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Genetics

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Abstract

Genes de virulência bacteriana frequentemente são regulados a nível transcricional por múltiplos fatores que respondem a sinais ambientais diferentes. Alguns fatores agem diretamente sobre os genes de virulência; outros controlam patogênese ajustando a expressão dos reguladores a jusante ou a acumulação de sinais que afetam a atividade do regulador. Enquanto o regulamento tem sido estudado extensivamente durante o crescimento em vitro , relativamente pouco se sabe sobre como a expressão gênica é ajustada durante a infecção. Tal informação é importante quando um produto do gene específico é um candidato para a intervenção terapêutica. Abordagens transcriptional como RT-PCR em tempo real, quantitativo e RNA-Seq são maneiras poderosas para examinar a expressão do gene em um nível global, mas sofrem muitos desafios técnicos, incluindo baixa abundância de RNA bacteriano comparado ao RNA do hospedeiro e amostra degradação por RNases. Avaliar o Regulamento usando repórteres fluorescentes é relativamente fácil e pode ser multiplexado com proteínas fluorescentes com propriedades espectrais únicas. O método permite a célula única, spatiotemporal análise de expressão gênica em tecidos que apresentam tridimensional arquitetura e physiochemical gradientes complexos que afetam redes de regulação bacterianas. Tais informações são perdidas quando dados são calculados sobre a população em massa. Aqui, descrevemos um método para quantificar a expressão gênica em patógenos bacterianos in situ. O método baseia-se no processamento do tecido simples e observação directa da fluorescência das proteínas de repórter. Vamos demonstrar a utilidade deste sistema, examinando a expressão de Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), cujo produto gênico é necessário para evasão imune e virulência completa ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp é fortemente expressos em abcessos renais e revelar expressão de gene heterogêneo devido em parte à aparente regulação espacial da atividade de promotor nuc em abcessos totalmente engajado com a resposta imune. O método pode ser aplicado a qualquer bactéria com um sistema genético manipulável e qualquer modelo de infecção, fornecendo informações valiosas para o desenvolvimento de drogas e estudos pré-clínicos.

Introduction

Bactérias respondem às novas condições fisiológicas e alterações no estado nutricional de seu ambiente expressando diferencialmente genes necessários para adaptação e sobrevivência. Por exemplo, patógenos oportunistas colonizam o corpo superfícies em relativamente baixa densidades e muitas vezes são inofensivos. No entanto, uma vez que a bactéria penetrou barreiras físicas e químicas, deve lidar com as Counter-defesas de célula imune do hospedeiro e disponibilidade de nutrientes restrita1. Por exemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente um terço da população assintomaticamente, mas é também a causa do devastador de pele e infecções de tecidos moles, osteomielite, endocardite e bacteriemia2. O sucesso de S. aureus como um patógeno é frequentemente atribuído à sua flexibilidade metabólica, bem como um arsenal de fatores de virulência associada a superfície e secretada que permitem que a bactéria escapar na corrente sanguínea e replicar em tecidos periféricos 3,4,5. Porque o anfitrião a morte devido à doença estafilocócica é um beco sem saída evolutivo e transmissão de limites a novos hospedeiros6, o compromisso com a produção de factor de virulência deve ser cuidadosamente controlado.

Uma complexa rede de regulação das proteínas e responde RNA não-codificante para uma variedade de estímulos ambientais, incluindo celular, densidade, fase de crescimento, fatores associados neutrófilos e disponibilidade de nutrientes, para garantir que os genes de virulência são expressos nas hora exacta e localização dentro do hospedeiro, tecidos7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, o sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS) regula a expressão de vários fatores de virulência através da quinase do sensor (PEA) e a resposta regulador (SaeR)14. Pea é autophosphorylated em um resíduo de histidina conservada em resposta a sinais (por exemplo,, humana neutrófilos peptídeos [HNPs], calprotectin) de acolhimento a8,15,16. O grupo de fosforilo é então transferido para um resíduos de aspartato na SaeR, ativando-o como uma proteína de ligação a DNA (SaeR ~ P)17. O TCS SaeR/S regula mais de 20 genes que contribuem para a patogênese incluindo fibronectina proteínas (FnBPs) e leucocidinas estafilococos coagulase14,18,19,20. Metas podem ser classificadas em alvos de alta afinidade e baixa afinidade do gene, que possam induzido como o nível de SaeR ~ P levanta-se quando exposto a suas sugestões21. A atividade de SaeR/S é controlada por outros reguladores da expressão gênica, como o sistema de sensoriamento de quórum Agr, repressor de proteína de toxinas (Rot) e a alternativa fator sigma B (SigB)22,23,24.

