Summary
Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.
Abstract
CA2 + gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso e l'efflusso di Ca2 + dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca2 + gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca2 + gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca2 + dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca2 +. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un'alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca2 + in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.
Introduction
I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca2 + deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca2 + 1,2. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti diCa 2 + storage. CA2 + presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza3. Per la regolazione metabolica, Ca2 + migliora l'attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell'acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca2 + e dysregulated mitocondriale Ca2 + movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca2 + trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca2 + segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.
Negli ultimi anni, c'è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca2 + dinamica dovuta in gran parte per l'identificazione dei costituenti molecolari del Ca2 + uniporter mitocondriale complesso, un'interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca2 + importare nella matrice mitocondriale 10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca2 + mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell'uniporter complesso e mitocondriale Ca2 + afflusso a malattia13,14,15. Infatti, Ca2 + segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro16,17,18, 19,20.
Data l'importanza fondamentale di mitocondriale Ca2 + segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca2 + segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca2 + afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca2 + . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca2 +-coloranti sensibili21,22 e geneticamente codificato Ca2 + sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina23, 24. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca2 + l'assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca2 + afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato14 . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM25.
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Protocol
Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University.
Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra.
1. reagenti e soluzioni
- Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH regolato a 7,4 con KOH. Sterilizzarlo attraverso un filtro di 0,22 μm e conservarla a 4 ° C. Assicurarsi che il buffer di MS-EGTA è pre-refrigerato a 4 ° C prima dell'uso.
- Preparare 100 mL di tampone di KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH2PO4, 2mm MgCl2, 40 μM EGTA e pH regolato a 7,2 con KOH. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare calcio 1 mM verde-5N stock in dimetilsolfossido (DMSO). Lo stock di verde-5N di calcio può essere aliquotato e conservato a-20 ° C.
-
Preparare substrati per Ca2 + l'assorbimento.
- Preparare il piruvato di sodio 1 M, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.
- Preparare malate di 500 mM, pH 7.4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.
2. isolamento dei mitocondri cardiaci
- Eutanasia il mouse secondo le norme istituzionali.
Nota: Per il nostro metodo approvato dall'istituzione dell'eutanasia, topi erano anestetizzati per inalazione isofluorano e sacrificati dalla dislocazione cervicale. - Raccogliere il cuore di cavità toracica di apertura, taglio lungo entrambi i lati delle nervature, che fiancheggiano il cuore, tagliando via il diaframma e asportando il tessuto del cuore.
Nota: In questo protocollo, isolamento mitocondriale viene eseguita da un cuore intero raccolto da un topo adulto (circa 120 mg), che dovrebbe essere sufficiente per 3-4 esperimenti. Per l'isolamento mitocondriale da altri tessuti ricchi di mitocondri quali il fegato, fino a 200 mg di tessuto può essere utilizzato seguendo il protocollo descritto. - Sciacquare il tessuto accuratamente in 25 mL di gelida 1x tamponato fosfato salino (PBS) assicurando che tutto il sangue viene spremuto fuori i ventricoli.
Nota: Il cuore viene risciacquato sufficientemente quando il liquido spremuto fuori dal cuore esce pulito. - Tritare il cuore in piccoli pezzi in 5 mL di PBS 1X ghiacciata usando un paio di forbici affilate.
- Scartare il PBS e trasferimento di tessuto cardiaco macinate in un omogeneizzatore di lisata pre-refrigerati 7 mL vetro-teflon con una clearance di 0,10 a 0,15 mm.
- Aggiungere 5 mL di buffer di MS-EGTA ghiacciata e omogeneizzare il campione fino a pezzi di tessuto non sono più visibili (circa 11 colpi).
Nota: Non over-omogeneizzare il tessuto come l'obiettivo è quello di ottenere i mitocondri intatti e funzionali. - Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare l'omogeneizzato a 600 x g a 4 ° C per 5 min a pellet di nuclei e cellule ininterrotte.
- Trasferire il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL e centrifugare esso a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min a pellet mitocondri.
