Summary
Her presenterer vi to protokoller for måling av mitokondrie Ca2 + tilstrømningen i isolerte mitokondrier og kultivert celler. For isolert mitokondriene, detalj vi en plate leser-baserte Ca2 + import analysen ved hjelp av Ca2 + følsom fargestoff kalsium grønn-5N. For kulturperler celler beskriver vi en AC confocal mikroskopi-metode som bruker Ca2 + fargestoff Rhod-2/AM.
Abstract
Ca2 + av mitokondrier er en viktig funksjon regulere både fysiologiske og patofysiologiske prosesser i et bredt spekter av celler. Muligheten til å måle nøyaktig tilstrømningen og middelklasseinnbyggere av Ca2 + fra mitokondrier er viktig for å bestemme rollen mitokondrie Ca2 + håndtering i disse prosessene. I denne rapporten presenterer vi to metoder for måling av mitokondrie Ca2 + håndtering både isolert mitokondrier og kultivert celler. Vi først detalj en plate leser-basert plattform for å måle mitokondrie Ca2 + opptak ved hjelp av Ca2 + følsom fargestoff kalsium grønn-5N. Plate leser-basert format omgår behovet for spesialisert utstyr, og kalsium grønn-5N fargestoff er ideell for å måle Ca2 + fra isolert vev mitokondrier. For vårt program beskriver vi måling av mitokondrie Ca2 + opptak i mitokondrier isolert fra mus hjertet vev; denne fremgangsmåten kan imidlertid brukes til å måle mitokondrie Ca2 + opptak i mitokondrier isolert fra andre vev som leveren, skjelettlidelser muskel og hjernen. For det andre, beskriver vi en AC confocal mikroskopi-baserte analysen for måling av mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler ved hjelp av Ca2 + følsom fargestoff Rhod-2/AM og imaging bruker 2-dimensjonal laser-skanning mikroskopi. Denne permeabilization protokollen eliminerer cytosolic fargestoff forurensning, slik at bestemte opptak av endringer i mitokondrie Ca2 +. Videre gir laser-skanning mikroskopi høy bildefrekvens å fange raske endringer i mitokondrie Ca2 + ulike rusmidler eller reagenser brukes i eksterne løsningen. Denne protokollen kan brukes for å måle mitokondrie Ca2 + opptak i mange celletyper inkludert primær celler som hjerte myocytter og neurons og udødeliggjort linjer.
Introduction
Mitokondrier er kritiske områder intracellulær Ca2 + lagring og signalering. Tiår med forskning har vist at mitokondrier har muligheten til å importere og beslaglegge Ca2 + 1,2. Mitokondrier, er imidlertid ikke bare passiv områder av Ca2 + lagring. Ca2 + i mitokondrie batterirommet utfører grunnleggende signalnettverk funksjoner inkludert regulering av metabolske og aktivering av mitokondrie-mediert celle død, som har vært vurdert tidligere3. Metabolsk regulering øker Ca2 + aktiviteten av tre matrix-lokalisert dehydrogenases tricarboxylic syre syklus samt åndedretts kjeden komplekser, øke mitokondrie energi produksjon4,5 . Mitokondrielt Ca2 + overbelastning og dysregulated mitokondrie Ca2 + håndtering, Ca2 + utløsere mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) åpning, fører til mitokondrie indre membran permeabilization, membran potensielle tap, mitokondrie dysfunksjon, hevelse, brudd og til slutt cellen død6,7,8,9. Dermed påvirker mitokondrie Ca2 + signalering direkte både mobilnettet liv og død stier gjennom metabolske kontroll og MPTP-død akse.
De siste årene, det har blitt raskt voksende interesse for studiet av mitokondrie Ca2 + dynamikken grunn i stor del til identifisering av molekylære bestanddeler av mitokondrie Ca2 + uniporter komplekse, en mitokondrie indre membran transporter som en primære modus for Ca2 + importere i mitokondrie matrix 10,11,12. Identifikasjon av disse strukturelle og regulatoriske underenheter av uniporter har frembragt muligheten for målretting genetisk mitokondrie Ca2 + tilstrømningen å modulere mitokondrie funksjon og dysfunksjon og tilrettelagt studiet av den bidrag av uniporter komplekse og mitokondrie Ca2 + tilstrømningen til sykdom13,14,15. Faktisk har mitokondrie Ca2 + signalering vært innblandet i patologi av et variert utvalg av sykdommer, fra hjerte sykdom til neurodegeneration og kreft16,17,18, 19,20.
