Summary
Här presenterar vi två protokoll för mätning av mitokondriell Ca2 + tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler. För isolerade mitokondrier, vi detalj en plate reader-baserade Ca2 + import assay med de Ca2 + känsliga färga kalcium grön-5N. För odlade celler beskriver vi en konfokalmikroskopi metod där Ca2 + färgämnet Rhod-2/AM.
Abstract
Ca2 + hantering av mitokondrierna är en kritisk funktion som reglerar både fysiologiska och patofysiologiska processer i ett brett spektrum av celler. Förmågan att noggrant mäta inflödet och utflödet av Ca2 + från mitokondrier är viktigt för att fastställa rollen av mitokondriell Ca2 + hantering i dessa processer. I denna rapport presenterar vi två metoder för mätning av mitokondriell Ca2 + hantering både isolerade mitokondrier och odlade celler. Vi detalj först en tallrik läsare-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca2 + upptag med de Ca2 + känsliga dye kalcium grön-5N. Det platta läsare-baserade formatet kringgår behovet av specialutrustning och kalcium grön-5N färgämnet är idealiskt lämpad för att mäta Ca2 + från isolerade vävnaden mitokondrier. För vår ansökan beskriver vi mätning av mitokondriell Ca2 + upptag i mitokondrierna som isolerats från mus hjärta vävnad; dock kan detta förfarande tillämpas för att mäta mitokondriell Ca2 + upptag i mitokondrierna isolerade från andra vävnader såsom levern, skelettmuskel och hjärnan. För det andra beskriver vi en confocal microscopy-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca2 + i permeabilized celler använder Ca2 + känsliga färgämnet Rhod-2/AM och imaging använder 2-dimensionell laserskanning mikroskopi. Detta permeabilisering protokoll eliminerar cytosoliska dye kontaminering, möjliggör specifika inspelning av ändringar i mitokondriell Ca2 +. Dessutom tillåter laserskanning mikroskopi för hög bildfrekvens att fånga snabba förändringar i mitokondriell Ca2 + svar på olika droger eller reagenser som används i den externa lösningen. Detta protokoll kan användas för att mäta mitokondriell Ca2 + upptag i många celltyper inklusive primära celler såsom hjärt myocyter och nervceller och förevigade cellinjer.
Introduction
Mitokondrierna är kritiska platser av intracellulära Ca2 + lagring och signalering. Decennier av forskning har visat att mitokondrierna har förmågan att importera och binda Ca2 + 1,2. Mitokondrier är dock inte bara passiva platser Ca2 + lagring. Ca2 + på mitokondriell facket utför grundläggande signalering funktioner inklusive reglering av metabola utdata och aktivering av mitokondrie-medierad cell death gångvägar, som har granskat tidigare3. För metabolisk reglering ökar Ca2 + aktiviteten hos tre matrix-lokaliserad mellan östradiol och östron av den tricarboxylic syra cykel samt respiratoriska kedja komplex, att öka mitokondriell energi produktion4,5 . Med mitokondriell Ca2 + överbelastning och dysreglerad mitokondriell Ca2 + hantering, Ca2 + utlösare mitokondriell permeabilitet övergången pore (MPTP) öppning, leder till mitokondriell inre membranet vilket, membranet potentiella förlust, mitokondriell dysfunktion, svullnad, brista och i slutändan cell död6,7,8,9. Således, mitokondriell Ca2 + signalering direkt påverkar både cellulära liv och död vägar genom metabol kontroll och MPTP-döden axel.
Under de senaste åren, det har snabbt växande intresse i studien av mitokondriell Ca2 + dynamics förfaller i stor del till att identifiera de molekylära beståndsdelarna av den mitokondriella Ca2 + uniporter complex, en mitokondriell inre membranet transportör som är en primär läge Ca2 + importera till mitokondriella matris 10,11,12. Identifiering av dessa strukturella och reglerande subenheter av uniporter har frambringat möjligheten att genetiskt inriktning mitokondriell Ca2 + inflödet för att modulera mitokondriell funktion och dysfunktion och underlättade studiet av de bidrag av uniporter komplexa och mitokondrie Ca2 + tillströmningen till sjukdom13,14,15. Faktiskt, mitokondriell Ca2 + signalering har varit inblandad i patologier av en mångfald av sjukdomar allt från hjärtsjukdom till neurodegeneration och cancer16,17,18, 19,20.