- Scartare il surnatante e tenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.
- Lavare la pallina mitocondriale utilizzando due volte ghiacciata MS-EGTA buffer. Per ogni lavaggio, risospendere il pellet mitocondriale in 5 mL di buffer di MS-EGTA, centrifugare e a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min e scartare il surnatante.
- Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri in 100 μL di tampone di MS-EGTA freddo di ghiaccio. Tenere i mitocondri sul ghiaccio.
Nota: I mitocondri devono essere utilizzati per la sperimentazione entro 1 h. - Misurare la concentrazione di proteina mitocondriale utilizzando un' analisi della proteina di Bradford26.
3. piastra lettore-basato di misurazione dell'assorbimento del calcio mitocondriale
Nota: Qui è descritto il protocollo per l'analisi mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando un lettore di piastra multimodo dotato di iniettori. Qualsiasi piatto lettore con la capacità di lettura di fluorescenza verde-5N calcio (eccitazione/emissione di 506/532 nm) in modalità cinetica con reagente automatizzato possono essere utilizzati iniettori per mantenere la reazione al riparo dalla luce.
- Programma lettore della piastra per eseguire una cinetica leggere di fluorescenza verde-5N calcio con misurazioni effettuate ogni secondo per un tempo di dosaggio totale di 1.000 s. Inoltre, programmare gli iniettori di reagente a dispensare 5 μL di soluzione di CaCl2 ore 30 s, 150 s, 300 s , 480 s e 690 punti di tempo s.
Nota: I tempi di CaCl2 iniezioni sono definiti dall'utente e possono essere adattate per esigenze sperimentali. - Adescare gli iniettori di reagente con la soluzione di CaCl2 deve essere utilizzato.
Nota: La concentrazione della soluzione CaCl2 è definito dall'utente e può essere registrata in esecuzioni successive a titolare la quantità di Ca2 + per attivare MPTP apertura necessaria. - Aggiungere 200 μg di mitocondri in un individuale pozzetto di una piastra ben 96.
- Aggiungere il volume appropriato di buffer di KCl tale che il volume totale dei mitocondri e buffer di KCl nasce a 197 μL.
- Aggiungere 1 μL di piruvato di 1 M e 1 μL di malate di 500 mM per la miscela di mitocondri. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare i mitocondri con i substrati per 2 min a temperatura ambiente per consentire i mitocondri diventare stimolato.
- Aggiungere 1 μL di stock di 1mm del calcio verde-5N. Mescolare delicatamente pipettando.
Nota: Proteggere la reazione dalla luce dopo l'aggiunta del colorante verde-5N calcio. - Avviare il pre-programmati cinetica protocollo e monitor del calcio verde-5N fluorescenza.
4. reagenti e soluzioni
Nota: La seconda parte è una procedura sperimentale per l'imaging confocale di mitocondriale Ca2 + in cellule coltivate
- Rendere la soluzione di Tyrode (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2mm CaCl2, 1mm MgCl2, 10 millimetri di glucosio e 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavaggio (acetato di potassio di 100 mM, 15 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5mm Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0.75 mM MgCl2, fosfocreatina di 10 mM, 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di permeabilizzazione, che contiene saponina 0,005% in soluzione di lavaggio. Prepararlo fresco ogni giorno.
- Preparare 0 Ca2 + soluzione interna (100mm potassio acetato, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH regolato a 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Preparare soluzione interna contenente Ca2 +. Aggiungere CaCl2 per la soluzione interna sopra per raggiungere la concentrazione di Ca libero2 +desiderata. La quantità di CaCl2 per aggiungere viene calcolata utilizzando il programma MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
- Preparare 1 mM Rhod-2/AM brodo in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare 1 mM MitoTracker brodo verde in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
5. placcatura cellule per l'Imaging
- 22x22 cm2 vetrini coprioggetti con etanolo al 100% di lavare e asciugare i vetrini coprioggetto per aria.