Gitt den grunnleggende betydningen av mitokondrie Ca2 + signalering i stoffskiftet og celledød, og kombinert med den store rekkevidden biologiske systemer påvirker som mitokondrie Ca2 + signalering, metoder for å vurdere mitokondrie Ca2 + strøm er av stor interesse. Ikke overraskende, en rekke teknikker og verktøy til å måle mitokondrie Ca2 + er utviklet. Disse omfatter metoder som bruker verktøy som fluorescerende Ca2 +-sensitive fargestoffer21,22 og genetisk kodet Ca2 + sensorer rettet mot mitochondria, som cameleon og aequorin23, 24. Målet med denne artikkelen er å markere ulike metoder og modellere systemer der mitokondrie Ca2 + opptak kan måles. Vi presenterer to eksperimentelle metoder for å vurdere mitokondrie Ca2 + tilstrømningen kapasitet. Bruke cardiac mitokondrier som et eksempel, detalj vi en plate leser-basert plattform for å måle mitokondrie Ca2 + opptak ved hjelp av Ca2 + følsom fargestoff kalsium grønn-5N som er ideell for isolert vev mitokondrier14 . Bruke kulturperler NIH 3T3 celler, beskrive vi også en AC confocal mikroskopi imaging-baserte analysen for måling av mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler ved hjelp av Ca2 + følsom fargestoff Rhod-2/AM25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Emory University.
Merk: Den første delen er den eksperimentelle prosedyren for å måle mitokondrie Ca2 + tilstrømning av isolerte cardiac mitokondrier likner en plate.
1. reagenser og løsninger
- Gjøre 500 mL MS-EGTA buffer for mitokondrie isolasjon: 225 mM mannitol, 75 mM sakkarose, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N N', N'-tetraacetic syre (EGTA), pH justert 7,4 med KOH. Steriliseres gjennom et 0.22 μm filter og lagre den på 4 ° C. Kontroller at MS-EGTA bufferen er pre kjølt 4 ° c før bruk.
- Forberede 100 mL KCl Buffer: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA og pH tilpasset 7.2 med KOH. Lagre det ved romtemperatur.
- Forberede 1 mM kalsium grønn-5N aksjer i dimethyl sulfoxide (DMSO). Kalsium grønn-5N aksjen kan være aliquotted og lagret på 20 ° C.
-
Klargjør underlag for Ca2 + opptak.
- Forberede 1 M natrium pyruvate, pH 7.4. Oppbevares i dele på 20 ° C.
- Forberede 500 mM malate, pH 7.4. Oppbevares i dele på 20 ° C.
2. isolering av Cardiac mitokondrier
- Euthanize musen etter institusjonelle standarder.
Merk: For våre institusjonelt godkjent metode for eutanasi, var mus anesthetized ved isofluorane innånding og ofret av cervical forvridning. - Samle hjertet av åpne brysthulen, kutte langs hver side av ribbeina, flankert sentrum, skjære vekk membranen og excising hjertet tissue.
Merk: I denne protokollen, mitokondrie isolasjon utføres fra et helt hjerte fra en voksen mus (ca 120 mg), som burde være nok for 3-4 eksperimenter. Mitokondrielt isolering fra andre mitokondrier-rik vev som leveren, kan opptil 200 mg vev brukes følger protokollen beskrevet. - Skyll vevet grundig i 25 mL av iskalde 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) sikrer at alle blod er presset ut av ventriklene.
Merk: Hjertet vil nok være skylles når væsken presset ut av hjertet kjører klart. - Hakke hjertet i små biter i 5 mL av iskalde 1 x PBS med en skarp saks.
- Forkast PBS og overføre hakket hjertet vev til en pre kjølt 7 mL glass-teflon dounce homogenizer med en 0,10 å 0.15 mm klaring.
- Legg 5 mL av iskalde MS-EGTA buffer, og homogenize prøven til vev stykker er ikke lenger synlig (ca. 11 slag).
Merk: Ikke over homogenize vev som målet er å få intakt og funksjonell mitokondrier. - Overføring av homogenate til en 15 mL tube.
