Biochemistry

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Published: April 27, 2018 doi: 10.3791/57225

Joshua T. Maxwell¹, Chin-Hsien Tsai¹, Tahmina A. Mohiuddin², Jennifer Q. Kwong¹

¹Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ²Emory College of Arts and Sciences, Emory University

Summary

نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca^{2 +} تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca^{2 +} استيراد الفحص باستخدام Ca^{2 +} حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca^{2 +} صبغ Rhod-2/م.

Abstract

Ca^{2 +} التعامل مع الميتوكوندريا وظيفة هامة في تنظيم العمليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية سواء في مجموعة واسعة نطاق من الخلايا. القدرة على قياس التدفق وافلوكس من Ca^{2 +} من الميتوكوندريا بدقة مهم لتحديد دور المتقدرية Ca^{2 +} المناولة في هذه العمليات. وفي هذا التقرير، نقدم طريقتين لقياس المتقدرية Ca^{2 +} المناولة في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. أولاً أننا تفاصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس المتقدرية Ca^{2 +} الإقبال على استخدام Ca^{2 +} صبغة حساسة الكالسيوم الأخضر-5N. تنسيق المستندة إلى قارئ لوحة تلتف الحاجة إلى المعدات المتخصصة، وصبغ أخضر-5N الكالسيوم مثالي لقياس Ca^{2 +} من الميتوكوندريا الأنسجة المعزولة. لطلبنا، يصف لنا قياس Ca^{2 +} امتصاص المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القلب الماوس؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء لقياس المتقدرية Ca^{2 +} الإقبال في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة أخرى مثل الكبد، والعضلات، والدماغ. وثانيا، يصف لنا تحليل القائم على الفحص المجهري [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca^{2 +} في الخلايا بيرميبيليزيد استخدام Ca^{2 +} حساسة صبغ Rhod-2/صباحا والتصوير المجهري ليزر المسح ثنائي الأبعاد باستخدام. يزيل هذا البروتوكول بيرميبيليزيشن صبغ سيتوسوليك التلوث، مما يسمح لتسجيل محددة من التغييرات في كاليفورنيا المتقدرية^{2 +}. وعلاوة على ذلك، يسمح ليزر المسح المجهري للإطار معدلات عالية لالتقاط التغييرات السريعة في المتقدرية Ca^{2 +} استجابة لمختلف العقاقير أو الكواشف المطبقة في الحل الخارجي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على قياس المتقدرية Ca^{2 +} الإقبال في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية مثل myocytes القلب والخلايا العصبية، وخطوط الخلية مخلدة.

Introduction

الميتوكوندريا هي المواقع الحاسمة من Ca^{2 +} مخزن داخل الخلايا والإشارات. عقود أبحاث أظهرت أن الميتوكوندريا لديها القدرة على الاستيراد، وتنحية Ca^{2 +} ¹^،². الميتوكوندريا، ومع ذلك، ليست المواقع مجرد السلبي من Ca^{2 +} مخزن. Ca^{2 +} في حجرة المتقدرية يؤدي وظائف الإشارات الأساسية بما في ذلك تنظيم المخرجات الأيضية وتفعيل مسارات الموت المتقدرية يتوسط الخلية، التي تم استعراضها سابقا³. للتنظيم الأيضي، Ca^{2 +} يعزز نشاط ثلاثة dehydrogenases المترجمة بمصفوفة دورة حمض تريكاربوكسيليك، فضلا عن مجمعات سلسلة التنفس، لزيادة إنتاج الطاقة المتقدرية⁴^،⁵. مع المتقدرية Ca^{2 +} التحميل الزائد و dysregulated المتقدرية Ca^{2 +} المناولة، المسام Ca^{2 +} مشغلات نفاذية المتقدرية الانتقال افتتاح (MPTP)، مما يؤدي إلى بيرميبيليزيشن المتقدرية الغشاء الداخلي، تمزق الأغشية الخسارة المحتملة، خلل mitochondrial، تورم، وفي نهاية المطاف، الخلية وفاة⁶^،⁷^،^،من⁸⁹. وهكذا، Ca^{2 +} إشارات المتقدرية تؤثر تأثيراً مباشرا الحياة الخلوية ومسارات الموت عن طريق السيطرة الأيضية ومحور MPTP الموت.