- Posizionare i vetrini coprioggetti in singoli pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
Nota: Le lamelle possono essere rivestite con laminina, poli-L-lisina o simile matrice per promuovere l'adesione delle cellule. - Tripsinizzano e le cellule sul lamelle che mira per circa il 70% confluenza il giorno dell'imaging della lastra.
6. caricamento di cellule con il Rhod-2/AM e MitoTracker Green
- Preparare Rhod-2/AM-MitoTracker verde soluzione di lavoro. Aggiungere 20 μL di Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL di Stock in MitoTracker verde 1 mM e 2,5 μL di 20% pluronic F-127 a 1 mL di soluzione di Tyrode. La concentrazione finale di Rhod-2 della soluzione di lavoro è di 20 µM e la concentrazione finale di MitoTracker green è di 200 nM.
- Rimuovere delicatamente il supporto di crescita dal vetrino coprioggetti.
Nota: Un passaggio di lavaggio non è necessario prima dell'aggiunta di soluzione colorante. - Aggiungere il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde in modo goccia a goccia sul coprioggetto finché il coprioggetto è appena coperto (circa 3-4 gocce al vetrino coprioggetti).
- Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce per permettere alle cellule di carico con i coloranti.
- De-esterificare il Rhod-2am. Rimuovere delicatamente il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde e sostituirlo con soluzione di Tyrode fresca temperatura ambiente Incubare 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
7. confocale Imaging del mitocondriale Rhod-2am e fluorescenza MitoTracker Green
- Trasferire il coprioggetto al microscopio imaging camera e riempire la camera con soluzione di lavaggio.
- In impostazioni per l'osservazione di cellule in contrasto di fase a 40x, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule sono visibili e messo a fuoco.
-
Permeabilize membrana plasmatica di Rhod-2/AM-MitoTracker verde caricato celle per rimuovere localizzato cytosol Rhod-2, pur mantenendo la tintura localizzato i mitocondri.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio dal vetrino coprioggetti.
- Sostituirlo con soluzione di permeabilizzazione per circa 1 min.
- Controllare visivamente la morfologia di membrana plasmatica durante tutto il processo di permeabilizzazione. Celle permeabilized svilupperà una superficie ruvida.
- Quando permeabilizzazione è completa, immediatamente rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e sostituirlo con 0 Ca2 + soluzione interna.
- Allo stesso tempo immagine Rhod-2 fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 575-675 nm 559) e MitoTracker verde fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser 488nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 505-525 nm). Concentrarsi su celle permeabilized visualizzati da un chiaro colocalizzazione di Rhod-2 e MitoTracker verde.
- Diminuire il laser di microscopio e impostazioni di guadagno tale che la fluorescenza Rhod-2 mitocondriale è fioca e appena visibile.
- Selezionare impostazioni di microscopio di acquisire scansioni 2-dimensionale di un corso di tasso e tempo di frame appropriato per la specifica applicazione. Un frame rate di almeno 30 fotogrammi/s è consigliato per acquisire con precisione la cinetica dei cambiamenti in mitocondriale Ca2 +.
- Rimuovere la Ca 02 + soluzione interna senza disturbare le celle o la messa a fuoco del microscopio.
- Avviare l'acquisizione di immagini.
- Aggiungere Ca2 +-soluzione interna piena al momento s 10 punto manualmente o con un sistema di perfusione.
- Selezionare le regioni di interesse (ROI) per comprendere le regioni di colocalizzazione tra mitocondriale Rhod-2 e MitoTracker verde segnale del software di acquisizione immagine.
Nota: Per ogni ROI vengono ottenuti i valori di fluorescenza arbitrario (F) per ogni punto di tempo della registrazione. Questi valori sono sfondo sottratto e normalizzato per la fluorescenza iniziale (prima del Ca2 + aggiunta; F0) e tracciate come F/F0 nel corso del tempo per la presentazione dei dati e la quantificazione dell'ampiezza del cambiamento di mitocondriale Ca2 +.