- Sentrifuge homogenate 600 x g ved 4 ° C i 5 min til pellets kjerner og ubrutt celler.
- Overføre nedbryting til en frisk 15 mL tube og sentrifuge det 10.000 x g ved 4 ° C i 10 min å pellets mitokondrier.
- Forkaste nedbryting og holde den mitokondrie pellet på is.
- Vask mitokondrie pellet to ganger med iskald MS-EGTA buffer. For hver vask, resuspend mitokondrie pellet i 5 mL av MS-EGTA buffer, sentrifuge det 10.000 x g ved 4 ° C i 10 min og forkaste nedbryting.
- Etter siste vask, forkaste nedbryting og resuspend mitokondrier i 100 μL av is kaldt MS-EGTA buffer. Holde mitokondrier på is.
Merk: Mitokondrier bør brukes til eksperimentering i 1 time. - Måle mitokondrie protein konsentrasjon bruke en Bradford Protein analysen26.
3. plate Reader-basert måling av mitokondrie kalsium opptak
Merk: Her er det beskrevet protokollen for analysere mitokondrie Ca2 + opptak likner en multimode plate utstyrt med sprøytebrukere. Noen plate leseren med evnen til å lese kalsium grønn-5N fluorescens (eksitasjon/utslipp av 506/532 nm) sprøytebrukere å holde reaksjonen beskyttet fra lys kan brukes i en kinetisk modus med automatisk reagens.
- Programmet plate leseren til å utføre en kinetic Les av kalsium grønn-5N fluorescens med målinger tatt annenhver i totale analysen tid 1000 s. i tillegg, programmet reagens sprøytebrukerne til å dispensere 5 μL CaCl2 løsning på 30 s, 150 s, 300 s , 480 s, og 690 s tidspunkt.
Merk: Tidspunktet for CaCl2 injeksjoner er brukerdefinert, og kan justeres for eksperimentell behov. - Prime reagens sprøytebrukere med CaCl2 løsningen skal brukes.
Merk: Konsentrasjonen av CaCl2 løsningen er brukerdefinert, og kan justeres i påfølgende går å sjarmere mengden av Ca2 + for å utløse MPTP åpning. - Legge til 200 μg av mitokondrier i en enkelt brønn av en 96 godt plate.
- Legge til den aktuelle mengden KCl buffer i brønnen slik at det totale volumet av mitokondrier og KCl buffer gjelder 197 μL.
- Legge til 1 μL 1 M pyruvate, og 1 μL 500 mM malate mitokondrier blandingen. Pipetter forsiktig å blande, og ruge mitokondrier med substrater for 2 min ved romtemperatur å tillate mitokondrier å bli strømførende.
- Tilsett 1 μL av 1 mM kalsium grønn-5N lager. Bland forsiktig ved pipettering.
Merk: Beskytte reaksjonen fra lys etter tillegg av kalsium grønn-5N fargestoffet. - Start den pre-programmert kinetic protokollen og overvåke kalsium grønn-5N fluorescensen.
4. reagenser og løsninger
Merk: Den andre delen er eksperimentelle prosedyren ved AC confocal avbildning av mitokondrie Ca2 + i kulturperler celler
- Gjør Tyrodes løsning (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, og 10 mM HEPES, pH 7.2 med KOH). Lagre den på 4 ° C. Varme det til romtemperatur før bruk.
- Forbered vaskeløsning (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7.2 med KOH). Lagre den på 4 ° C. Varme det til romtemperatur før bruk.
- Forberede Permeabilization løsning, som inneholder 0.005% saponin i vaskeløsning. Forberede den fersk hver dag.
- Forberede 0 Ca2 + intern løsning (100 mM kalium acetat, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH justert til 7,2 med KOH). Lagre den på 4 ° C. Varme det til romtemperatur før bruk.
- Forberede intern løsning som inneholder Ca2 +. Legge til CaCl2 interne løsningen over å nå ønsket konsentrasjonen av gratis Ca2 +. Mengden av CaCl2 til beregnes ved hjelp av programmet MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
- Forberede 1 mM Rhod-2/AM aksjer i DMSO og lagre den på 20 ° C før bruk.
- Forberede 1 mM MitoTracker grønne aksjer i DMSO og lagre den på 20 ° C før bruk.