في السنوات الأخيرة، هناك وقد تم التوسع بسرعة الاهتمام بدراسة المتقدرية Ca^{2 +} ديناميات المستحقة في جزء كبير لتحديد مكونات جزيئية من Ca^{2 +} أونيبورتير المتقدرية المعقدة، الداخلية المتقدرية استيراد غشاء الناقل الذي وضع الأولية من Ca^{2 +} إلى¹¹^،^،من ¹⁰مصفوفة المتقدرية¹². تحديد هذه الوحدات الفرعية الهيكلية والتنظيمية أونيبورتير قد أوجد إمكانية استهداف وراثيا المتقدرية Ca^{2 +} تدفق تعدل وظيفة الميتوكوندريا والخلل وتيسير الدراسة مساهمة من أونيبورتير المعقدة والمتقدريه Ca^{2 +} التدفق للمرض¹³^،^،من¹⁴¹⁵. والواقع أن mitochondrial Ca^{2 +} إشارات قد تورط في الأسباب المرضية لمجموعة متنوعة من الأمراض بدءاً من أمراض القلب نيوروديجينيريشن، وسرطان¹⁶^،^،من¹⁷¹⁸^،^،من ¹⁹²⁰.

نظراً لأهمية أساسية المتقدرية Ca^{2 +} إشارات في الأيض وموت الخلايا، وجنبا إلى جنب مع نطاق واسع من النظم البيولوجية أن Ca^{2 +} إشارات المتقدرية الآثار، أساليب تقييم المتقدرية Ca^{2 +}تدفق ذات أهمية كبيرة. وليس من المستغرب، وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات وأدوات لقياس Ca المتقدرية^{2 +} . وتشمل هذه الأساليب التي تستخدم أدوات مثل Ca نيون^{2 +}-الأصباغ الحساسة²¹^،²² المرمزة وراثيا Ca^{2 +} وأجهزة الاستشعار والموجهة إلى الميتوكوندريا، مثل cameleon وأيكوورين²³^، ²⁴. والهدف من هذه المقالة هو تسليط الضوء على مختلف أساليب ونظم النموذجي الذي يمكن أن يقاس Ca^{2 +} امتصاص المتقدرية. نحن نقدم طريقتين تجريبية لتقييم المتقدرية Ca^{2 +} تدفق القدرة. استخدام الميتوكوندريا القلب على سبيل مثال، نحن بالتفصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس Ca المتقدرية^{2 +} صبغ الإقبال على استخدام Ca^{2 +} حساسة الكالسيوم الأخضر-5N مثالي للأنسجة المعزولة الميتوكوندريا¹⁴. باستخدام خلايا 3T3 المستزرعة في المعاهد الوطنية للصحة، يصف لنا أيضا تحليل القائم على تصوير مجهرية [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca^{2 +} في الخلايا بيرميبيليزيد باستخدام Ca^{2 +} حساسة صبغ Rhod-2/ص²⁵.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة أموري.

ملاحظة: الجزء الأول هو الإجراء التجريبي لقياس المتقدرية Ca^{2 +} تدفق في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام قارئ لوحة.

1-الكواشف والحلول

جعل 500 مل من مرض التصلب العصبي المتعدد-عطا المخزن المؤقت لعزل المتقدرية: المانيتول 225 مم، 75 مم السكروز، 5 ملم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس)، 1 مم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)، عدلت إلى 7.4 درجة الحموضة مع كوه. تعقيم أنه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية. التأكد من أن المخزن المؤقت MS اجتا مبردة مسبقاً إلى 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
إعداد 100 مل بوكل المخزن المؤقت: ضبط 125 ملم بوكل، 20 ملم حبيس ومم 1 خ₂ص₄، 2 مم مجكل₂، 40 ميكرومتر عطا ودرجة الحموضة إلى 7.2 مع كوه. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
يعد الكالسيوم 1 مم الأسهم الخضراء-5N في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). الأسهم الخضراء-5N الكالسيوم يمكن أن يكون الكوتيد وتخزينها في-20 درجة مئوية.
تعد ركائز لامتصاص Ca^{2 +} .
1. إعداد بيروفات صوديوم 1 م، درجة الحموضة 7.4. قم بتخزينها في مختبرين في-20 درجة مئوية.
2. إعداد مالات 500 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. قم بتخزينها في مختبرين في-20 درجة مئوية.