Med tanke på den grundläggande betydelsen av mitokondriell Ca2 + signalering i metabolism och celldöd, och kombinerat med den breda räckhåll för biologiska system påverkar att mitokondriell Ca2 + signalering, metoder att bedöma mitokondriell Ca2 + tillströmningen är av stort intresse. Inte överraskande, en mängd tekniker och verktyg att mäta mitokondriell Ca2 + har utvecklats. Dessa inkluderar metoder som använder verktyg som fluorescerande Ca2 +-känsliga färgämnen21,22 och genetiskt-kodade Ca2 + sensorer riktade till mitokondrierna, såsom cameleon och aequorin23, 24. Målet med denna artikel är att belysa olika metoder och modellsystem där mitokondrie Ca2 + upptag kan mätas. Vi presenterar två experimentella metoder för att utvärdera mitokondriella Ca2 + tillströmning kapacitet. Med hjärt mitokondrier som exempel, vi detalj en plate reader-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca2 + upptag med de Ca2 + känsliga färga kalcium grön-5N som är idealisk för isolerade vävnaden mitokondrier14 . Med hjälp av odlade NIH 3T3-celler, beskriver vi också en konfokalmikroskopi imaging-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca2 + i permeabilized celler med Ca2 + känsliga färgämnet Rhod-2/AM25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Emory University.
Obs: Den första delen är experimentella förfarandet för mätning mitokondriell Ca2 + tillströmning i isolerade hjärt mitokondrier med hjälp av en tallrik-läsare.
1. reagenser och lösningar
- Gör 500 mL MS-EGTA buffert för mitokondriell isolering: 225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 1 mM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA), pH justeras till 7,4 med KOH. Sterilisera det genom ett 0,22 μm filter och förvara den vid 4 ° C. Se till att MS-EGTA bufferten före kylda till 4 ° C före användning.
- Bereda 100 mL KCl buffert: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA och pH justeras till 7,2 med KOH. Förvara det i rumstemperatur.
- Laga 1 mM kalcium grön-5N lager i dimetyl sulfoxid (DMSO). Kalcium grön-5N beståndet kan vara aliquotted och lagras vid-20 ° C.
-
Förbereda substrat för Ca2 + upptag.
- Laga 1 M natrium pyruvat, pH 7,4. Förvara den i alikvoter vid-20 ° C.
- Förbereda 500 mM malate, pH 7,4. Förvara den i alikvoter vid-20 ° C.
2. isolering av hjärt mitokondrier
- Avliva musen enligt institutionella normer.
Obs: För våra institutionellt godkänd metod för dödshjälp, möss var sövd vid isofluorane inandning och offrades av cervikal dislokation. - Samla in hjärtat genom öppna brösthålan, skära längs vardera sidan av revbenen, flankerande hjärtat, skära bort membranet och excising hjärtat vävnaden.
Obs: I detta protokoll, mitokondriell isolering utförs från en hela hjärtat som samlas in från en vuxen mus (cirka 120 mg), vilket bör räcka för 3-4 experiment. För mitokondriell isolering från andra mitokondrierna-rika vävnader såsom levern, kan upp till 200 mg av vävnad användas efter protokollet beskrivs. - Skölj vävnaden grundligt i 25 mL iskallt 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) att säkerställa att allt blod pressas ur ventriklarna.
Obs: Hjärtat kommer tillräckligt sköljas när vätskan pressas ut ur hjärtat är klart. - Finhacka hjärtat i små bitar i 5 mL iskallt 1 x PBS använder ett par av vass sax.
- Kassera PBS och överföra malet hjärta vävnad till en pre kylda 7 mL glas-teflon dounce Homogenisatorer med 0,10 till 0,15 mm clearance.
- Tillsätt 5 mL iskallt MS-EGTA buffert och Homogenisera provet tills vävnaden bitar är inte längre synlig (cirka 11 linjer).
Obs: Inte alltför homogenisera vävnaden som målet är att få intakt och fungerande mitokondrier. - Överföra Homogenatet till en 15 mL tub.
- Centrifugera Homogenatet vid 600 x g vid 4 ° C i 5 min till pellet kärnor och obruten celler.