5. plating celler for Imaging
- Vask 22 x 22 cm2 glass coverslips med 100% etanol og la coverslips til luft tørr.
- Plass glass coverslips i individuelle brønner i en 6-og vev kultur parabol.
Merk: Coverslips kan være belagt med laminin, poly-L-lysine eller lignende matrix å fremme cellen vedlegg. - Trypsinize og tallerkenen cellene på coverslips sikter til ca 70% samløpet på dagen for bildebehandling.
6. lasting celler med Rhod-2/AM og MitoTracker Green
- Forberede Rhod-2/AM-MitoTracker grønne fungerende løsning. Legge til 20 μL Rhod-2/AM 1 mM lager, 0,2 μL MitoTracker grønne 1 mM lager og 2,5 μL 20% pluronic F-127 til 1 mL av Tyrodes løsning. Siste konsentrasjonen av Rhod-2 i arbeider løsningen er 20 µM og endelige konsentrasjonen av MitoTracker green er 200 nM.
- Fjern vekst media fra dekkglassvæske.
Merk: En vask trinnet er ikke nødvendig før fargestoff løsning tillegg. - Legge til Rhod-2/AM-MitoTracker grønne løsning på en dropwise måte på dekkglassvæske til dekkglassvæske er bare dekket (ca 3-4 dråper per dekkglassvæske).
- Inkuber det i 30 min ved romtemperatur beskyttet fra lys til at cellene å laste med fargestoffer.
- De forestre Rhod-2/AM. Fjern Rhod-2/AM-MitoTracker grønne løsning, erstatte den med ferske romtemperatur Tyrode løsning og ruge det i 30 min ved romtemperatur beskyttet mot lyset.
7. AC confocal Imaging mitokondrie Rhod-2/AM og MitoTracker Green fluorescens
- Overføre til dekkglassvæske til mikroskopet imaging kammer og fyll kammeret med vaskeløsning.
- Under innstillinger for å observere celler i kontrast på 40 X justere fokus til celler er synlige og i fokus.
-
Permeabilize plasma membran av Rhod-2/AM-MitoTracker grønne lastet celler å fjerne stoffer lokalisert Rhod-2, stund retaining mitokondrier lokalisert fargestoff.
- Fjern vaskeløsning fra dekkglassvæske.
- Erstatte den med Permeabilization løsning for ca 1 minutt.
- Visuelt overvåke plasma membranen morfologi gjennom hele permeabilization prosessen. Permeabilized celler vil utvikle en sklifri overflate.
- Når permeabilization er fullført, umiddelbart fjerne det Permeabilization og erstatte den med 0 Ca2 + intern løsning.
- Samtidig bilde Rhod-2 fluorescens (eksitasjon 559 nm laser linje og utslipp samlet på bølgelengder mellom 575-675 nm) og MitoTracker grønne fluorescens (eksitasjon 488nm laser linje og utslipp samlet på bølgelengder mellom 505-525 nm). Fokus på permeabilized celler viser en klar colocalization av Rhod-2 og MitoTracker grønne.
- Redusere mikroskop laser og få innstillingene slik at mitokondrie Rhod-2 fluorescens dim og bare synlig.
- Velg mikroskop for å kjøpe 2-dimensjonal skanner på en riktige rammen rate og tid kurs for det bestemte programmet. En bildefrekvens på 30 rammer/s anbefales å fange nøyaktig the kinetics av endringer i mitokondrie Ca2 +.
- Fjern den 0 Ca2 + intern løsning uten å forstyrre cellene eller mikroskop fokus.
- Starte bildeopptak.
- Legge til Ca2 +-fylt intern løsning ved 10 s Velg manuelt eller med en perfusjonsmåling.
- Velg områdene rundt (ROIs) til å omfatte regioner i colocalization mellom mitokondrie Rhod-2 og MitoTracker grønne signalet i image oppkjøpet programvare.