2-عزل الميتوكوندريا القلب

Euthanize الماوس وفقا للمعايير المؤسسية.
ملاحظة: لأسلوبنا المعتمدة مؤسسياً للقتل الرحيم، تم تخديره باستنشاق إيسوفلوراني وضحى بخلع عنق الرحم الفئران.
جمع القلب عن طريق فتح تجويف الصدر، وقطع على طول جانبي الأضلاع، المرافقة القلب، قطع بعيداً من الحجاب الحاجز، ونسق أنسجة القلب.
ملاحظة: يتم عزل المتقدرية في هذا البروتوكول، من قلب كلها التي جمعت من ماوس الكبار (حوالي 120 ملغ)، التي ينبغي أن تكون كافية لإجراء تجارب عليها 3-4. لعزل المتقدرية من الأنسجة الميتوكوندريا الغنية الأخرى مثل الكبد، يمكن استخدام ما يصل إلى 200 مغ أنسجة يتبع البروتوكول وصف.
شطف الأنسجة في 25 مل من المثلج 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ضمان أن محشورة كل الدم خارج البطينين دقة.
ملاحظة: القلب سوف يكون بما فيه الكفاية تشطف عند تشغيل السائل وتقلص من القلب واضحة.
تخطر على القلب إلى قطع صغيرة في 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج 1 x باستخدام مقص حاد.
تجاهل برنامج تلفزيوني ونقل أنسجة القلب مفروم الخالطون دونس تفلون زجاج مل 7 مبردة مسبقاً مع إزالة 0.10 إلى 0.15 مم.
إضافة 5 مل من المثلج MS-عطا العازلة، ومجانسة العينة حتى قطع الأنسجة لم تعد مرئية (حوالي 11 السكتات الدماغية).
ملاحظة: عدم تجانسه الإفراط الأنسجة كما أن الهدف الحصول على الميتوكوندريا سليمة والوظيفية.
نقل هوموجيناتي إلى أنبوب 15 مل.
الطرد المركزي في هوموجيناتي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بيليه الأنوية والخلايا غير منقطعة.
نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد 15 مل والطرد المركزي أنه في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بيليه الميتوكوندريا.
تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه المتقدرية على الجليد.
أغسل بيليه المتقدرية مرتين باستخدام المخزن المؤقت MS-عطا المثلج. لكل غسل، ريسوسبيند بيليه المتقدرية في 5 مل من مرض التصلب العصبي المتعدد-اجتا المخزن المؤقت والطرد المركزي أنه في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
وبعد الغسيل النهائي، تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الميتوكوندريا في 100 ميكروليتر من الجليد الباردة مرض التصلب العصبي المتعدد-عطا المخزن المؤقت. تبقى الميتوكوندريا على الجليد.
ملاحظة: يجب استخدام الميتوكوندريا للتجريب ضمن ح 1.
قياس تركيز البروتين المتقدرية باستخدام "مقايسة البروتين برادفورد"²⁶.

3-لوحة القياس القائم على القارئ لامتصاص الكالسيوم المتقدرية

ملاحظة: هنا، وصف البروتوكول لتحليل المتقدرية Ca^{2 +} الإقبال على استخدام قارئ لوحة المتعدد مزودة بالحقن. أي لوحة قارئ مع القدرة على قراءة الكالسيوم الفلورية الخضراء-5N (الإثارة/الانبعاثات من 506/532 nm) في وضع حركية مع الكاشف الآلي يمكن استخدامها عن طريق الحقن للحفاظ على رد فعل محمية من الضوء.