NUC é um gene de virulência Sae-dependente em Staphylococcus aureus e codifica thermonuclease (Nuc), que é essencial para escapar do neutrophilic extracellular traps (redes) e para divulgação durante o curso de infecção25,26. A expressão do nuc é também fortemente indiretamente reprimida pelo CodY na presença de aminoácidos de cadeia ramificada e GTP27e diretamente reprimida pela proteína estafilocócica regulador acessório SarA28,29 , cuja actividade é influenciada pelo oxigênio (estado de redox) e pH30. Dado que sae e nuc mutantes são atenuados em modelos do rato de infecção, há interesse em desenvolver intervenções químicas que inibem a sua correspondente atividades26,31. Apesar disso, não há nenhuma informação sobre sua regulação durante a infecção.

Repórteres fluorescentes tem sido usados para monitorar e quantificar a expressão do gene no nível da célula única. Neste documento, apresentamos um método para a quantificação dos S. aureus expressão gênica durante a infecção que, quando combinadas com in vitro transcriptome análise e poderosas técnicas de imagem como a ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), pode revelar como bacteriana fisiologia está regulamentada no vivo e a abundância relativa de nutrientes em determinados nichos. O método pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano com um sistema genético tractable.

Visão geral do vetor Integrativa do genoma.

O genoma Integrativa vector pRB4 contém 500 pares de bases cada das regiões a montante e a jusante do pseudogene do S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar o recombination homologous. pRB4 é derivado de backbone sensíveis à temperatura pMAD vetor contendo a gaveta de resistência de eritromicina (ermC) e beta-galactosidase thermostable gene bgaB para rastreio de azul/branco, recombinants32. A construção de engenharia repórter também contém um marcador de resistência de cloranfenicol (gato) para a seleção após a integração do genoma e eliminação do plasmídeo, bem como locais de EcoRI e SmaI para fundir a região reguladora de interesse para verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (Figura 1). É conhecido que a escolha do sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade do repórter e muitas vezes requer otimização empírica33. Assim, um RBS não é fornecido. Aqui, o sítio de ligação do ribossomo nativo é usado para fornecer um padrão mais natural da expressão do gene, mas outros sites podem ser utilizados.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Georgetown e institucional Cuidado Animal.

1. geração da estirpe repórter fluorescentes

  1. Digeri o vetor de pRB4 Integrativa do genoma sequencialmente com enzimas de restrição EcoRI e SmaI. Seguindo o protocolo do fabricante, configurar uma digestão durante a noite com SmaI usando 1 µ g de pRB4 a 25 ° C e então prosseguir com a segunda digestão durante 1h a 37 ° C, adicionando EcoRI, a mistura de reacção. Inactivar as enzimas incubando a 65 ° C por 20 min.
  2. PCR amplificar a região reguladora de interesse do DNA genômico (neste caso, um par de base ~ 350 fragmento de DNA contendo região promotora thermonuclease [nuc]), incorporando um local de restrição EcoRI 5' e um local de restrição de SmaI 3'. A sequência de reconhecimento SmaI deve ser em-frame com o códon de início translacional. Neste estudo, a PCR foi realizada utilizando um Polymerase do DNA de alta-fidelidade de acordo com as recomendações do fabricante com oRB015 para a frente da primeira demão (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') e inverter a cartilha oRB016 ( 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). A temperatura do recozimento foi de 53 ° C. Purifica o fragmento resultante usando um kit de limpeza PCR seguindo as instruções do fabricante.
  3. Digerir o produto resultante da PCR com EcoRI e SmaI como realizado no passo 1.1 e ligate o fragmento de DNA digerido nos mesmos sítios do pRB4 usando T4 DNA ligase conforme recomendado pelo fabricante para gerar a construção integrativa. Introduzir a mistura de ligadura em Escherichia coli e confirme a sequência de construção.
  4. Electroporate a construção para cepa S. aureus RN4220 conforme descrito anteriormente34. Em breve, usar 1 µ g de plasmídeo com 70 µ l de células competentes-electro (Ω 100, 25 µF e 2,3 kV) em caldo B2 (1% [w/v] hidrolisado de caseína, extrato de levedura 2,5% [w/v], 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0.5% [w/v] glicose). Seleccione a resistência de eritromicina (Emr) na temperatura permissiva (30 ° C) em ágar tryptic soja (TSA) suplementado com eritromicina (5 µ g mL-1) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µ g mL-1). As transformants resultantes são azuis devido a atividade de β-galactosidase plasmídeo-codificado.
    Nota: Transferência de DNA em isolados clínicos é extremamente difícil devido a uma forte restrição-modificação barreira35. Assim, RN4220 de S. aureus foi usado como um destinatário intermediário da construção de fusão porque é restrição deficiente e altamente transformável.
  5. Transferência do plasmídeo para S. aureus USA300 estirpe de interesse usando eletroporação ou transdução mediada por fago36 na temperatura permissiva. Em breve, propaga o bacteriófago de11 Φ partículas sobre a estirpe de doador utilizando placas TSA contendo 5 mM CaCl2 durante a noite a 30 ° C e em seguida esterilizar por filtração com filtros de seringa 0,45 µM de acetato de celulose. Use lysates para transduce cepa S. aureus LAC Emr.
    Nota: LAC é um isolado clínico amplamente utilizado que foi anteriormente feito Em sensível pela passagem serial em meio TSB para curar a estirpe do pUSA03 nativo do plasmídeo que confere Emr 37,38.
  6. Integre a construção por dois, eventos de recombinação homóloga sucessivas o cromossomo conforme descrito anteriormente,32. Os recombinantes são resistentes ao cloranfenicol (Cmr) em placas TSA contendo 5 μg mL-1 de cloranfenicol, eritromicina-sensíveis (Erms) e não mais azul.
    Nota: Quando possível, Re-Introduza a fusão marcada USA300 via transdução fago-negociada para evitar a acumulação de mutações associado a estirpe in-vitro passagem39 e temperatura turnos.