- Överför supernatanten till ett färskt 15 mL rör och centrifugera det 10 000 x g vid 4 ° C i ca 10 min till pellet mitokondrier.
- Avlägsna supernatanten och hålla den mitokondriella pelleten på is.
- Tvätta den mitokondriella pelleten två gånger med iskall MS-EGTA buffert. För varje tvätt, Återsuspendera mitokondriell pelleten i 5 mL MS-EGTA buffert, Centrifugera det 10 000 x g vid 4 ° C i 10 min, och kasta bort supernatanten.
- Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten och återsuspendera mitokondrierna i 100 μL av is kalla MS-EGTA buffert. Hålla mitokondrierna på is.
Obs: Mitokondrier bör användas för experiment inom 1 h. - Mäta mitokondriell proteinkoncentration använder en Bradford Protein Assay26.
3. skylt Reader-baserad mätning av mitokondriell kalcium upptag
Obs: Här är det beskrivs i protokollet för analysera mitokondriell Ca2 + upptag med en multimode Plattläsare försedda med spridare. Någon tavla läsaren med möjlighet att läsa kalcium grön-5N fluorescens (excitation/utsläpp av 506/532 nm) i en kinetic läge med automatiserade reagens spridare att hålla reaktionen skyddas från ljus kan användas.
- Program plattan läsaren att utföra en kinetic läsa av kalcium grön-5N fluorescens med mätningarna varje sekund för en analysmetod total tid av 1000 s. Dessutom, programmera reagens spridarna att dosera 5 μL CaCl2 lösning på 30 s, 150 s, 300 s , 480 s och 690 s tidpunkter.
Obs: Tidpunkten för CaCl2 injektioner är användardefinierade, och kan justeras för enligt experimentella behov. - Prime reagens spridarna med CaCl2 lösningen ska användas.
Obs: Koncentrationen av CaCl2 lösningen är användardefinierad och kan justeras i efterföljande körningar att titrera mängden Ca2 + krävs för att utlösa MPTP öppning. - Lägga till 200 μg av mitokondrier i en enskild brunn 96 väl platta.
- Lägg till lämplig volym av KCl buffert till brunnen så att den totala mängden mitokondrier och KCl buffert kommer till 197 μL.
- Tillsätt 1 μL av 1 M pyruvat och 1 μL av 500 mM malate mitokondrier blandningen. Pipettera försiktigt för att blanda och inkubera mitokondrierna med substratesna för 2 min i rumstemperatur så att mitokondrierna att bli strömförande.
- Tillsätt 1 μL av 1 mM kalcium grön-5N lager. Blanda försiktigt genom pipettering.
Obs: Ljuskänsligt reaktionen efter tillägg av kalcium grön-5N färgämnet. - Starta förprogrammerade kinetiska protokoll och övervaka kalcium grön-5N fluorescensen.
4. reagenser och lösningar
Obs: Den andra delen är experimentell förfarande för confocal avbildning av mitokondriell Ca2 + i odlade celler
- Gör Tyrodes lösning (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukos, och 10 mM HEPES, pH 7,2 med KOH). Förvara den vid 4 ° C. Värma det till rumstemperatur före användning.
- Förbered tvättlösningen (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0.35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7,2 med KOH). Förvara den vid 4 ° C. Värma det till rumstemperatur före användning.
- Förbered permeabilisering lösning, som innehåller 0,005% saponin i tvättlösningen. Förbereda den färska dagligen.
- Förbereda 0 Ca2 + intern lösning (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 0.35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH justeras till 7,2 med KOH). Förvara den vid 4 ° C. Värma det till rumstemperatur före användning.
- Förbereda interna lösning innehållande Ca2 +. Lägga till CaCl2 interna lösningen ovan till önskad koncentration av gratis Ca2 +. Mängden CaCl2 lägga till beräknas med hjälp av MaxChelator programmet (maxchelator.stanford.edu).
- Förbereda 1 mM Rhod-2/AM lager i DMSO och lagra den på-20 ° C fram till användning.
- Förbereda 1 mM MitoTracker gröna lager i DMSO och lagra den på-20 ° C fram till användning.
5. plätering celler för avbildning
- Tvätta 22 x 22 cm2 glas coverslips med 100% etanol och låt coverslips att luften torr.
- Placera glas coverslips i enskilda brunnar i en 6-väl vävnadsodling maträtt.