برنامج قراءة للقارئ لوحة للقيام الحركية من الكالسيوم الفلورية الخضراء-5N مع القياسات التي اتخذت كل ثانية لوقت فحص إجمالي 1000 س. بالإضافة إلى ذلك، برنامج الحقن كاشف الاستغناء عن 5 ميكروليتر كاكل₂ الحل في 30 ثانية، 150 s، 300 s ، 480 s، و 690 النقاط الزمنية s.
ملاحظة: توقيت الحقن₂ كاكل المعرفة من قبل المستخدم، ويمكن تعديلها لوفقا للاحتياجات التجريبية.
رئيس الوزراء كاشف عن طريق الحقن مع الحل₂ كاكل لاستخدامها.
ملاحظة: تركيز الحل₂ كاكل هو المعرفة من قبل المستخدم، ويمكن تعديلها في تشغيل اللاحقة تيتراتي مقدار Ca^{2 +} مطلوب لتحريك فتح مبتب.
إضافة 200 ميكروغرام من الميتوكوندريا إلى بئر فردية من صفيحة جيدا 96.
إضافة حجم المخزن المؤقت بوكل المناسبة للبئر أن إجمالي حجم الميتوكوندريا والمخزن المؤقت بوكل يأتي إلى 197 ميكروليتر.
إضافة 1 ميكروليتر من بيروفات م 1 و 1 ميكروليتر من مالات 500 ملم إلى الخليط الميتوكوندريا. بيبيت بلطف مزيج، واحتضان الميتوكوندريا مع ركائز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح الميتوكوندريا تصبح نشطة.
أضف 1 ميكروليتر من الأسهم الخضراء-5N الكالسيوم 1 مم. المزيج بلطف بيبيتينج.
ملاحظة: حماية رد فعل من الضوء بعد إضافة الصبغة الخضراء-5N الكالسيوم.
ابدأ مبرمجة مسبقاً الحركية البروتوكول ورصد الكالسيوم الأخضر-5N الأسفار.

4-الكواشف والحلول

ملاحظة: الجزء الثاني إجراء تجريبي لتصوير [كنفوكل] المتقدرية Ca^{2 +} في الخلايا المستزرعة

جعل الحل في تيرودي (130 مم كلوريد الصوديوم، 4 مم بوكل، 2 مم كاكل₂، 1 مم مجكل₂، الجلوكوز 10 ملم، و 10 ملم حبيس، الرقم الهيدروجيني 7.2 مع كوه). تخزينها في 4 درجات مئوية. الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
إعداد "الحل أغسل" (خلات البوتاسيوم 100 مم، 15 ملم بوكل، 5 مم خ₂ص₄، 5 مم مغ-ATP، 0.35 مم عطا، مم 0.12 كاكل₂، 0.75 مم مجكل₂، phosphocreatine 10 مم، 10 مم حبيس، الرقم الهيدروجيني 7.2 مع كوه). تخزينها في 4 درجات مئوية. الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
إعداد "حل بيرميبيليزيشن"، التي تحتوي على صابونين 0.005 في المائة في "الحل الغسيل". إعداد من صحيفة يومية جديدة.
إعداد 0 Ca^{2 +} "حل داخلي" (خلات البوتاسيوم 100 مم، 15 ملم بوكل، 0.35 مم عطا، 0.75 مم مجكل₂، 10 مم حبيس، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 7.2 مع كوه). تخزينها في 4 درجات مئوية. الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
إعداد حل داخلي يتضمن Ca^{2 +}. إضافة كاكل₂ إلى حل داخلي أعلاه للوصول إلى تركيز المطلوب Ca مجانية^{2 +}. ويحسب مبلغ كاكل₂ لإضافة باستخدام برنامج ماكستشيلاتور (maxchelator.stanford.edu).
إعداد 1 مم الأسهم Rhod-2/صباحا في [دمس] وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
إعداد 1 مم ميتوتراكير الأسهم الخضراء في [دمس] وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5-طلاء الخلايا للتصوير

أغسل 22 × 22 سم² زجاج كوفيرسليبس مع الإيثانول 100% والسماح كوفيرسليبس للهواء الجاف.
ضع كوفيرسليبس الزجاج في الآبار الفردية من طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا.
ملاحظة: يمكن أن تكون مغلفة كوفيرسليبس مع laminin أو بولي-L-يسين مصفوفة مشابهة لتعزيز مرفق خلية.
تريبسينيزي ولوحة الخلايا على كوفيرسليبس تهدف لالتقاء 70% تقريبا في يوم التصوير.