2. animais de infecção: Preparação do inóculo, infecção sistêmica e processamento de tecido

  1. Preparação do inóculo bacteriano
    1. Raia S. aureus estirpes de interesse para isolamento em placas de ágar sangue de um estoque de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C para 16 – 24 h confirmar hemolíticos fenótipos com base na sua capacidade de lisar células vermelhas do sangue (hemácias) e forma limpar zonas transparentes.
    2. Inicie culturas durante a noite por inocular colônias única de todas as estirpes de 4 mL de caldo tryptic soja (TSB) em tubos de vidro estéril. Gire os tubos a 37º C por 16-24 h em um rolo de tubo fixado em aproximadamente um ângulo de 70° e 70 rotações por minuto [RPM].
    3. Use um espectrofotômetro para medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) das culturas da etapa 2.1.2. Utilize o meio estéril como uma referência de óptica (em branco). Diluir essas células para um OD600 de 0,05 em 25 mL de estéril Tryptic Soy caldo (TSB) em separado, 125 mL DeLong frascos (frasco de 5:1 a relação do volume) e incubar as culturas em um banho de água (para transferência de calor adequada às culturas), agitando a 280 RPM e definir a 37 ° C.
      Nota: O crescimento do inóculo pode ser realizado de várias formas; é apresentado um método para o cultivo de células para fase exponencial. Independentemente disso, é importante usar consistentemente o mesmo método para preparar as células para inoculação.
    4. Em um OD de600 de ~ 1, re-dilua as células em meio fresco para uma partida de OD600 de 0,05 para garantir as células atingir fase exponencial e que fatores que se acumulam durante a incubação durante a noite tenham sido reduzidos para níveis de fase exponencial.
    5. Recolher as células durante a fase exponencial (OD600 ~0.6–0.8) por centrifugação a 3.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    6. Lave as pelotas duas vezes em volume equivalente de estéril 1 x fosfato salino (PBS, pH 7,4).
    7. Suspender as células em 1X PBS (pH 7,4) a uma concentração de 1 x 108 formadoras de unidades (CFUs) mL-1 , ou conforme apropriado para a desejada experiência.
      Nota: é importante determinar a relação entre OD600 e CFU mL-1 para cada microrganismo de interesse porque alterações de tensão-dependente do tamanho da célula e forma podem afetar as propriedades de espalhamento de luz e, finalmente, o dose de infecção.
  2. Preparação dos animais e infecção bacteriana
    1. ACCLIMATE ratos por 7 dias na dieta purificada AIN-93. A dieta é formulada para proporcionar uma nutrição adequada, reduzindo o tecido autofluorescência associada ao consumo de ingredientes à base de plantas usadas em mouse padrão chow40.
      Nota: Camundongos C57/BL6 fêmeas (6-8 semanas de idade) são usados aqui, mas a cepa de rato e o sexo vão depender do estudo.
    2. Antes da infecção, dilate as veias de rabo de rato com água morna.
    3. Infectar animais por injetar 100 µ l de inóculo bacteriano através de cauda-veias para produzir uma infecção sistêmica. Salvar uma parte alíquota do inóculo inicial se realizando citometria de fluxo (ver secção 4).
    4. Monitorar os animais diariamente e avaliar o seu estado de saúde usando um sistema de monitoramento, revisto e aprovado por de um cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.
    5. Permitir que a infecção ao progresso para a duração desejada. Aqui, as experiências são terminados 3 dias pós infecção.
      Nota: Nestas condições, abcessos consistem em uma comunidade de abscesso estafilocócica de bactérias, cercada por depósitos de fibrina e rodeado por camadas concêntricas de células do sistema imunológico5,41.
  3. Colheita de órgãos e processamento de tecido
    1. Eutanásia dos animais por inalação de CO2 e deslocamento cervical como um método secundário e realizar a necropsia.
    2. Colheita de rim (à direita) e outros órgãos vitais (pulmões, coração, fígado, baço) e transferir para tubos de polipropileno de 15 mL contendo formol a 10% [v/v] armazenados em buffer. Prosseguir com estes órgãos para a etapa 2.3.4 abaixo.
    3. Transfira o rim esquerdo para um tubo resistente ao impacto de estéril de 2 mL contendo ~ 500 µ l de grânulos de silicone de 2 mm e 1 mL estéril 1X PBS (pH 7,4). Prosseguir com este órgão para etapa 4.2.
    4. Permitir que os órgãos da etapa 2.3.2 corrigir no escuro à temperatura ambiente com agitação suave ou rotação pelo menos 24 horas, mas não mais de 48 horas.
    5. Incorporar os órgãos em tecido claro congelamento médio e armazenar os tecidos a-80 ° C.
    6. Usando um criostato, seção tecido em fatias de 10 µm de espessura.
    7. Seque as seções sobre uma lâmina de vidro previamente limpos, carregada por 20 min na escuridão, aplique meio de difícil montagem com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha e lamela. Curar os slides montados à temperatura ambiente durante a noite e transferir a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.

