Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.

Abstract

وكثيراً ما ينظم الجينات الفوعة الجرثومية على المستوى النسخي العوامل المتعددة التي تستجيب لإشارات بيئية مختلفة. وتعمل بعض العوامل مباشرة على الجينات الفوعة؛ الآخرين السيطرة المرضية عن طريق ضبط التعبير عن المنظمين المصب أو تراكم الإشارات التي تؤثر على نشاط منظم. في حين درست التنظيم على نطاق واسع من خلال النمو في المختبر ، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيف يتم تعديل التعبير الجيني أثناء الإصابة. هذه المعلومات المهم عند منتج معين جينات مرشح للتدخل العلاجي. مثل النهج النسخي RT-PCR الكمي، في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي وسائل قوية لدراسة التعبير الجيني على مستوى عالمي، لكنها تعاني من العديد من التحديات التقنية بما في ذلك وفرة منخفضة من الحمض النووي الريبي البكتيرية بالمقارنة مع المضيف الجيش الملكي النيبالي، وعينه تدهور قبل رنسيس. تقييم تنظيم استخدام الصحفيين الفلورسنت سهلة نسبيا، ويمكن أن يكون متعدد مع البروتينات الفلورية مع الخواص الطيفية فريدة من نوعها. الأسلوب يسمح لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة التي تظهر التدرجات العمارة والفيزيائية ثلاثية الأبعاد المعقدة التي تؤثر على الشبكات التنظيمية البكتيرية وحيدة الخلية، والزمانية المكانية. هذه المعلومات يتم فقدان عندما يتم حساب متوسط البيانات على معظم السكان. وهنا، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للتعبير الجيني في مسببات الأمراض البكتيرية في الموقع. الأسلوب الذي يستند إلى تجهيز الأنسجة البسيطة والملاحظة المباشرة من الأسفار من البروتينات مراسل. نبدي بفائدة هذا النظام بدراسة التعبير عن المكوّرات العنقودية الذهبية ثيرمونوكليسي (نشاط)، منتج الجين الذي مطلوب للتهرب من الحصانة وضراوة كامل السابقين فيفو والمجراه. ونحن تبين أن نشاط التجارة والنقل هو المعرب عنها بقوة في الخراجات الكلوية وتكشف عن التعبير الجيني غير متجانسة الواجبة في الجزء الظاهر التنظيم المكاني نشاط المروج النشاط في الخراجات منخرطة تماما مع الاستجابة المناعية. يمكن تطبيق الأسلوب لأي جرثومة مع نظام وراثية مانيبولاتابل وأي نموذج العدوى، وتوفير معلومات قيمة للدراسات الإكلينيكية وتطوير العقاقير.

Introduction

البكتيريا تستجيب لتغيير الظروف الفسيولوجية والتغيرات في الحالة التغذوية لبيئتهم بخلطات التعبير عن الجينات اللازمة للتكيف والبقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، استعمار مسببات الأمراض الانتهازية الجسم السطوح في نسبيا منخفضة الكثافة، وغالباً ما تكون غير مؤذية. ومع ذلك، مجرد البكتيريا قد اخترقت الحواجز المادية والكيميائية، يجب أن يتعامل مع المضيف المناعي خلية مكافحة الدفاعات وتقييد توافر المغذيات1. على سبيل مثال، المكوّرات العنقودية الذهبية كولونيزيس حوالي ثلث السكان أعراض ولكن أيضا قضية المدمرة الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة والتهاب العظم والنقي والتهاب الشغاف وتجرثم2. ويعزى النجاح في المذهبة س. كمسببات المرض غالباً ما المرونة الأيضية، فضلا عن ترسانة من عوامل الفوعة المرتبطة بالسطح ويفرزها تمكن البكتيريا الهروب مجرى الدم وتكرار في الأنسجة المحيطة 34،،5. لأن المضيف الموت بسبب المرض العنقوديات هو مسدود التطورية ونقل حدود ل المضيفين الجديدة6، يجب أن تسيطر الالتزام بإنتاج عامل الفوعة بعناية.