6-تحميل خلايا مع Rhod-2/صباحا والأخضر ميتوتراكير

إعداد Rhod-2/ص-ميتوتراكير الأخضر حل عملي. إضافة 20 ميكروليتر من Rhod-2/ص 1 مم من الأوراق المالية، ميكروليتر 0.2 من الأسهم الخضراء 1 مم ميتوتراكير، وميكروليتر 2.5 من بلورونيك 20% F-127 إلى 1 مل تيرودي لإيجاد حل. التركيز النهائي Rhod-2 في الحل العامل 20 ميكرومتر وتركيز ميتوتراكير الأخضر النهائي هو 200 نانومتر.
بلطف قم بإزالة وسائط النمو من ساترة.
ملاحظة: خطوة غسيل غير ضروري قبل إضافة صبغة الحل.
إضافة Rhod-2/ص-ميتوتراكير الأخضر الحل بطريقة دروبويسي على ساترة حتى ساترة مجرد تغطية (حوالي 3-4 قطرات كل ساترة).
تبني عليه مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء للسماح بتحميل مع الصبغات الخلايا.
استيريفي دي Rhod-2/صباحا. إزالة بلطف Rhod-2/ص-ميتوتراكير الأخضر الحل واستبدالها بالحل درجة حرارة الغرفة جديدة تيرودي واحتضان أنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.