3. processamento de imagem e microscopia Confocal de varredura a laser

  1. Examine os slides montados para localizar lesões usando laser apropriado para o repórter fluorescente sendo usado. Neste caso, o verde (GFP), vermelho (tdTomato), e azul fluorescência (DAPI) sinais são usados.
  2. Adquirir a imagem usando o objetivo apropriado para a visualização de células individuais (por exemplo, normalmente x 20 ou 40 x de objectivos é usados).
  3. Medir as intensidades de fluorescência nas imagens confocal.
    1. Abra a imagem confocal em Image J e ajustar o brilho/contraste para visualizar corretamente o sinal de fluorescência da lesão.
    2. Definir a região de interesse e usando a opção de limiarização , definir os limites superior e inferior de fluorescência, se necessário.
    3. Definir o centroide selecionando área → valor médio cinza → centroide → limitar-se ao limite de na imagem J. guia Analyze
    4. Extraia o valor de intensidade de fluorescência de centroide ou medir a intensidade de fluorescência média em uma determinada lesão por unidade de área (fluorescência de média intensidade, IFM) para as boas práticas agrícolas e tdTomato. Aqui, utilizaram-se áreas de2 µm.
      Nota: Uma segunda análise cega minimiza o preconceito quando é conhecida a identidade da amostra.
    5. Plotar os dados e realizar as análises estatísticas adequadas para cada comparação.

4. fluxo Cytometry Analysis

  1. (Opcional) Determinar a atividade de fusão do inóculo no dia da infecção (da seção 2.2.3)
    1. A 899 µ l de 1X PBS estéril (pH 7,4) adicionar 100 µ l de cada inóculo e mancha de 1 µ l de ácido nucleico permeant de membrana (ver Tabela de materiais). Como um controle, certifique-se de incluir uma amostra sem mancha de ácido nucleico.
    2. Execute a citometria de fluxo em todas as amostras.
      Nota: Para a primeira experiência, é útil incluir um controle único vetor para a fusão de interesse para determinar a tensão adequada para usar. Uma clara separação entre amostras positivas e negativas é essencial para a análise dos dados, indicando o repórter é bem acima do sinal de fundo.
    3. Para identificar a população bacteriana, trama eventos usando ácido nucleico mancham (eixo y) e encaminhar a dispersão (eixo x).
    4. Desenhe uma porta de inclusão em torno de eventos que são ambos os ácidos nucleicos mancha positiva e o tamanho correto da bactéria baseada o forward scatter (entre 0,5 a 2,0 µm para S. aureus).
      Nota: Se rigoroso ao identificar esta população como é fundamental para incluir eventos que são claramente dentro destes parâmetros. Certifique-se de que este portal exclui todos os eventos para os controles negativos sob outras condições. Neste estudo, aproximadamente 70% da população celular conheceu esses requisitos em análise.
  2. Análise de amostras de tecido após o sacrifício:
    1. Eutanásia em animais, colher os rins esquerdos (consulte a etapa 2.3) e transferência em grânulo batendo tubos contendo 1 mL de 1X PBS estéril (pH 7,4) e 250 µ l de grânulos de borosilicato de 2 mm.
    2. Perturbar os tecidos para liberar as células bacterianas. Para os rins, use um homogeneizador para romper as células. Aqui, três 30 s rajadas a 6800 rpm com 1 min períodos no gelo molhado entre os ciclos de refrigeração foram usadas para minimizar o aquecimento de amostras.
    3. Pelota o restos de tecido maiores por centrifugação a 250 x g durante 3 min numa mesa microcentrifuga resfriado a 4 ° C.
      Nota: Normalmente, há um sedimento celular no fundo do tubo e uma camada de detritos flutuantes na parte superior. A camada aquosa média contém as células bacterianas.
    4. Transferência de 10 µ l da camada aquosa em um tubo de microcentrifuga limpa 1,5 mL contendo 1 µ l de ácido nucleico mancha em 989 µ l de PBS (total de volume de 1 mL).
    5. Execute a citometria de fluxo, usando os mesmos parâmetros de aquisição de dados e gating quanto os inóculos iniciais.
      Nota: Contagem de células bacterianas será muito baixa, porque a amostra contém principalmente restos de tecido. A opção de "Portão ao vivo" também pode ser usada se as células são mancha de ácido nucleico positiva e tamanho-dependentes quando dados são carregados no aplicativo. Isto também ajudará a analisar mais dos eventos alvo e reduzir o tamanho do arquivo. Quase 1 milhão de eventos por exemplo são contados, mas mais contagens de evento podem ser necessárias dependendo da gravidade da infecção e o tamanho do tecido analisado.
    6. Análise de dados: Determinar quer dizer intensidade fluorescente (IFM) para cada fluoróforo numa determinada amostra usando os portões de inclusão determinados no ponto 4.1.4. Normalize as amostras no software de análise de fluxo para contagens de evento. 10.000 contagens são geralmente suficientes na análise.
      Nota: Não é incomum encontrar amostras que contêm menos do que este número de eventos, já que este é dependente da gravidade de infecção e formação de abscesso. Usando essa abordagem, 500-40.000 eventos são normalmente encontrados em tecidos infectados.