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Representative Results
La figura 1 Mostra mitocondriale Ca2 + misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca2 + tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl2 (5 μL di soluzione di CaCl2 0,6 mM) aggiunti al 30 s, 150 s, 300 s, 480 s e 690 s tempo punti. I tempi e il numero di aggiunte di CaCl2 può essere regolate dall'utente per consentire completo assorbimento mitocondriale di aggiunto Ca2 + prima di successive integrazioni. In questo saggio, aumenti nel segnale verde-5N calcio riflettono i livelli elevati buffer Ca2 + . Come importano i mitocondri Ca2 +, Ca2 + viene rimosso dal buffer e la fluorescenza del verde-5N calcio diminuisce. D'importanza, presso la terza aggiunta di Ca2 +, la curva di fluorescenza verde-5N calcio subisce un'improvvisa e forte inflessione verso l'alto, invece di continuare a rimuovere Ca2 + dal buffer ed è indicata dalla freccia rossa in Figura 1A . Questo improvviso aumento di fluorescenza riflette sovraccarico mitocondriale di Ca2 + e apertura di MPTP. La quantità totale di Ca2 + preso dai mitocondri prima dell'attivazione di MPTP riflette il Ca2 + capacità mitocondriale e può essere espresso come proteina Ca2 +/mg μmol. Regolando i tempi e le concentrazioni di calcio aggiunto, la quantità di Ca2 + necessaria per innescare la transizione di permeabilità può essere determinata. In Figura 1B, i mitocondri sono stati pre-trattati per 10 min a temperatura ambiente con 10 μM Ru360, un inibitore ben caratterizzato del mitocondriale Ca2 + uniporter complesso27. Ru360 inibisce uniporter-mitocondriale Ca2 + assorbimento dipendente, e ciò è dimostrato dagli aumenti graduali in fluorescenza verde-5N calcio seguono ogni Ca2 + aggiunta.
Per formazione immagine confocal di calcio mitocondriale usando Rhod-2/AM, mostriamo i risultati rappresentativi da cellule NIH 3T3. MitoTracker green è un colorante selettivo mitocondri che preferenzialmente le macchie della rete mitocondriale (Figura 2A). A seguito di saponina-mediata permeabilizzazione della membrana plasmatica, citosolica Rhod-2 viene lavato via, lasciando un Rhod-2 macchiato rete mitocondriale che co-localizza con MitoTracker verde (Figura 2A). Rhod-2 può anche accumularsi in strutture non-mitocondriale, così ROI per essere analizzati dovrebbe concentrarsi delle regioni di co-localizzazione tra il MitoTracker verde e Rhod-2. In cellule di controllo, l'aggiunta di Ca2 +-piena soluzione interna contenente 2 μM gratis Ca2 + provoca un rapido aumento della fluorescenza Rhod-2, che è inibita quando uniporter complesso è inibita con 10 μM Ru360 (Figura 2B).
Figura 1: Mitocondriale di Ca2 + assorbimento in mitocondri cardiaci isolati. (A) grafici di fluorescenza verde-5N calcio relativa dei mitocondri del cuore di controllo e dei mitocondri (B) pre-trattati con 10 μM Ru360 per 10 min a temperatura ambiente, sfidati con 5 μL di 0,6 mM CaCl2 (frecce nere). Transizione di permeabilità indotta da sovraccarico mitocondriale Ca2 + è indicata con la freccia rossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi rappresentativa di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized. (A) immagine rappresentativa di fluorescenza delle cellule 3T3 caricato con rhod-2 (rosso) e MitoTracker green (verde) e immagini unite di rhod-2 e MitoTracker verde (giallo) dopo il permeabilization con saponina. (B) traccia di fluorescente Rhod-2 da una cella singola 3T3 durante l'applicazione di 2 µM gratis Ca2 + soluzione interna in condizioni di controllo (traccia nera) o dopo il trattamento preliminare di 10 µM, Ru360 (traccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca2 + . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca2 + livelli ed è una Ca2 + analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso fegato, muscolo scheletrico e nel cervello. Inoltre, il sistema del lettore di piastra può essere un'opzione ideale per i laboratori dove attrezzature specializzate, tradizionalmente utilizzata per Ca2 + misure, come fluorometri, potrebbero non essere immediatamente disponibili. L'arco di tempo limitato di massimo che un lettore può eseguire la scansione e la necessità di pre-programmare aggiunte di reagente può essere un punto debole di questa tecnica rispetto al fluorometri, tuttavia, il costo e la disponibilità di fluorometri può superare questo beneficio. Variando la concentrazione di Ca2 + negli iniettori di reagente, la quantità di Ca2 + che i mitocondri sono in grado di sequestrare prima di far scattare MPTP (il Ca2 + capacità mitocondriale) di apertura può essere determinata.