7-[كنفوكل] تصوير المتقدرية Rhod-2/صباحا والفلورية الخضراء ميتوتراكير

نقل ساترة للمجهر التصوير الدائرة وملء الدائرة مع الحل الغسيل.
ضمن إعدادات مراقبة الخلايا في مرحلة التباين في 40 X, ضبط التركيز حتى تكون الخلايا مرئية وفي التركيز.
بيرميبيليزي غشاء البلازما Rhod-2/ص-ميتوتراكير الأخضر تحميل خلايا لإزالة Rhod المترجمة سيتوسول-2، مع احتفاظها بصبغة محلية الميتوكوندريا.
1. إزالة "الحل أغسل" من ساترة.
2. استبدلها بحل Permeabilization لحوالي 1 دقيقة.
3. رصد بصريا مورفولوجية غشاء البلازما خلال عملية بيرميبيليزيشن. وسيضع الخلايا بيرميبيليزيد على سطح خشن.
4. عند الانتهاء من بيرميبيليزيشن، فورا إزالة "الحل بيرميبيليزيشن" واستبدله بكاليفورنيا 0^{2 +} "حل داخلي".
في نفس الوقت الصورة الفلورية Rhod-2 (الإثارة باستخدام خط الليزر نانومتر والانبعاثات التي تم جمعها في الأطوال الموجية بين nm 575-675 559) والأسفار ميتوتراكير الخضراء (الإثارة باستخدام خط الليزر 488nm والانبعاثات التي يتم جمعها في الأطوال الموجية بين 505-525 نانومتر). وتركز على خلايا بيرميبيليزيد عرض كولوكاليزاتيون واضحة Rhod-2 وميتوتراكير الأخضر.
إنقاص مجهر الليزر والحصول على الإعدادات تكون الأسفار Rhod-2 المتقدرية خافت ومرئية فقط.
حدد إعدادات المجهر للحصول على مسح ثنائي الأبعاد في دورة الوقت ومعدل إطار مناسب لتطبيق معين. معدل الإطارات من الإطارات/ثانية على الأقل 30 المستحسن لالتقاط بدقة حركية التغييرات في كاليفورنيا المتقدرية^{2 +}.
إزالة 0 Ca^{2 +} "حل داخلي" دون الإخلال بالخلايا أو تركيز المجهر.
بدء الحصول على الصور.
إضافة Ca^{2 +}-"حل داخلي" حافل في الوقت دا 10 نقطة أما يدوياً أو باستخدام نظام التروية.
تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) بحيث تشمل مناطق كولوكاليزيشن بين الميتوكوندريا Rhod-2 والإشارات ميتوتراكير الخضراء في صورة اقتناء البرمجيات.
ملاحظة: يتم الحصول على قيم fluorescence التعسفي (و) لكل نقطة وقت التسجيل لكل عائد الاستثمار. هذه القيم خلفية تطبيع للأسفار الأولى (قبل Ca^{2 +} إضافة؛ وطرح و₀) ورسم ك F/F₀ مع مرور الوقت لعرض البيانات وتقدير السعة لتغيير المرجع المصدق المتقدرية^{2 +}.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 Ca المتقدرية^{2 +} قياسات الامتصاص في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام منصة المستندة إلى قارئ لوحة و Ca^{2 +} صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. تحت ظروف التحكم (الشكل 1A)، علقت في المخزن المؤقت بوكل المحتوية على الكالسيوم الأخضر-5N الميتوكوندريا القلب وتحدي ثم مع نبضات متتابعة من كاكل₂ (5 ميكروليتر من 0.6 مم الحل₂ كاكل) إضافة 30 ثانية، 150 ق، 300 s، 480 s، والنقاط الزمنية s 690. يمكن ضبط توقيت وعدد من الإضافات₂ كاكل من المستخدم للسماح بامتصاص المتقدرية كاملة لإضافة Ca^{2 +} قبل إضافات لاحقة. في هذا التحليل، وتعكس الزيادات في إشارة خضراء-5N الكالسيوم Ca^{2 +} مستويات مرتفعة من المخزن المؤقت. الميتوكوندريا استيراد Ca^{2 +}, Ca^{2 +} تتم إزالة من المخزن المؤقت والفلورية الخضراء-5N الكالسيوم النقصان. الأهم من ذلك، في الإضافة الثالثة من Ca^{2 +}، منحنى الفلورية الخضراء-5N الكالسيوم يخضع نبرة مفاجئة وحادة صعودا، بدلاً من الاستمرار في إزالة Ca^{2 +} من المخزن المؤقت وهو مبين بالسهم الأحمر في الشكل 1A . وتعكس هذه الزيادة المفاجئة في الأسفار المتقدرية Ca^{2 +} التحميل الزائد وفتح مبتب. المبلغ الإجمالي ل Ca^{2 +} تناول الميتوكوندريا قبل تفعيل MPTP يجسد mitochondrial Ca^{2 +} القدرة، ويمكن التعبير عنها ك μmol Ca^{2 +}/mg بروتين. بإجراء تعديلات على توقيت وتركيزات الكالسيوم وأضاف مبلغ Ca^{2 +} مطلوب لتشغيل يمكن تحديد نفاذية انتقالية. كانت مرحلة ما قبل المعالجة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع 10 ميكرومترات في الشكل 1B، الميتوكوندريا Ru360، مثبط تتسم جيدا من المتقدرية Ca^{2 +} أونيبورتير معقدة²⁷. يمنع Ru360 أونيبورتير-تعتمد على المتقدرية Ca^{2 +} امتصاص، ويدل على ذلك ارتفاع تدريجي في الكالسيوم الفلورية الخضراء-5N عقب كل Ca^{2 +} إضافة.