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Representative Results

Desenvolvemos um plasmídeo derivado pMAD32 que pode entregar qualquer repórter construção de fusão para o cromossomo por recombinação homóloga de cruzamento duplo (Figura 1). Esta construção permite a análise quantitativa de qualquer região reguladora que suporta a produção de proteína GFP e sinal fluorescente acima do fundo. O plasmídeo confere resistência ampicilina (Apr) para a manutenção e propagação em e. coli e confere resistência eritromicina (Emr) em S. aureus. A construção também confere resistência de cloranfenicol (Cmr), que permite a fácil transferência de fusão o repórter integrado entre várias cepas mutantes para análise genética sofisticada em S. aureus.

Como prova de princípio, fundiu o nuc região reguladora de gfp. nuc foi escolhido porque seu produto do gene é necessário para a virulência completa e é exigido para restringir os macrófagos de s. aureus -induzido abcessos42, 43. A construção foi integrada no cromossomo conforme descrito nas etapas 1.4-1.6 do protocolo. A fusão integrada foi transferida para o AH3926 que contém uma fusão de - tdTomato desarAP1P. A sarA P1 promotor tem se mostrado anteriormente constitutivamente ativo44 e rotula assim, todas as células.

Primeiro verificamos que as fusões de repórter eram ativos durante o in vitro agitar crescimento de balão em Tryptic Soy caldo (TSB; um meio rico, complexo) e que os níveis de fluorescência foram acima o celular autofluorescente fundo (Figura 2). Para determinar como os repórteres fluorescentes se comportam em vivo, um modelo modificado de abscesso renal foi usado5. Grupos de camundongos C57BL/6 fêmeas foram desafiados por via intravenosa com 1 x 107 UFC cada uma das células de S. aureus LAC falta fusões de repórter ou células LAC carregando o nuc-sGFP e sarAp1-tdTomato fusões. Os animais foram sacrificados três dias pós infecção. Em seguida, órgãos foram fixados em formalina 10% [v/v] buffer, cryo-seccionado e imagem pela microscopia confocal após DAPI coloração conforme descrito nos passos 2 e 3 (Figura 3A, B). As imagens foram analisadas usando Image J e fluorescência por unidade de área nas lesões renais foi medida. Como mostrado na Figura 3C, fluorescência de fusão nuc-gfp foi em média quase 9-fold mais elevada nas células, levando a fusão do que nas células não carregando a fusão do repórter; o último sinal constitui o limite de detecção (autofluorescência) (comparar nuc-sGFP para LAC). Da mesma forma, foi a fluorescência de fusão do PsarAP1- tdtomato ~ 6-fold superior o nenhum controle de repórter (Figura 3E, comparar sarAP1- tdT vs LAC). Usando citometria de fluxo, o padrão de atividades de repórter foi confirmado usando homogenates de rim e fluxo cytometry, conforme descrito na etapa 4, embora a dobra diferenças de fluorescência foram inferior (Fig. 3D, F).