Obs: Coverslips kan vara belagd med laminin, poly-L-lysin eller liknande matris att främja cell fastsättning. - Trypsinize och platta cellerna på den coverslips siktar på cirka 70% sammanflödet på dagen för imaging.
6. lastning celler med Rhod-2/AM och MitoTracker grön
- Förbereda Rhod-2/AM-MitoTracker grön fungerande lösning. Tillsätt 20 μL av Rhod-2/AM 1 mM lager, 0.2 μL av MitoTracker gröna 1 mM lager och 2,5 μl 20% pluronic F-127 1 ml Tyrodes lösning. Den slutliga koncentrationen av Rhod-2 i arbetslösning är 20 µM och MitoTracker grön slutliga koncentration är 200 nM.
- Ta försiktigt bort tillväxtmassmedia från täckglaset.
Obs: En TVÄTTNINGSSTEGET är inte nödvändigt före dye lösning tillägg. - Lägg till den Rhod-2/AM-MitoTracker grön lösning i ett droppvis mode på täckglaset tills täckglaset är bara täckt (cirka 3-4 droppar per täckglas).
- Inkubera det i 30 min i rumstemperatur skyddas från ljus så att cellerna att ladda med färgämnena.
- De esterify Rhod-2/AM. Ta försiktigt bort den Rhod-2/AM-MitoTracker grön lösning, ersätta det med frisk rumstemperatur Tyrodes lösning och inkubera det i 30 min i rumstemperatur skyddas från ljus.
7. confocal Imaging av mitokondriell Rhod-2/AM och MitoTracker grön fluorescens
- Överför täckglaset till mikroskopet imaging kammare och fylla kammaren med tvättlösningen.
- Justera fokus under Inställningar för observation av celler i faskontrast vid 40 X, tills cellerna är synlig och i fokus.
-
Permeabilize plasmamembranet av Rhod-2/AM-MitoTracker grön laddade celler bort cytosol-lokaliserad Rhod-2, bibehållen mitokondrierna-lokaliserad färgämne.
- Avlägsna tvättlösningen från täckglaset.
- Ersätta det med permeabilisering lösning för ca 1 min.
- Visuellt övervaka plasmamembranet morfologi genom hela permeabilisering. Permeabilized celler kommer att utveckla en uppruggad yta.
- När permeabilisering är klar, omedelbart ta bort den permeabilisering lösningen och ersätta det med 0 Ca2 + intern lösning.
- Samtidigt bild Rhod-2 fluorescens (magnetisering med hjälp av 559 nm laserlinje och utsläpp som samlats in vid våglängder mellan 575-675 nm) och MitoTracker grön fluorescens (excitation med hjälp av 488nm laserlinje och utsläpp som samlas in vid våglängder mellan 505-525 nm). Fokusera på permeabilized celler visar en tydlig colocalization Rhod-2 och MitoTracker grön.
- Minska den Mikroskop lasern och få inställningar så att mitokondriell Rhod-2 fluorescensen är dim och bara synlig.
- Välj Mikroskop inställningar att förvärva 2-dimensionella genomsökningar på en lämplig ram hastighet och tid kurs för ansökan. En bildfrekvens på minst 30 bildrutor/s rekommenderas att noggrant fånga kineticsen av ändringar i mitokondriell Ca2 +.
- Ta bort den 0 Ca2 + intern lösning utan att störa de celler eller Mikroskop fokus.
- Börja bild förvärv.
- Lägg till Ca2 +-fylld intern lösning vid tidpunkten för 10 s peka antingen manuellt eller med ett system för perfusion.
- Välj regioner av intresse (ROIs) till att omfatta regioner av colocalization mellan mitokondriell Rhod-2 och MitoTracker grön signal i förvärvet bildbehandlingsprogram.