Il protocollo di imaging confocale che descriviamo per misurazioni Rhod-2/AM di mitocondriale Ca2 + è ideale per le cellule coltivate e può anche essere adattato per cellule primarie. In questo metodo, la membrana plasmatica è permeabilizzata con saponina, che consente l'interruzione della tintura citosolica. Solo colorante intrappolati in organelli rimane dopo questa procedura, che consente la misura accurata e specifica della fluorescenza mitocondriale. Inoltre, questa analisi delle cellule permeabilized permette controllo sperimentale sulla extramitochondrial Ca2 + livelli, nonché a condizioni definite dall'utente in base al quale sono esposti i mitocondri. Rhod-2/AM imaging confocale di mitocondriale Ca2 + può essere utilizzato in cellule intatte, non-permeabilized, ma ciò richiede l'ottimizzazione del carico di tintura e de-esterificazione per garantire un mitocondrio-specifica Rhod-2 localizzazione28. I punti di forza del metodo Rhod-2/AM sono Rhod-2/AM è commercialmente disponibile che il colorante può essere applicato facilmente a un'ampia varietà di tipi cellulari. La localizzazione della tintura Rhod-2, tuttavia, è un limite da prendere in considerazione. Per garantire la misura della fluorescenza Rhod-2 mitocondrio-specifica, un secondo colorante spettralmente distinti, come MitoTracker green, può essere utilizzato per macchiare i mitocondri prima di formazione immagine. Geneticamente codificato Ca2 + sensori mirati ai mitocondri possono aggirare questo problema, tuttavia, le cellule hanno bisogno di essere transfected/trasdotte con il costrutto di sensore e avere abbastanza tempo per esprimere la proteina. Questo non è sempre ideale per cellule primarie con tempo di sopravvivenza limitato e tintura di caricamento può essere un processo ad alta produttività.
In entrambi i protocolli, abbiamo usato l'inibitore complesso uniporter Ru360 per illustrare l'effetto mitocondriale Ca2 + afflusso inibizione. Ru360 è il gold standard per l'inibizione di uniporter e fin qui, è il solo inibitore specifico noto di questo tranporter29. In alternativa, rutenio rosso può essere utilizzato anche, tuttavia, rutenio rosso è un inibitore aspecifico uniporter che ha dimostrato di inibire anche il rilascio di Ca2 + dal reticolo sarcoplasmatico30. Alterata mitocondriale Ca2 + movimentazione può essere un segno di disfunzione mitocondriale, come trasporto2 + Ca uniporter complesso-dipendente è dipendente e per estensione, questo si affida alla funzione a catena respiratoria potenziale di membrana mitocondriale . Così, uncouplers mitocondriale, quali Carbonil cianuro -4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) e Carbonil cianuro m- clorofenil idrazone (CCCP) che dissipano, potenziale di membrana mitocondriale può anche essere utilizzato come controllo composti per inibire mitocondriale afflusso di Ca2 + . Poiché i mitocondri sono siti di immagazzinaggio2 + Ca intracellulare, i mitocondri possono funzionare come Ca2 + buffer all'interno dello spazio intracellulare. Così, alterazioni mitocondriali Ca2 + la gestione possono influenzare la forma del Ca2 + paesaggio citosolico. Considerando il crescente numero di patologie dove dinamica2 + Ca mitocondriale può svolgere un ruolo, i metodi illustrati qui potrebbero essere applicati allo studio di afflusso Ca2 + mitocondriale in modelli animali e modelli cellulari della malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da concedere finanziamenti dall'associazione americana di cuore (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
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