser une lame de rasoir avec de l’alcool (70 % en volume) et l’accrocher à l’hélico. Serrer un disque en plastique dans le hachoir.
  2. Extraction du coeur
    1. anesthésier un rat wistar mâles avec 4 à 5 % isoflurane et le sacrifice avec dislocation cervicale. Ouvrir l’abdomen derrière l’arc costal avec un cisaillement abdominal et, avec la même paire de ciseaux, couper à travers le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.
    2. Enlever le cœur, ainsi que les poumons et le thymus, en coupant au-dessus du thymus hautement crânien dans la cavité thoracique. Transférer le matériel à solution saline glacée immédiatement.
    3. Enlever le poumon et le thymus du cœur avec un ciseaux de dissection (grand) et de fixer le matériau avec une pince capsule, transférer ce dernier à une nouvelle solution saline.
  3. Isolation
    1. enlever les tissus en excès, comme les résidus de thymus, trachée, la graisse et du tissu conjonctif du fond du cœur à l’aide de forceps capsule et un ciseaux de dissection (grande ou petite). Découvrir l’aorte et il rompre avec un ciseaux de dissection (grande ou petite) entre le premier et le deuxième branchiales arch.
    2. Commencer le dripping du système de perfusion de Langendorff. Placez le coeur sur la canule du système de perfusion Langendorff et se focaliser tout d’abord avec une pince crocodile et ensuite avec le fil préparé. Rincez le cœur jusqu'à ce qu’il est exempt de sang.
    3. Dissoudre 25 mg collagénase dans un milieu Powell chaud 5 à 6 mL et ajouter 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).
    4. Fermer la circulation en plaçant un entonnoir de verre, qui est relié avec le système de perfusion de Langendorff, sur le cœur ruisselant et ajouter la collagénase résolu pour le système de perfusion. Commencer la perfusion pendant 25 min avec une vitesse de chute de 1 goutte par seconde.
      Remarque : Pendant la perfusion, le cœur va gonfler et obtenir un aspect cireux.
    5. Arrêter la perfusion après 25 min et enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Retirer le cœur de l’aorte, oreillettes et du tissu conjonctif et à ouvrir les ventricules droit et gauche.
    6. Hachez le coeur deux fois à un angle de 90° (largeur de coupe : 0,7 mm, vitesse : 0,15 cm/s). Répétez ce processus manuellement avec deux scalpels pour 10 s chaque côté.
    7. Transférer 12 mL du milieu de perfusion dans un nouveau tube (50 mL). Versez la solution chargée en cellules dans ce médium et digérer les cellules pendant cinq minutes à 37 ° C. mélanger la solution chaque minute.
    8. Filtrer la solution avec le cœur digérée au travers d’une maille en nylon (200 µm) dans un nouveau tube (50 mL).
    9. Centrifuger la solution filtrée à 29 g pendant 3 min. jeter le surnageant et ajouter 6 mL de milieu chaud Powell dont 12,5 µL CaCl 2 (250 µM) pour le culot cellulaire. Resuspendre le culot par le biais de mouvements secouant. Centrifuger à nouveau à 29 x g pendant 2 min. jeter le surnageant et ajouter 6 mL chaud moyen Powell substitué par 25 µL CaCl 2 (500 µM). Dissoudre le culot cellulaire par le biais de manœuvres douces et secouant et ajouter 12 mL chaud Powell moyen y compris 120 µL CaCl 2 (1 mM). Centrifugeuse pour la troisième fois à 16 x g pendant 1 min. Encore une fois, éliminer le surnageant.
    10. Mélanger le culot cellulaire avec le médium placage préchauffé.
    11. Retirer avant électrodéposition moyen de plaques de culture. Transférer 1 mL de support, y compris les cardiomyocytes isolés, pour chaque plaque de culture de placage. Incuber les cardiomyocytes isolés fraîches à 37 ° C pendant 1 h.
    12. Enlever le support de revêtement de plaques de culture. Ajouter 1 mL de lavage moyen pour chaque plaque de culture et de stocker les plaques à 37 ° C jusqu'à six jours sans changer le support de.
    13. Pour étudier l’influence de différents produits chimiques et traitements sur CVDA, tout d’abord actualiser médium placage en lavage moyen et par la suite en ajoutant différents produits chimiques.
      NOTE : Évaluation à la microscopie photonique : avec la préparation de chaque cellule, les cardiomyocytes de 150 à 300 doivent être surveillés par jour au microscope photonique. Subdiviser les cardiomyocytes tous comptés en groupes selon leur apparence (par exemple, " en forme de tige ", " rond vers le bas ", " diffusion ", et " aspect inhabituel "). La catégorie " diffusion " comprend tous les cardiomyocytes avec structures ressemblant à des pseudopodes. " Aspect inhabituel " comprend tous les CVDA avec une surface irrégulière et aucune membrane de cellules intacte détectable.