[كنفوكل] التصوير من الكالسيوم المتقدرية استخدام Rhod-2/ص، نعرض نتائج تمثيلية من الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة. ميتوتراكير الأخضر هو صبغة الميتوكوندريا انتقائية بشكل تفضيلي البقع الشبكة المتقدرية (الشكل 2A). عقب وساطة صابونين permeabilization من غشاء البلازما، سيتوسوليك Rhod-2 هو جرف، تاركاً Rhod-2 الملون شبكة الميتوكوندريا التي يموضع شارك مع الأخضر ميتوتراكير (الشكل 2A). كما قد تتراكم Rhod-2 في هياكل غير المتقدرية، ذا عائد الاستثمار يتم تحليلها ينبغي تركيز مناطق توطين المشارك بين الأخضر ميتوتراكير و Rhod-2. في مراقبة الخلايا، إضافة Ca^{2 +}-حل داخلي حافل يتضمن 2 ميكرومتر مجانية Ca^{2 +} يسبب ارتفاعا سريعاً في الأسفار Rhod-2، التي تحول دون عندما تحول دون أونيبورتير المعقدة مع 10 ميكرومترات Ru360 (الشكل 2).

الشكل 1: Mitochondrial Ca^{2 +} الإقبال في الميتوكوندريا القلب معزولة. (أ) الرسوم بيانية الأسفار الأخضر-5N الكالسيوم النسبي لمراقبة القلب الميتوكوندريا والميتوكوندريا (ب) قبل التعامل مع 10 ميكرومترات تحدي Ru360 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع 5 ميكروليتر من 0.6 مم كاكل₂ (الأسهم السوداء). تتم الإشارة إلى المتقدرية Ca^{2 +} نفاذية الناجم عن الحمل الزائد للانتقال مع السهم الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2: تحليل الممثل المتقدرية Ca^{2 +} في الخلايا بيرميبيليزيد. (أ) تحميل الصورة fluorescence الممثل من الخلايا 3T3 rhod-2 (أحمر) والأخضر ميتوتراكير (الأخضر) والصور المدمجة rhod-2 وميتوتراكير الأخضر (أصفر) بعد بيرميبيليزيشن مع صابونين. (ب) Rhod-2 تتبع الفلورسنت من خلية واحدة 3T3 أثناء تطبيق 2 ميكرومتر مجانية Ca^{2 +} حل داخلي تحت ظروف التحكم (تتبع الأسود) أو بعد 10 ميكرون Ru360 قبل العلاج (تتبع أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهنا يصف لنا نهجين مختلفين لقياس المتقدرية Ca^{2 +} التدفق. لوحة الكالسيوم المستندة إلى القارئ الأخضر-5N أسلوب شاشات اكستراميتوتشوندريال Ca^{2 +} المستويات وهو Ca^{2 +} امتصاص مقايسة التي مناسبة تماما للقياسات في الميتوكوندريا المعزولة. وفي حين أننا قد أظهرت نتائج تمثيلية من الميتوكوندريا القلب مورين معزولة، هذا التحليل يمكن تكييفها سهولة الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة مع وفرة المتقدرية عالية بما في ذلك الكبد، والهيكل العظمى والعضلات، والدماغ. وعلاوة على ذلك، قد يكون النظام قارئ لوحة خياراً مثاليا للمختبرات المتخصصة المعدات المستخدمة تقليديا ل Ca^{2 +} القياسات، مثل فلوروميتيرس، قد لا تتوافر فيها فورا. فترة زمنية قصوى محدودة أن قارئ لوحة يمكن أن تفحص والحاجة إلى البرنامج قبل إضافات الكاشف قد تكون نقطة ضعف هذا الأسلوب مقارنة مع فلوروميتيرس، ولكن التكلفة وتوافر فلوروميتيرس قد تفوق هذا الاستحقاق. باختلاف تركيز Ca^{2 +} في الحقن الكاشف، يمكن تحديد مقدار Ca^{2 +} أن الميتوكوندريا قادرون على تنحية قبل تحريك MPTP فتح (mitochondrial Ca^{2 +} القدرات).