شبكة تنظيمية معقدة من البروتينات والكشف غير الترميز يستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات البيئية، بما في ذلك الخلية كثافة ومرحلة النمو والعوامل المرتبطة العَدلات، وتوافر المغذيات، لضمان أن يتم التعبير عن الجينات الفوعة في دقة الوقت والمكان داخل المضيف الأنسجة7،8،9،10،11،،من1213. على سبيل المثال، ينظم النظام مركبين ساير/S (TCS) التعبير عن عدة عوامل الفوعة عبر كيناز الاستشعار (سايس) و رد منظم (ساير)14. سايس أوتوفوسفوريلاتيد على بقايا الحامض الأميني مصانة في استجابة للمضيف إشارات (مثل، البشرية العَدلات الببتيدات [هنبس]، كالبروتيكتين)8،،من1516. مجموعة فوسفوريل ثم نقل إلى بقايا اسبارتاتي على ساير، تفعيل ذلك بروتين الحمض النووي ملزم (ساير ~ ف)17. وينظم TCS ساير/S ما يزيد على 20 من الجينات التي تساهم في الآلية المرضية بما في ذلك فيبرونيكتين ملزم البروتينات (فنببس)، ليوكوسيدينس، والمخثره14،18،،من1920. ويمكن تصنيف الأهداف إلى الجينات تقارب عالية ومنخفضة-تقارب الأهداف، التي من المحتمل الناجم عن مستوى ساير ~ ف يرتفع عندما تتعرض لما العظة21. ويسيطر النشاط ساير/S الأخرى المنظمين للتعبير الجيني مثل نظام الاستشعار عن النصاب الزراعية، قامع السموم البروتين (Rot)، وبديلة سيغما عامل ب (سيجب)22،،من2324.

نشاط هو جينات فوعة تعتمد على ش في المكوّرات العنقودية الذهبية وترميز ثيرمونوكليسي (نشاط)، الذي أمر ضروري للهروب من نيوتروفيليك هإكستراسيلولار ربرامج العمل الإقليمية (شبكات) ونشر خلال دورة العدوى،من25إلى26. تعبير عن نشاط القمع أيضا بشدة شكل غير مباشر بواسطة كودي حضور الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة وأنشئ27، ومباشرة للقمع بالبروتين منظم التبعي العنقوديات سارة28،29 ، يتأثر نشاطها بالأكسجين (حالة الأكسدة) ودرجة الحموضة30. نظراً لأن يتم تخفيف طفرات ساي و نشاط في نماذج الماوس للعدوى، هناك اهتمام بتطوير التدخلات الكيميائية التي تمنع تلك الأنشطة المقابلة26،31. وبالرغم من ذلك، لا توجد معلومات بشأن تنظيمها أثناء الإصابة.

وقد استخدمت الفلورسنت الصحفيين لرصد وقياس التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. وهنا، نقدم طريقة لقياس S. التعبير الجيني في المذهبة أثناء الإصابة، عندما يقترن الترنسكربيتوم في المختبر تحليل وقوية تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي (السيدة)، يمكن أن تكشف عن كيف البكتيرية وينظم علم وظائف الأعضاء في فيفو ووفرة نسبية من المواد الغذائية في بعض المنافذ. يمكن تطبيق الأسلوب لأي مسببات الأمراض البكتيرية مع نظام وراثية أصعب.

نظرة عامة على ناقل الجينوم التكاملية.