3. Exemple de Expériences

  1. Fluorescence/Immunofluorescence souillant des cardiomyocytes adultes
    1. analyser les conversions morphologiques et structurales de CVDA pendant la culture par microscopie confocal laser. Phalloïdine-TRITC permet d’enquêter sur les structures de l’actine F en " en forme de tige ", " rond vers le bas ", et " diffusion " CVDA. Effectuer une coloration selon le fabricant ' protocole s. Un exemple pour la coloration de la phalloïdine-TRITC est donné en référence Nippert et al. 11. avec fluorescence/immunofluorescence souillant, les différences dans la de - et re - differentiation de l’appareil contractile dans les cardiomyocytes adultes cultivés entre (par exemple, avec des traitements expérimentaux Swiprosin-1, ionomycine) peuvent être l’objet d’une enquête.
  2. En temps réel RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
    1. effectuer qRT-PCR pour étudier les changements dans l’expression de l’ARNm de gènes différents (p. ex., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) pendant la culture de CVDA. Pour la taille de l’échantillon suffisant, utiliser des plats de culture plus grands (diamètre intérieur : 60 mm) avec volume de 2 mL. CVDA de cinq plats de culture donne un échantillon. Effectuer l’isolement d’ADN messagère et la transformation de l’ADNc selon le fabricant ' protocole de s.
  3. Techniques d’immunotransfert
    1. effectuer des Western Blots pour étudier les changements dans l’expression de la protéine (par exemple, pour Swiprosin-1) au cours de la culture de CVDA. Utilisez une boîte de Petri (1 mL) par exemple.

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Representative Results

Des cardiomyocytes adultes dans la culture : La figure 1 présente un aperçu des cardiomyocytes adultes fraîchement isolées 2 h après le dernier lavage. Environ 75 % des cardiomyocytes tous avaient une morphologie en forme de bâtonnet. Les 25 % restants ont montré un aspect inhabituel avec une morphologie ronde et la membrane de la cellule intacte de pas détectable (Figure 1). À la fin de la culture (jour 6), jusqu'à 15 % de tous les cardiomyocytes a montré s’étalant, environ 10 % sont restés dans une morphologie ronde sans structures ressemblant à des pseudopodes, et 75 % de tous les cardiomyocytes présente un aspect inhabituel avec une surface irrégulière et sans un membrane de cellule intacte détectable (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : vue d’ensemble des cardiomyocytes de rats fraîchement isolées. La fraction des cardiomyocytes fraîchement isolés qui ont montré une morphologie en forme de bâtonnet s’élevait en moyenne à 75 % des cardiomyocytes. Les 25 % restants de cellules présente un aspect inhabituel avec une surface irrégulière et la membrane de la cellule intacte pas détectable. Enregistrement a été réalisé par microscopie optique 2 h après avoir lavé les cardiomyocytes fraîchement isolées. Microscopie optique 2 X grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La microscopie photonique, CVDA fraîchement isolée est apparu en forme de tige et environ 100 µm de longueur (Figure 2 a). Fraîchement isolées CVDA qui spontanément les contrats n’étaient pas calcique tolérant. Toutes les cellules qui ont été sans une membrane de cellule intacte détectable en rond ont été endommagés et non viables (Figure 2 a-B). Dans les jours suivants, la plupart de la tige en forme de CVDA perdu cette morphologie. Cellules a obtenu arrondies avec une membrane de cellule intacte détectable. Ces CVDA étaient viables. À partir de trois jours les cellules de cette dernière forme structures ressemblant à des pseudopodes. Certains de ces CVDA gardé leur apparence arrondie au cours de la diffusion (Figure 2 b). D’autres convertis en plat, CVDA polymorphe (Figure 2 b).