Obs: Godtyckliga fluorescens (F) värden för varje tidpunkt av inspelningen erhålls för varje ROI. Dessa värden är bakgrunden subtraheras och normaliserade till den inledande fluorescensen (före Ca2 + tillägg; F0) och ritade som F/F0 över tid för presentation av data och kvantifiering av amplituden av ändringen av mitokondriell Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar mitokondriell Ca2 + upptag mätningar i isolerade hjärt mitokondrier med hjälp av plattan läsare-baserade plattformen och den Ca2 + färga kalcium grön-5N. Under kontrollförhållanden (figur 1A), hjärt mitokondrier var upphängd i KCl buffert innehållande kalcium grön-5N och sedan utmanade med sekventiell pulser CaCl2 (5 μL av en 0,6 mM CaCl2 lösning) lagt till vid 30 s, 150 s, 300 s, 480 s och 690 s tidpunkter. Timing och antal CaCl2 tillägg kan justeras av användaren att möjliggöra komplett mitokondriellt upptag av tillsatt Ca2 + före senare tillägg. I denna analys reflekterar ökningar av kalcium grön-5N signal förhöjda buffert Ca2 + nivåer. Eftersom mitokondrierna importera Ca2 +, minskar Ca2 + avlägsnas från bufferten och kalcium grön-5N fluorescensen. Ännu viktigare, på tredje tillägg av Ca2 +, kalcium grön-5N fluorescens kurvan genomgår en plötslig och kraftig böjning uppåt, istället för att fortsätta att ta bort Ca2 + från bufferten och indikeras av den röda pilen i figur 1A . Denna plötsliga ökning fluorescens återspeglar mitokondriell Ca2 + överbelastning och MPTP öppning. Den totala mängden Ca2 + tas upp av mitokondrier före MPTP aktivering återspeglar den mitokondriella Ca2 + kapaciteten, och kan uttryckas som μmol Ca2 +/mg protein. Genom att göra justeringar i timing och koncentration av kalcium lagt, mängden Ca2 + krävs för att utlösa kan permeabilitet övergången bestämmas. I figur 1B, mitokondrierna var förbehandlade under 10 minuter vid rumstemperatur med 10 μM Ru360, en välkarakteriserad hämmare av mitokondrie Ca2 + uniporter komplexa27. Ru360 hämmar uniporter-beroende mitokondriell Ca2 + upptag, och detta styrks av de stegvisa ökningarna i kalcium grön-5N fluorescens efter varje Ca2 + tillägg.
För confocal imaging av mitokondriell kalcium använder Rhod-2/AM, visar vi de representativa resultat från NIH 3T3-celler. MitoTracker green är en mitokondrier-selektiv färgämne som prioriterat fläckar mitokondriell nätverket (figur 2A). Efter saponin-medierad permeabilisering av plasmamembranet, cytosoliska Rhod-2 tvättas bort, lämnar en Rhod-2 färgade mitokondriell nätverk som lokaliserar samarbete med MitoTracker grön (figur 2A). Rhod-2 kan även ackumuleras i icke-mitokondriell strukturer, så ROI analyseras bör fokus för regioner av samtidig localization mellan MitoTracker green och Rhod-2. I kontroll celler, tillägg av en Ca2 +-fylld inre lösning innehållande 2 μM gratis Ca2 + orsakar en snabb ökning Rhod-2 fluorescens, som hämmas när uniporter komplexa hämmas med 10 μM Ru360 (figur 2B).
Figur 1: Mitokondriell Ca2 + upptag i isolerade hjärt mitokondrier. (A) grafer av relativa kalcium grön-5N fluorescens av kontroll hjärtat mitokondrier och (B) mitokondrier förbehandlade med 10 μM Ru360 under 10 minuter vid rumstemperatur, utmanade med 5 μL av 0.6 mM CaCl2 (svarta pilar). Mitokondriell Ca2 + överbelastning-inducerad permeabilitet övergången indikeras med den röda pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ analys av mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler. (A) representativa fluorescens bild av 3T3-celler laddad med rhod-2 (röd) och MitoTracker grön (grön) och sammanslagna bilder av rhod-2 och MitoTracker grön (gul) efter permeabilisering med saponin. (B) Rhod-2 fluorescerande spår från en enda 3T3 cell under tillämpningen av 2 µM gratis Ca2 + intern lösning under kontrollförhållanden (svart trace) eller efter 10 µM Ru360 förbehandling (röda spår). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi två olika metoder för att mäta mitokondriell Ca2 + tillströmning. Den plattan läsare-baserade kalcium grön-5N metod bildskärmar extramitochondrial Ca2 + nivåer och är en Ca2 + upptag som lämpar sig väl för mätningar i isolerade mitokondrier. Medan vi har visat representativa resultat från isolerade murina hjärt mitokondrier, kan denna analys lätt anpassas för mitokondrierna isolerade från vävnader med hög mitokondriell överflöd inklusive lever, skelettmuskel och hjärnan. Plate reader systemet kan dessutom vara ett idealiskt alternativ för laboratorier där specialutrustning som traditionellt används för Ca2 + mätningar, som fluorometers, inte kanske är omedelbart tillgängliga. Den begränsa maximal tidsrymd att en Plattläsare kan skanna och behovet av att pre program reagens tillägg kan vara en svaghet i denna teknik jämfört med fluorometers, dock kostnaden och tillgänglighet av fluorometers kan uppväga denna förmån. Genom att variera koncentrationen av Ca2 + i reagens spridarna, kan mängden Ca2 + att mitokondrier kan binda innan utlöser MPTP öppning (den mitokondriella Ca2 + kapaciteten) bestämmas.