PRB4 ناقلات التكاملية الجينوم يحتوي على 500 قاعدة أزواج كل من مناطق بسيودوجيني S. aureus USA300 SAUSA300_0087 لتسهيل جزئ مثلى المنبع والمصب. pRB4 مشتق من العمود الفقري ناقل بماد حساسة لدرجة الحرارة التي تتضمن الاريثروميسين المقاومة كاسيت (ارمك) والحرارة بيتا-جالاكتوسيداسي جين بجاب لفحص أبيض وأزرق من ريكومبينانتس32. بناء هندسيا مراسل يحتوي أيضا على علامة مقاومة كلورامفينيكول (لجنة مناهضة التعذيب) للتحديد بعد دمج الجينوم والقضاء بلازميد، فضلا عن مواقع اكوري وسماي فتيل المنطقة التنظيمية التي تهم الأخضر سوبيرفولدير الفلورسنت البروتين (سجفب) (الشكل 1). ومن المعروف أن اختيار موقع الربط الريبوسوم (RBS) يؤثر على نشاط المراسل، وغالباً ما يتطلب التحسين التجريبية33. وهكذا، لم يتم توفير RBS. هنا، يستخدم الموقع ملزم الريبوسوم الأصلية لتوفير لنمط أكثر طبيعية من التعبير الجيني، ولكن يمكن أن تستخدم في مواقع أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جورج تاون.

1-جيل سلالة مراسل نيون

  1. هضم ناقل pRB4 التكاملية الجينوم تسلسلياً مع إنزيمات التقييد اكوري وسماي. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إعداد هضم بين عشية وضحاها مع سماي باستخدام 1 ميكروغرام من pRB4 عند 25 درجة مئوية، وثم المضي قدما في الهضم الثاني ح 1 في 37 درجة مئوية بإضافة اكوري إلى خليط رد فعل. إلغاء تنشيط الإنزيمات التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. [بكر] تضخيم المنطقة التنظيمية لمصلحة من الحمض النووي (في هذه حالة، زوج قاعدي ~ 350 الحمض النووي جزء يحتوي على منطقة المروج ثيرمونوكليسي [نشاط])، يتضمن موقع تقييد اكوري 5 'وموقع تقييد سماي 3'. يجب أن يكون التسلسل الاعتراف سماي في الإطار مع كودون بداية متعدية الجنسيات. في هذه الدراسة، تم إجراء بكر باستخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة مع التمهيدي إلى الأمام oRB015 (5 '-أتكاتجاتكتككااجتااتاتاجتاتاك-3')، وعكس (oRB016 التمهيدي --ججكاتاكتاكاككتكتتكتتتتاج 5 '-3'). وكانت درجة الحرارة انلينغ 53 درجة مئوية. تنقية الشظايا الناتجة باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. والخلاصة ناتج PCR مع اكوري وسماي كما يؤديها في الخطوة 1، 1 سد جزء الحمض النووي هضمها إلى نفس المواقع من pRB4 باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى حسبما أوصت به الشركة المصنعة لإنشاء بنية تكاملية. يدخل الخليط ربط كولاي وتأكيد بناء التسلسل.
  4. كما سبق ذكره اليكتروبوراتي البناء في المذهبة س. سلالة RN422034. وباختصار، استخدم 1 ميكروغرام من بلازميد مع 70 ميليلتر من الخلايا الكهربائية المختصة (100 Ω، µF 25، و 2.3 كيلو فولت) في المرق B2 (1% [w/v] الكازين هيدروليساتي، استخراج الخميرة 2.5% [w/v]، 2.5% [w/v] كلوريد الصوديوم، 0.1% [w/v] ك2ص4، 0.5% [w/v] الجلوكوز). حدد للمقاومة الاريثروميسين (مص) عند درجة حرارة (30 درجة مئوية) متساهلة في فول الصويا تريبتيك أجار (TSA) وتستكمل مع الاريثروميسين (مل ميكروغرام 5-1) و 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال؛ 80 ميكروغرام مل-1). ترانسفورمانتس الناتجة الأزرق بسبب النشاط ترميز بلازميد β-جالاكتوسيداسي.
    ملاحظة: نقل الحمض النووي إلى يعزل السريرية صعب للغاية بسبب حاجز قوي تقييد-تعديل35. وهكذا، RN4220 المذهبة س. كمستلم متوسطة بناء الانصهار لأنها تقييد ناقصة والتحويلية العالية.
  5. نقل بلازميد إلى سلالة USA300 المذهبة س. الاهتمام باستخدام انهانسر أو توصيل بالعاثية بوساطة36 في درجة حرارة متساهلة. وباختصار، نشر Φ عاثية11 الجسيمات في سلالة المانحة استخدام لوحات حساب السياحة الفرعي الذي يحتوي على 5 مم كاكل2 بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، وتعقيم ثم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنه اسيتات السليلوز ميكرومتر 0.45. استخدم ليساتيس ترانسدوسي سلالة المذهبة س. لاك أن مآر.
    ملاحظة: من أمريكا اللاتينية والكاريبي عزل سريرية مستخدمة على نطاق واسع التي كان سبق أن قدمه م الحساسة مرور المسلسل في المتوسطة TSB لعلاج سلالة pUSA03 بلازميد الأصلي يمنح مص 37,38.
  6. الاندماج في البناء الأحداث المتعاقبة جزئ مثلى اثنين، في الصبغي كما هو موضح مسبقاً32. ريكومبينانتس هي الكلورامفينيكول المقاوم (سمr) على لوحات حساب السياحة الفرعي الذي يحتوي على 5 ميكروغرام مل-1 كلورامفينيكول، عرضه الاريثروميسين (Erms) ولا الأزرق أطول.
    ملاحظة: عندما يكون ذلك ممكناً، إعادة إدخال الانصهار ملحوظ في USA300 عن طريق توصيل بالعاثية بوساطة لتجنب تراكم الطفرات المرتبطة بالضغط في المختبر مرور39 ودرجة الحرارة نوبات.