Curiosamente, os dados de fluorescência de lesões formadas por células carregando fusões repórter fluorescentes apareceram para mostrar maior variabilidade do que aqueles que faltam os repórteres. Gostaríamos de saber se a variação nas medições fluorescência observada foi devido a expressão heterogênea dos repórteres (ou seja, de origem biológica). Com efeito, a ~ 100 µm de distância verificou que algumas lesões expressaram um ou ambos os repórteres (Figura 4). Importante, examinando a atividade de repórter com resolução única célula em comunidades de abscesso estafilocócica (SACs) revelou espacial regulação da expressão de nuc em abcessos circunscrita com forte coloração de DAPI, provavelmente associado com o formação e liberação de neutrófilos extracelular armadilhas (Figura 5A-C)45. Por exemplo, Nós medimos a fluorescência de fusão nuc-sGFP significativamente maior no núcleo interior do saco comparado com isso na periferia (Figura 5B, E). No abscesso mesmo, o padrão de fluorescência de fusão de sarAp1-tdTomato parecia ser invertido (Figura 5-D). No entanto, o padrão não foi estatisticamente significativo, usando o mesmo número de animais (Figura 5-F).

Figure 1
Figura 1 : Representação esquemática do genoma repórter Integrativa do plasmídeo pRB4. PRB4 plasmídeo é um derivado do pMAD com uma origem de replicação em S. aureus (Ori pE194ts) temperatura do sensível. Existem três marcadores de resistência de droga: (i) bla, confere resistência à ampicilina em Escherichia coli; (ii) ermC, conferindo resistência à eritromicina em S. aureus; e (iii) gato, confere resistência ao cloranfenicol em S. aureus. A construção do repórter é ladeada por ~ 500 bp cada de upstream e downstream sequências do pseudogene do SAUSA300_0087 (genoma de referência: FPR3757) para a dupla crossover homóloga recombinação e genoma integração. gene da proteína fluorescente sGFP, verde; CS, local de clonagem; TT, terminador transcricional forte bidirecional. A figura não está à escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Eu ntegrada NUC-sGFP e sarAp1-tdTomato repórteres são expressos durante o crescimento in vitro . S. aureus LAC células (selvagem-tipo [WT]), com e sem o (A) nuc -sGFP ou (B) sarAp1-tdTomato repórteres) foram cultivadas para fase exponencial em TSB e re-diluídas no meio de mesmo. Densidade óptica (OD) e fluorescência foram medidos os valores de densidade óptica indicada. Valores de intensidade de fluorescência subtraído de fundo (excitação/emissão: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) foram divididos pelos valores de densidade óptica para gerar unidades relativas de fluorescência. Os dados são o meio + /-SEM de dois experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fluorescentes repórteres são visíveis no tecido renal. Grupos de 13 camundongos C57BL/6 foram desafiados por via intravenosa com LAC células ou células LAC carregando tanto nuc-sGFP e sarAp1-tdTomato (tdT), e a infecção foi autorizada a prosseguir por três dias. Os ratos foram sacrificados e os órgãos foram processados conforme descrito nas etapas 2 e 3 do protocolo. Seção de rim representativo mostrando lesões múltiplas e a fluorescência associada para (A) nuc-sGFP e (B) sarAp1-tdTomato. Escala de barras = 250 µm (objetivo de x 10). As unidades de fluorescência relativo por unidade de área (RFU [μm2]-1) associada com lesões renais foram medidas usando a análise de imagem, conforme descrito na etapa 3.3 e foram plotadas por (C) nuc-sGFP e (E) sarAp1-tdTomato; cada ponto representa uma lesão e barras indicam a mediana; 3-5 lesões analisadas por rato. Análise de citometria de fluxo (D) nuc-sGFP e fluorescência de fusão (F) sarAp1-tdTomato em populações bacterianas isoladas de rim infectado homogenates três dias pós infecção. A intensidade de fluorescência dizer (IFM) é indicado pela barra sólida, e cada ponto é um rim. LAC, reporterless estirpe selvagem-tipo. Estatísticas: Teste de Mann-Whitney; p < 0,05. Os dados são representativos de dois experimentos independentes. Os comprimentos de onda de excitação para os canais de fluorescência são como segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescência emitida foram recolhidos ao longo de uma gama de comprimentos de onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 551-505 nm; tdTomato, 575-630 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Abscessos apresentam expressão variável de repórteres nos tecidos renais. Grupos de 13 camundongos C57BL/6 foram desafiados com 1 x 107 UFC de células de S. aureus através da cauda-veia. Os animais foram sacrificados três dias pós infecção. Os rins foram colhidos, fixo e seccionado por microscopia de fluorescência (objetiva de 40 x), conforme descrito na etapa 2 do protocolo. São mostrados três lesões em estreita proximidade com níveis variáveis de (A) nuc-sGFP e (B) sarAp1-tdTomato de fluorescência. (C) de ácidos nucleicos de estafilococos e host células é indicado pela coloração DAPI. Os canais vermelhos e verdes são mesclados em (D). Resultados semelhantes foram vistos em outras seções. As imagens foram adquiridas utilizando um objectivo de 40x; Barra de escala = 25 µm. Os comprimentos de onda de excitação para os canais de fluorescência são como segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescência emitida foram recolhidos ao longo de uma gama de comprimentos de onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 551-505 nm; tdTomato, 575-630 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : NUC-sGFP é espacialmente regulada no microambiente de abscesso estafilocócica. Laser confocal de varredura de imagens de microscopia (CLSM) de uma lesão de comunidade (SAC) Abscesso estafilocócica produzido por S. aureus estirpe LAC escriturada nuc-sGFP e sarAp1-tdTomato repórter fusões. São mostrados o (A) fundiu-se canais para nuc-sGFP e sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescência (verde), (C) DAPI coloração dos ácidos nucleicos (azuis) e (D) sarAp1-tdTomato fluorescência (vermelho). Asteriscos indicam células no núcleo (centroide) e as setas indicam as células na periferia. As intensidades de fluorescência para sGFP nuc -(E) e (F) sarAp1-tdTomato são mostradas para células do núcleo e a periferia do saco. Os comprimentos de onda de excitação para os canais de fluorescência são como segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescência emitida foram recolhidos ao longo de uma gama de comprimentos de onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 551-505 nm; tdTomato, 575-630 nm. Os dados são derivados de 8 rins (uma por rato), e 1-2 lesões foram fotografadas de cada rim. As barras indicam mediana. Linha tracejada, limite de detecção. Estatísticas: distribuição Normal dos dados, teste t de Student-(não pareado), * * *p < 0,05. (Barra de escala = 20 µm; aplica-se a todas as imagens.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Doenças infecciosas bacterianas são um crescente problema de saúde em todo o mundo devido à aquisição de resistência aos antibióticos determinantes46. Porque a adaptação a ambientes de host é essencial para o crescimento e sobrevivência durante a infecção, estratégias visando programas de expressão do gene que aumentam a aptidão do patógeno podem ser útil terapeuticamente. Um desses programas é o conjunto de genes controlados pelo sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS), mostrado anteriormente, a desempenhar um papel essencial na evasão imune47. SaeR/S é induzida por uma variedade de fatores, principalmente aqueles associados com neutrófilos8,20. Durante a infecção, S. aureus provoca uma forte resposta inflamatória, na qual os neutrófilos e outros fagócitos são recrutados para o sítio de infecção2. Deposição de necrose e fibrina liquefação siga, formando um abscesso para prevenir novos danos de tecido48. Dentro destes sites privilegiados imunes, S. aureus células usam um número de produtos de genes dependentes Sae para reprogramar o abcesso para facilitar a multiplicação bacteriana5,48. Um gene de Sae-dependente, nuc, códigos para nuclease e metaboliza as redes para produzir 2'-Desoxiadenosina para matar macrófagos43. Assim, o Nuc é uma importante enzima secretada que é essencial para a virulência completa42 e é expressa em vivo (Figura 3, Figura 4e Figura 5).