مثالية للخلايا المستزرعة البروتوكول التصوير [كنفوكل] الذي يصف لنا للقياسات Rhod-2/صباحا من Ca المتقدرية^{2 +} ويمكن تكييفها أيضا للخلايا الأولية. في هذا الأسلوب، يتم بيرميبيليزيد غشاء البلازما مع صابونين، الذي يسمح لتبييض لصبغ سيتوسوليك. وتظل فقط صبغ أكمنة في العضيات بعد هذا الإجراء، مما يتيح قياس دقيقة ومحددة للأسفار المتقدرية. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الإنزيم الخلية بيرميبيليزيد التجريبية السيطرة اكستراميتوتشوندريال Ca^{2 +} المستويات، فضلا عن شروط المعرفة من قبل المستخدم التي يتم كشفها الميتوكوندريا. Rhod-2/ص تصوير [كنفوكل] من كاليفورنيا المتقدرية^{2 +} يمكن أن تستخدم في الخلايا سليمة، غير بيرميبيليزيد، لكن هذا يتطلب الاستفادة المثلى من تحميل صبغ والاستره دي لضمان تعريب Rhod-2 الميتوكوندريا على حدة²⁸. نقاط قوة الأسلوب Rhod-2/ص هي أن Rhod-2/ص المتاحة تجارياً ويمكن تطبيقها الصبغ سهولة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. إضفاء الطابع المحلي على صبغ Rhod-2، ومع ذلك، قيد النظر. لضمان قياس fluorescence Rhod-2 الميتوكوندريا على حدة، يمكن استخدام صبغة متميزة طيفيا ثانية، مثل الأخضر ميتوتراكير، وصمة عار الميتوكوندريا قبل التصوير. ترميز وراثيا Ca^{2 +} المجسات الموجهة إلى الميتوكوندريا قد الالتفاف حول هذه المسألة، غير أن الخلايا تحتاج إلى ترانسفيكتيد/ترانسدوسيد مع بناء أجهزة الاستشعار ولديها ما يكفي من الوقت للتعبير عن البروتين. هذه ليست دائماً مثالية للخلايا الأولية مع بقاء محدودة من الوقت، وقد يكون صبغ تحميل عملية للوقت.

في كلا البروتوكولين، استخدمنا المانع المعقدة أونيبورتير Ru360 لتوضيح تأثير المتقدرية Ca^{2 +} تدفق تثبيط. Ru360 هو المعيار الذهبي لتثبيط أونيبورتير وحتى الآن، هو مثبط محددة معروفة فقط من هذه ترانبورتير²⁹. بدلاً من ذلك، يمكن أيضا استخدام الروثينيوم أحمر، بيد الروثينيوم الأحمر مثبط أونيبورتير غير محدد قد ثبت أن تمنع أيضا Ca^{2 +} الإصدار من الشبكة شبكية³⁰. Ca المتقدرية البصر^{2 +} التعامل مع يمكن أن يكون علامة على خلل mitochondrial، كما أونيبورتير معقدة تعتمد على Ca^{2 +} النقل غشاء الميتوكوندريا المحتملة تعتمد، واستطراداً، وهذا يعتمد على الدالة سلسلة التنفس . وهكذا، أونكوبليرس الميتوكوندريا، مثل الكربونيل السيانيد-4-(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب) والكربونيل السيانيد m-كلوروفينيل هيدرازوني (CCCP) التي تبدد غشاء الميتوكوندريا المحتملة، كما يمكن استخدامها كعنصر التحكم مركبات لتمنع المتقدرية Ca^{2 +} التدفق. منذ الميتوكوندريا مواقع من Ca^{2 +} مخزن داخل الخلايا، قد وظيفة الميتوكوندريا Ca^{2 +} المخازن المؤقتة داخل الفضاء داخل الخلايا. وهكذا، قد تؤثر التعديلات في الميتوكوندريا Ca^{2 +} التعامل مع الشكل سيتوسوليك Ca^{2 +} المشهد. نظراً للعدد المتزايد من ظروف المرض حيث المتقدرية Ca^{2 +} ديناميات قد تلعب دوراً، يمكن تطبيق الأساليب الموضحة فيما يلي دراسة المتقدرية Ca^{2 +} تدفق في نماذج حيوانية ونماذج الخلوية المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا الكشف للتقرير.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل منح التمويل من جمعية القلب الأمريكية (J.Q.K.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440