2-الإصابة الحيوان: إعداد العدوى والإصابة الجهازية، وتجهيز الأنسجة

  1. إعداد العدوى البكتيرية
    1. متتالية سلالات المكوّرات س. من الفائدة للعزلة في لوحات أجار الدم من مخزون والغليسيرول مجمدة. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16-24 لتأكيد الانحلالي تعمل استناداً إلى قدرتها على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ونموذج مسح مناطق شفافة.
    2. بدء الثقافات بين عشية وضحاها بتطعيم المستعمرات واحدة لكل سلالة إلى 4 مل مرق الصويا تريبتيك (TSB) في أنابيب زجاجية معقمة. تدوير الأنابيب في 37 درجة مئوية ح 16 – 24 في اسطوانة أنبوبة تعيين الساعة تقريبا بزاوية 70 درجة وتناوب 70 في الدقيقة الواحدة [ربم].
    3. استخدام جهاز المطياف الضوئي قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) الثقافات من الخطوة 2.1.2. استخدام الوسيلة عقيمة كإشارة ضوئية (فارغة). تضعف هذه الخلايا ل التطوير التنظيمي600 0.05 في 25 مل من العقيمة تريبتيك الصويا مرق (TSB) في فصل، 125 مل ديلونغ قوارير (قارورة 5:1 إلى نسبة الحجم)، واحتضان الثقافات في حمام مائي (لنقل الحرارة المناسبة للثقافات)، تهز 280 لفة في الدقيقة وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يتم النمو العدوى في طرق مختلفة؛ ويقدم أسلوب واحد لزراعة الخلايا إلى مرحلة الأسى. بغض النظر، من المهم أن استمرار استخدام نفس الأسلوب لإعداد الخلايا للتطعيم.
    4. OD600 ~ 1، إعادة تمييع الخلايا في متوسطة جديدة لانطلاق OD600 0.05 لضمان تحقيق الخلايا مرحلة الأسى وأن العوامل التي تتراكم خلال الحضانة بين عشية وضحاها قد خفضت إلى مستويات المرحلة الأسية.
    5. حصاد الخلايا أثناء مرحلة الأسى (OD600 ~0.6–0.8) التي سينتريفوجينج في 3,000 ز x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تغسل الكريات مرتين في ما يعادل حجم العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني؛ ودرجة الحموضة 7.4).
    7. تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4) بتركيز 1 × 108 مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) مل-1 أو ما يناسب المطلوب التجربة.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي600 وزيمبابوي مل-1 لكل سلالة من الاهتمام نظراً للتعديلات المعتمدة على سلالة من حجم الخلية والشكل يمكن أن تؤثر على خصائص تشتت الضوء، وفي نهاية المطاف، جرعة العدوى.
  2. إعداد الحيوانات والعدوى البكتيرية
    1. تأقلم الفئران لمدة 7 أيام على حمية تنقية العين-93. وضعت في النظام الغذائي لتوفير التغذية الكافية مع التقليل من الأنسجة السيارات-الأسفار المرتبطة باستهلاك المكونات النباتية المستخدمة في الماوس القياسية تشو40.