Figure 2
Figure 2 : isolé de rat cardiomyocytes. (A) CVDA fraîchement isolée étaient généralement en forme de bâtonnet. (B) après six jours de culture, structures ressemblant à des pseudopodes (propagation) étaient clairement décelables dans la CVDA maintenant arrondi. Certains CVDA a complètement changé à une morphologie très répandue. CVDA avec un aspect inhabituel affiche une surface irrégulière et la membrane de la cellule intacte pas détectable. Microscopie optique 10 X grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fraîchement isolées CVDA étaient typiquement tige en forme avec une striation transversale bien visible (Figure 3, jour 0). Changements dans la morphologie des cellules ont été observés au cours des jours suivants dans la culture. Tout d’abord, CVDA perdu tous leurs éléments contractiles (Figure 3, jours 1 et 2). Ceci a été suivie d’une réforme, impliquant de novo sarcomerogenesis. La réforme a été précédée par la formation de structures ressemblant à des pseudopodes (épandage, Figure 3, jours 3 à 6). Sarcomerogenesis de novo a commencé avec l’apparition des fibres de stress d’actine (Figure 3, jour 3). En outre, les faisceaux d’actine est apparu dans la région périnucléaire et formé nouvellement assemblés sarcomères (Figure 3, jours 4 et 5). Ce dernier poussaient le long des fibres de stress d’actine préformés dans la périphérie (Figure 3, jour 6). À la fin de la période de culture (jour 6 a), une striation transversale typique de sarcomères nouvellement assemblés dans la propagation CVDA a été observée.

Figure 3
Figure 3 : coloration de Fluorescence. Le de - et re - differentiation de CVDA en culture et 20 % FCS est montré. Fraîchement isolées CVDA avec leur forme typique de tige (jour 0) devint rond en dégradant les sarcomères durant les premiers jours de la culture (jour 1). Ils ont perdu tous leurs éléments contractiles (jour 2) suivis par la formation de structures ressemblant à des pseudopodes (port étalé ; Jours 3 à 5) et d’une réforme ultérieure de leurs éléments contractiles indiquant de novo sarcomerogenesis (jour 6). Au jour six dans la culture, striation transversale est clairement décelable à nouveau (jour 6 a). La coloration à la phalloïdine-TRITC selon le protocole du fabricant ; « flèches » : structures ressemblant à des pseudopodes (exemple illustré) ; * : faisceaux d’actine dans la région périnucléaire (exemplaire montré). Certaines parties de ce chiffre sont publiées dans le11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 4 affiche la cinétique du processus de diffusion pendant la culture. La fraction de CVDA montrant des structures ressemblant à des pseudopodes à chaque moment de l’examen est administrée par épandage en % (Figure 4). Diffusion a commencé autour de trois jours et a augmenté constamment au cours de l’époque de la culture. 14,7 % ± 1,39 % de CVDA comptés tous les ont montré des structures ressemblant à des pseudopodes après six jours de culture.

Figure 4
Figure 4 : diffusion cinétique augmentation dans les cardiomyocytes avec structures ressemblant à des pseudopodes normalisée à tous les cardiomyocytes comptés (étalement en%) pendant six jours de temps de culture (n = 33 préparations de cellules). Les données sont présentées comme le moyen ± SEM Ce chiffre est publié dans le11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Effet de l’ionomycine à l’épandage de CVDA : L’isolement et la culture de CVDA est un calcium processus sensible1,8. Traitement des CVDA avec ionomycine (1 µM), ce qui augmente la concentration de calcium intracellulaire, entraîne une diminution significative (p ≤0.01) la formation de structures ressemblant à des pseudopodes par rapport aux témoins (Figure 5). Lorsque comparées directement, 17.19 % ± 2,45 % de tous les comptés CVDA a montré propagation dans des conditions de contrôle mais seul 9,87 % ± 2,77 % de CVDA comptés tous formé des structures ressemblant à des pseudopodes en présence de l’ionomycine (jour 6 de culture). Ainsi, l’ionomycine réduit qui se propage par 42,58 %.