Embora os fatores de virulência de S. aureus têm sido extensivamente estudados, como a bactéria cresce no acolhimento é uma área pouco estudada, como é a compreensão como a sua fisiologia é regulada durante a infecção. Aqui nós descrevemos um método para sondar a expressão de gene bacteriano e comportamento a nível de célula única usando um vetor integrativo modificado que atenua a preocupação com a perda do plasmídeo na ausência de seleção. Nossa metodologia permite a visualização directa da expressão gênica em abcessos sem precisar permeabilize paredes celulares e sem a necessidade de anticorpos e rotulagem. Detectamos a forte expressão de fusão nuc-sGFP , bem como a fusão de sarAp1-tdTomato em abscesso renal bolsas formadas por células de tipo selvagem três dias pós infecção em um modelo de infecção aguda sistêmica. No entanto, o desenho experimental pode ser modificado para responder perguntas sobre a expressão gênica em outros sites. Com efeito, porque camundongos C57BL/6 são capazes de limpar S. aureus de seus tecidos, as bactérias invadem diversos sites anatômicas incluindo o sistema esquelético (ossos e articulações) e o cérebro, coração, baço e fígado, todos os que têm diferente fisiologia e propriedades nutritivas5,49. Assim, muito pode ser aprendido por meio de S. aureus para sondar a natureza dos tecidos do hospedeiro. É importante notar que se sabe que certos nichos de anfitrião são hipóxicos na natureza ou caso contrário exibem um gradiente de oxigênio forte50. Proteínas fluorescentes requerem oxigênio molecular para a atividade, e alguns são mais sensíveis à pressão parcial de oxigênio do que os outros51. Enquanto vemos a fluorescência do sinal dentro do abscesso, as magnitudes podem ser subestimados. Usando proteínas fluorescentes códon otimizado desenvolvidas para uso em Clostridium difficile poderia ser usado para atenuar esta preocupação52. Um segundo ponto a salientar é que as proteínas fluorescentes (sGFP e tdTomato) produzidas pela repórter estirpes utilizadas neste estudo estão estáveis. Portanto, os dados fluorescentes refletem a acumulação ao longo do experimento, ao invés de uma resposta recente. Gerar uma construção contendo um sGFP instável ou gene tdTomato aumentaria enormemente o utilitário do sistema para experiências dinâmicas.