Merk: Vilkårlig fluorescens (F) verdier for hvert punkt av opptaket hentes for hver avkastning. Disse verdiene er bakgrunnen trukket og normalisert til den første fluorescensen (før Ca2 + tillegg; F0) og plottet F/F0 over tid for data presentasjon og kvantifisering av amplituden til endring av mitokondrie Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser mitokondrie Ca2 + opptak målinger i isolerte cardiac mitokondrier bruker plate leser-baserte plattformen og Ca2 + farge kalsium grønn-5N. Under kontroll forhold (figur 1A), hjertestans mitokondrier ble suspendert i KCl buffer inneholder kalsium grønn-5N og deretter utfordret med sekvensiell pulser av CaCl2 (5 μL en 0.6 mM CaCl2 løsning) lagt på 30 s, 150 s, 300 s, 480 s, og 690 s tidspunkt. Tidsberegningen og rekke CaCl2 tillegg kan justeres av brukeren å tillate komplett mitokondrie opptak av ekstra Ca2 + før senere tillegg. I denne analysen gjenspeiler øker i kalsium grønn-5N signal opphøyet buffer Ca2 + nivåer. Som mitokondrier importere Ca2 +, avtar Ca2 + er fjernet fra bufferen og kalsium grønn-5N fluorescens. Viktigst, på den tredje tillegg av Ca2 +, kalsium grønn-5N fluorescens kurven gjennomgår en plutselig og skarp Bøyning oppover, i stedet for fortsetter å fjerne Ca2 + fra bufferen og angis av den røde pilen i figur 1A . Denne plutselige økningen i fluorescens gjenspeiler mitokondrie Ca2 + overbelastning og MPTP åpning. Den totale mengden av Ca2 + tatt opp av mitokondrier før MPTP aktivering reflekterer mitokondrie Ca2 + kapasitet, og kan uttrykkes som μmol Ca2 +/mg protein. Ved å gjøre justeringer tidsberegningen og konsentrasjoner av kalsium lagt, mengden av Ca2 + for å utløse kan permeabilitet overgang bestemmes. I figur 1B, mitokondrier var pre-behandlet i 10 min ved romtemperatur med 10 μM Ru360, et godt karakterisert inhibitor av de mitokondrie Ca2 + uniporter komplekse27. Ru360 hemmer uniporter-avhengige mitokondrie Ca2 + opptak, og dette er dokumentert av den step-wise økningen i kalsium grønn-5N fluorescens etter hvert Ca2 + tillegg.
Ved AC confocal avbildning av mitokondrie kalsium bruker Rhod-2/AM, viser vi representant resultatene fra NIH 3T3 celler. MitoTracker green er en mitokondrier-selektiv farge som fortrinnsvis flekker mitokondrie nettverket (figur 2A). Etter saponin-mediert permeabilization i plasma membranen, cytosolic Rhod-2 er vasket bort, slik at en Rhod-2 farget mitokondrie nettverk som co regionaliserer med de MitoTracker grønne (figur 2A). Rhod-2 kan også akkumuleres i ikke-Mitokondrielt strukturer, slik at Avkastningen er som skal analyseres bør fokus på områder av co lokalisering mellom MitoTracker grønn og Rhod-2. I kontroll celler, tillegg av en Ca2 +-fylt intern løsning som inneholder 2 μM gratis Ca2 + fører til rask økning i Rhod-2 fluorescens, som er hemmet når uniporter komplekse hemmes med 10 μM Ru360 (figur 2B).
Figur 1: Mitokondrie Ca2 + opptak i isolerte cardiac mitokondrier. (A) grafer av relativ kalsium grønn-5N fluorescens kontroll hjertet mitokondrier og (B) mitokondrier pre-behandlet med 10 μM Ru360 i 10 min i romtemperatur, utfordret med 5 μL 0.6 mM CaCl2 (svart piler). Mitokondrielt Ca2 + overbelastning-indusert permeabilitet overgangen er angitt med den røde pilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant analyse av mitokondrie Ca2 + i permeabilized celler. (A) representant fluorescens bildet av 3T3 celler lastet med rhod-2 (rød) og MitoTracker green (grønn) og flettede bilder av rhod-2 og MitoTracker green (gul) etter permeabilization med saponin. (B) Rhod-2 fluorescerende spor fra en enkelt 3T3 celle under påføring av 2 µM Ca2 + interne gratisløsning under kontroll forhold (svart trace) eller etter 10 µM Ru360 før behandling (rød trace). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi to ulike tilnærminger for å måle mitokondrie Ca2 + tilstrømningen. Plate leser-baserte kalsium grønn-5N metoden skjermer extramitochondrial Ca2 + nivåer og er en Ca2 + opptaksanalyse som er godt egnet for målinger i isolerte mitokondrier. Mens vi har vist representant resultater fra isolert murine cardiac mitokondrier, kan denne analysen være lett tilpasset mitokondrier isolert fra vev med høy mitokondrie overflod inkludert lever, skjelettlidelser muskel og hjernen. Videre kan plate leser systemet være et ideelt alternativ for laboratorier hvor spesialisert utstyr tradisjonelt brukes for Ca2 + målinger, som fluorometers, ikke kan være umiddelbart tilgjengelig. At begrenset maksimal tid at en plate leser kan skanne og behovet for å forhåndsprogrammere reagens tillegg kan være en svakhet av denne teknikken sammenlignet med fluorometers, men kostnadene og tilgjengeligheten av fluorometers kan oppveie denne fordelen. Ved å variere konsentrasjonen av Ca2 + i reagens sprøytebrukere, kan mengden av Ca2 + som mitokondrier kan beslaglegge før utløser MPTP åpning (i mitokondrie Ca2 + kapasitet) bestemmes.