= « jove_content » fo:keep-together.within-page = « 1 » >Figure 5
Figure 5 : diffusion cinétique sous traitement ionomycine. Traitement avec ionomycine (1 µM) au jour J0 a entraîné une réduction très significative dans la cellule de diffusion par rapport au témoin. Les données sont présentées comme le moyen ± SEM ; n = 4 préparations de cellules ; Test de Mann-Whitney-U ; * p ≤ 0,05 ; ** p ≤0.01 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

En outre, ionomycine a augmenté le pourcentage de CVDA avec un aspect inhabituel par rapport aux conditions de contrôle (Figure 6). À jour six, 71,11 % ± 4,65 % de tous les compté CVDA traité avec ionomycine a montré un aspect inhabituel. Toutefois, dans des conditions de contrôle, seul 51.35 % ± 3,55 % de la CVDA ont été classés dans ce groupe.

Figure 6
Figure 6 : CVDA avec un aspect malsain. Traitement avec ionomycine (1 µM) au jour 0 entraîne une augmentation significative du nombre de CVDA, qui a montré un aspect inhabituel. Au jour 6, la différence entre contrôle et CVDA traités avec ionomycine était significative. Les données sont présentées comme le moyen ± SEM ; n = 4 préparations de cellules ; Test de Mann-Whitney-U ; * p ≤ 0,05 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Au 3e jour de culture, sous traitement ionomycine, qRT-PCR a révélé une diminution de l’expression de l’ARNm de β-MHC (p ≤0.01) et l’OSM, qui jouent un rôle distinct dans la dédifférenciation de CVDA (Figure 7 a et C). Swiprosin-1, un marqueur pour re-différenciation des CVDA était significativement diminuée, trop (Figure 7 b).

Figure 7
Figure 7 : De - et re - differentiation de CVDA cultivée sous traitement ionomycine
(1 µM) au jour 0 causé une diminution mRNA expression d’oncostatine M (OSM) et β-MHC, qui ont tous deux jouent un rôle clé dans la dédifférenciation des cardiomyocytes adultes. En outre, expression de l’ARNm du Swiprosin-1, un acteur clé dans la re-différenciation des cardiomyocytes adultes, a également diminuée de traitement ionomycine. Jour 3 de culture ; Les données sont présentées comme le moyen ± SEM ; n = 30 plaques de culture cellulaire par groupe ; Test de Mann-Whitney-U ; * p ≤ 0,05 ; ** p ≤0.01 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pré-revêtement moyen
20 mL de milieu de TDC
2 % vol. pénicilline/streptomycine (400 ml)
4 % vol. FCS (800 μL)
Moyen de placage
20 mL de milieu de TDC
2 % vol. pénicilline/streptomycine (400 ml)
Support de lavage
20 mL de milieu de TDC
2 % vol. pénicilline/streptomycine (400 ml)
Remarque : 4 % Vol. FCS dans le milieu de l’électrodéposition avant peut être remplacé par 1 Vol.-% laminine (0,5 μg/cm2). En outre, pour la culture des cardiomyocytes pendant plusieurs jours ajouter 20 Vol.-% FCS au milieu de lavage. Magasin médium placage et lavage moyen de 4 à 8 ° C jusqu'à l’utilisation.

Tableau 1 : milieux de Culture utilisés pour isoler les cardiomyocytes

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Discussion

Le comportement des cardiomyocytes adultes in vivo est influencé par de nombreuses interactions avec les autres cellules (par exemple, les neurones, les cellules endothéliales, fibroblastes, cellules inflammatoires) et le syncytium électrique qu’ils composent1. Par conséquent, étudier le stress adaptation des cardiomyocytes adultes exclusivement nécessite l’isolement et la culture de CVDA. Les principaux effets d’isoler et de cultiver CVDA sont : 1) les déconnecter de la matrice extracellulaire et des contacts de cellules ; 2) déconnecter de stimuli contractiles ; 3) obligeant à un tissu tridimensionnel s’adapter à un environnement à deux dimensions. Dans ces conditions, CVDA commencer de - et re - differentiation comme décrit ci-dessus et effectuer les adaptations multiples, qui peuvent également être vus pendant cardiaque retouche en vivo (désensibilisation des récepteurs β-adrénergiques, remontage des sarcomères, etc.) 4. par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes adultes représente une méthode valable pour enquêter sur ces cellules et leur réponse aux différents traitements. Ces idées peuvent servir ensuite pour in vivo des expériences, qui aideraient à éviter inutilement les mêmes expériences et de réduire le nombre d’animaux testés. Certes, quelques résultats observés in vitro ne surviendra en vivo (p. ex., la formation de structures ressemblant à des pseudopodes). Les cellule-cellule-contacts existants dans le syncytium électrique entravera la croissance excessive sous des conditions physiologiques,17. Néanmoins, CVDA isolée et cultivée peut être utilisé pour étudier le comportement des cardiomyocytes adultes. En outre, les premiers essais de nouvelles stratégies de traitement contre les maladies cardiaques chez les humains peuvent être menées avec CVDA.