O sistema de repórter descrito aqui fornece uma ferramenta poderosa para estudar quantitativamente gene Regulamento em vitro e in vivo. Porque o repórter é mantido em uma única cópia do cromossoma, o sistema é well-suited para genes fortemente expressos (isto é, com a actividade de promotor alta). Genes biossintéticos ou outros genes humilde expressos podem não ser visíveis porque o nível de expressão de fluorescência pode cair abaixo do limite de detecção ou fundo autofluorescência. É sabido que o sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade de repórter fusões33. Uma potencial solução para este problema é usar um RBS mais forte como de região (TIR) de iniciação da tradução53 ou para integrar o cromossomo cópias em tandem dos promotores turísticos. Alternativamente, plasmídeos de multi cópia estáveis podem ser usado54.

Uma limitação do método descrito é que, ao contrário de uma preparação de cDNA de RNA extraído de tecidos, um número relativamente pequeno de genes pode ser interrogado simultaneamente (limitada pelos canais fluorescentes disponíveis sem sobreposição espectral). No entanto, o que se ganha pode ser potencialmente mais informativa. qRT-PCR e outras leituras que a média da população em massa são incapazes de capturar a heterogeneidade da população no local da infecção. Com efeito, observamos a heterogeneidade do nível de nuc-sGFP e expressão de sarAp1-tdTomato entre lesões de abscesso em estreita proximidade (Figura 4). Isso é semelhante ao que foi relatado recentemente por Cassat et al 55 neste momento, a origem desta heterogeneidade não é conhecida. No entanto, disponibilidade de nutrientes, indução variável dos sistemas de aquisição de nutrientes ou outros fatores do hospedeiro possivelmente poderiam explicar o fenômeno. Além disso, a interação hospedeiro-patógeno ocorre no microambiente de órgãos ou abscessos que possuem estrutura tridimensional complexa e vários tipos de células. Dentro destas estruturas, tecidos podem variar consideravelmente em relação ao pH, osmolaridade, oxigenação e disponibilidade de nutrientes, um fenômeno conhecido como zoneamento metabólico56,57. Por acaso, descobrimos que um padrão de regulamento espacial surge nas células de tipo selvagem que residem no abscesso (Figura 5). Isto é para o nosso conhecimento a primeira observação de seu tipo em um patógeno Gram-positiva durante a infecção. O Regulamento espacial relatado aqui é semelhante ao obtido por Davis et al. em tecido esplênico contendo microcolonies do patógeno Gram-negative pseudotuberculosis Yersinia58. Nesse caso, anfitrião produzido óxido nítrico (n *) estimula a produção de óxido nítrico dioxigenase (Hmp) nas células na periferia da mais próximo para a difusão n *, poupando interior de microcolônias células a necessidade de induzir a expressão de hmp. Em abscessos estafilocócicas, nuc expressão é mais forte no centro do saco e mais fraco ao longo da periferia. Porque abcessos são cercados por um manguito de neutrófilos, é tentador especular que cues derivado de neutrófilos estão guiando o comportamento de estafilococos, polarizando as células em duas populações fenotipicamente distintas reminiscentes de morphogenic regulação da diferenciação durante o desenvolvimento em maior vida59. O sustentamento mecanicista desse padrão é desconhecido e é um objecto de intenso estudo em nosso laboratório.

Acreditamos que nosso método fornece uma ferramenta eficaz para estudar os detalhes finos da expressão gênica em células individuais durante a infecção. O método oferece uma oportunidade única para observar e eventualmente entender as origens fisiológicas da heterogeneidade e modelação espacial da expressão do gene em tecidos. Esse comportamento heterogêneo deve ter em conta ao desenvolver novas modalidades de tratamento, como apenas uma subpopulação de células (ou seja, aqueles que expressam os genes) pode ser alvo da terapêutica.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Alexander Horswill Agradecemos o presente da fusão de tdTomato - PsarAP1e Karen Creswell para ajuda com análise de citometria de fluxo. Agradecemos também a Alyssa King para aconselhamento sobre análise estatística. Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH exploratório/Developmental Research Award (grant AI123708) e fundos de inicialização da faculdade para SRB. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e interpretação ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

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