AC confocal tenkelig protokollen som beskriver vi for Rhod-2/AM målinger av mitokondrie Ca2 + er ideell for kulturperler celler og kan også tilpasses til primær celler. I denne metoden er plasma membranen permeabilized med saponin, som muliggjør bleke cytosolic fargestoff. Bare fargestoff fanget i organeller er etter denne prosedyren gir nøyaktig og bestemt måling av mitokondrie fluorescens. Dessuten, denne permeabilized celle analysen gir eksperimentell kontroll over extramitochondrial Ca2 + nivåer samt brukerdefinerte forhold som utsettes mitokondrier. Rhod-2/AM AC confocal avbildning av mitokondrie Ca2 + kan brukes i intakt, ikke-permeabilized celler, men dette krever optimalisering av fargestoff lasting og de esterification å sikre en mitokondrier-spesifikke Rhod-2 lokalisering28. Styrken i Rhod-2/AM metoden er at Rhod-2/AM er kommersielt tilgjengelig og fargestoff lett kan brukes på en rekke celletyper. Lokalisering av Rhod-2 fargestoff, er imidlertid en begrensning vurderes. For å sikre måling av mitokondrier-spesifikke Rhod-2 fluorescens, kan en andre spectrally distinkte fargestoff, som MitoTracker grønn, brukes stain mitokondrier før bildebehandling. Genetisk kodet Ca2 + sensorer rettet mot mitokondrier kan omgå dette problemet, men cellene må transfekterte/transduced med den sensor konstruere og har nok tid til å uttrykke protein. Dette er ikke alltid ideelt for primær celler med begrenset overlevelse tid, og fargestoff lasting kan være en tidsbesparende prosess.
I begge protokollene brukte vi den uniporter komplekse inhibitor Ru360 for å illustrere effekten mitokondrie Ca2 + tilstrømningen hemming. Ru360 er gullstandarden for uniporter hemming dags dato det er den eneste kjente bestemte inhibitor denne tranporter29. Alternativt ruthenium røde kan også brukes, men selskapets rød er en uspesifisert uniporter inhibitor som har vist seg å hemme også Ca2 + utgivelse fra sarcoplasmic retikulum30. Nedsatt mitokondrie Ca2 + håndtering kan være et tegn på mitokondrie dysfunksjon, som uniporter kompleks avhengig av Ca2 + transport er mitokondrie membran potensial avhengige, og dermed, dette er avhengig av respiratoriske kjeden funksjonen . Dermed kan mitokondrie uncouplers, for eksempel karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) og karbonyl cyanid m- klorofenyl hydrazone (CCCP) som spre mitokondrie membran potensial, også brukes som kontroll forbindelser for å hemme mitokondrie Ca2 + tilstrømningen. Siden mitochondria er nettsteder intracellulær Ca2 + lagringsplass, kan mitokondrier fungere som Ca2 + buffere innen intracellulær. Endringer i mitokondrie Ca2 + håndtering kan dermed påvirke form av cytosolic Ca2 + landskapet. Vurderer det økende antallet sykdom forhold der mitokondrie Ca2 + dynamics kan spille en rolle, metodene illustrert her kan brukes til studiet av mitokondrie Ca2 + tilstrømningen i dyremodeller og mobilnettet modeller av den sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer rapporten.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av gi finansiering fra American Heart Association (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A.
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