La méthode décrite pour l’isolement et la culture des cardiomyocytes adultes contient certains points critiques. Pour obtenir de bons résultats, les éléments suivants doivent être considérés.

1. tolérance de calcium: historiquement, la tolérance de calcium des cardiomyocytes adultes était l’un des facteurs plus critiques, menant à une réussite de l’isolement et culture des cardiomyocytes adultes1,7, 8. de nos jours, les protocoles sont établies pour garantir la culture sous des conditions physiologiques de calcium à1,3. Ce manuscrit montre l’influence d’une concentration de calcium intracellulaire a changé sur la qualité de CVDA isolé. Ionomycine, ce qui augmente les concentrations de calcium intracellulaire, a causé une diminution importante dans la diffusion et une augmentation significative du nombre de cardiomyocytes avec un aspect inhabituel. En outre, il a causé une diminution de l’expression des principaux marqueurs pour cardiaque de - et re - differentiation : β-MHC, OSM et Swiprosin-1. Par conséquent, changement de la concentration intracellulaire en calcium pendant la culture entrave la capacité de CVDA pour s’adapter aux nouveaux environnements. Bien que certains CVDA pouvaient se propager et de s’adapter (9,87 % ± 2,77 % de tous les CVDA comptés ; Figure 5), une enquête précise de CVDA dans ces conditions n’est pas possible. Par conséquent, pour un précis d’isolement et de la culture de CVDA un protocole établi de calcium doit être utilisé. En outre, il convient d’assurer qu’aucun des traitements étudiés interférer avec l’hémostase de calcium de CVDA.

2. collagénase: il existe différents lots de collagénase. Chaque lot montre des différences de qualité et efficacité1. Par conséquent, les auteurs recommandent de commande et analyse d’échantillons de lots différents. En outre, le temps de digestion et de la quantité de collagénase de chaque nouveau lot mises en oeuvre doit être évalué séparément. En conséquence, la concentration et du temps de la digestion dans le protocole décrit peuvent différer légèrement à d’autres protocoles.

3. temps jusqu'à ce que la perfusion cardiaque: pour assurer une haute qualité de CVDA, le temps entre l’extraction au cœur de l’organisme et le début de la perfusion avec le système de Langendorff devrait être aussi court que possible. Une période prolongée provoque des dommages au cœur et se traduit par un nombre plus élevé de CVDA non viables.

En outre, le réchauffement la solution de perfusion au cours de la perfusion et la digestion pendant 5 minutes après que le tissu à découper est essentiel à ce qui donne un bon résultat. Pour éviter des dommages inutiles du tissu biologique, il doit être manipulé avec soin aux points de tous les temps. En outre, il est à noter que le traitement avec l’OSM ou des concentrations plus faibles de FCS permettent également CVDA de - et re - differentiate4,10,18,19. Toutefois, sans ces traitements nutritives, CVDA dégénérée dans quelques jours2.

En conclusion, l’isolement et la culture de CVDA est une méthode sensible qui offre une variété de possibilités d’enquêter sur le comportement des cardiomyocytes adultes exclusivement.

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Disclosures

Les résultats présentés font partie de la thèse de doctorat de Franziska Nippert.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Nadine Woitasky et Peter Volk pour l’assistance technique. En outre, les auteurs remercient Mme Claudia Lorenz (auteur médical, ACCEDIS) pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce manuscrit a été soutenu financièrement par la DFG (Schlu 324/7-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Langendorff perfusion system inhouse construction double-walled with a water
based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm inhouse construction
Abdominal shears Aeskulap BC772R
Capsule forceps Eickemeyer 171307
Dissecting scissor large Aeskulap BC562R
Dissecting scissor small Aeskulap BC163R
Mash with Polyamid Neolab 4-1413 mash size 200 μm
plastic disc Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II Worthington LS004177

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Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte
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Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (128), e56634, doi:10.3791/56634 (2017).

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