Confocal imaging protokollet som vi beskriver för Rhod-2/AM mätningar av mitokondriell Ca2 + är idealisk för odlade celler och kan även anpassas för primära celler. I denna metod, är plasmamembranet permeabilized med saponin, som möjliggör blekt cytosoliska färgämne. Endast dye anhållna i organeller kvarstår efter detta förfarande, som medger noggrann och specifik mätning av mitokondriell fluorescens. Dessutom tillåter denna permeabilized cell analys för experimentell kontroll över extramitochondrial Ca2 + nivåer samt användardefinierade villkor under vilka mitokondrierna är utsatta. Rhod-2/AM confocal avbildning av mitokondriell Ca2 + kan användas i intakt, icke-permeabilized celler men detta kräver optimering av färgämne lastning och avinstallation förestring att säkerställa en mitokondrier-specifika Rhod-2 lokalisering28. Styrkan i metoden Rhod-2/AM är att Rhod-2/AM är kommersiellt tillgängliga och färgen kan lätt appliceras på en mängd olika celltyper. Localizationen av Rhod-2 färgämnet, är dock en begränsning kan anses vara. För att säkerställa att mätningen av mitokondrier-specifika Rhod-2 fluorescens, kan ett andra spektralt och distinkta färgämne, såsom MitoTracker gröna, användas att färga mitokondrier före imaging. Genetiskt-kodade Ca2 + sensorer riktade till mitokondrierna kan kringgå det här problemet, men cellerna behöver transfekterade/sensorik med den sensor konstruktionen och har tillräckligt med tid att uttrycka proteinet. Detta är inte alltid perfekt för primära celler med begränsad överlevnadstid och färgämne lastning kan vara en tidsbesparande process.
I båda protokollen använde vi den komplexa uniporter-hämmaren Ru360 för att illustrera effekten mitokondriell Ca2 + tillströmning hämning. Ru360 är den gyllene standarden för uniporter hämning och hittills, det är den enda kända specifika hämmaren av denna tranporter29. Alternativt, rutenium röd kan också användas, dock rutenium röd är en ospecifik uniporter-hämmare som har visat sig också hämma Ca2 + release från sarkoplasmatiska nätmagen30. Nedsatt mitokondriell Ca2 + hantering kan vara ett tecken på mitokondriell dysfunktion, som uniporter komplex-beroende Ca2 + transport är mitokondriella membranpotential beroende, och i förlängningen, detta är beroende av respiratoriska kedja funktion . Således, mitokondriella uncouplers, såsom karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) och karbonyl cyanid m- klorfenyl Hydrazon (CCCP) som skingra mitokondriella membranpotential, kan även användas som kontroll föreningar för att hämma mitokondriell Ca2 + tillströmning. Eftersom mitokondrierna är webbplatser av intracellulära Ca2 + lagring, kan mitokondrier fungera som Ca2 + buffertar inom intracellulära utrymmet. Således kan förändringar i mitokondriell Ca2 + hantering påverka formen av cytosoliska Ca2 + landskapet. Med tanke på det växande antalet sjukdomstillstånd där mitokondrie Ca2 + dynamics kan spela en roll, de metoder som illustreras här skulle kunna tillämpas på studiet av mitokondriell Ca2 + tillströmningen i djurmodeller och cellulära modeller av den sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar till rapport.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidragsfinansiering från den amerikanska hjärtat Association (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A. Calcium signaling in cardiac mitochondria. J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