      ملاحظة: الإناث فئران C57/BL6 (6-8 أسابيع من العمر) وتستخدم هنا، ولكن بضغط الماوس والجنس يعتمد على الدراسة.
    2. قبل الإصابة، تمدد الأوردة ذيل الماوس بماء فاتر.
    3. تصيب الحيوانات بالحقن ميليلتر 100 من العدوى البكتيرية عن طريق الأوردة الذيل لإنتاج عدوى المجموعية. حفظ قاسمة للعدوى الأولية إذا كان أداء التدفق الخلوي (انظر القسم 4).
    4. مراقبة الحيوانات يوميا وتقييم حالتهم الصحية باستخدام نظام رصد لاستعراضها والموافقة عليها أحد لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
    5. السماح بالعدوى إلى التقدم للمدة المطلوبة. هنا، هي التجارب التي أنهيت 3 أيام بعد الإصابة.
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، والخراجات تتألف من مجتمع الخراج العنقوديات من البكتيريا، وإحاطتها برواسب فيبرينوجين، ومحاطة بطبقات متحدة المركز من الخلايا المناعية5،41.
  3. تجميع الأجهزة وتجهيز الأنسجة
    1. Euthanize الحيوانات باستنشاق أول أكسيد الكربون2 والتفكك عنق الرحم كوسيلة ثانوية وأداء نيكروبسي.
    2. الحصاد الكلي (يمين) والأجهزة الحيوية الأخرى (القلب والكبد والرئتين والطحال) ونقل إلى 15 مل أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على الفورمالين 10% [v/v] مخزنة مؤقتاً. المضي قدما في هذه الأجهزة الخطوة 2.3.4 أدناه.
    3. نقل الكلي اليسرى إلى أنبوب مقاومة لتأثير معقم 2 مل تحتوي على ميليلتر ~ 500 2 مم والسليكا الخرز ومل 1 x 1 العقيمة PBS (درجة الحموضة 7.4). المضي قدما مع هذا الجهاز إلى الخطوة 4، 2.
    4. السماح للأجهزة من الخطوة 2.3.2 لإصلاح في الظلام في درجة حرارة الغرفة بالهز لطيف أو بالتناوب لمدة 24 ساعة على الأقل ولكن ليس أكثر من 48 ساعة.
    5. قم بتضمين أجهزة في الأنسجة واضحة تجميد المتوسطة وتخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية.
    6. استخدام كريوستات، قسم النسيج إلى شرائح من 10 ميكرون سمك.
    7. الجاف للمقاطع على شريحة زجاج تنظيفها مسبقاً، ومشحونة لمدة 20 دقيقة في الظلام وتطبيق المتوسطة التركيب الثابت مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار، وتطبيق ساترة. علاج الشرائح المركبة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها، ونقل إلى 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

3-ليزر المسح المجهري [كنفوكل] ومعالجة الصور

  1. دراسة الشرائح المحملة لتحديد موقع الآفات استخدام أشعة الليزر المناسبة للمراسل الفلورسنت المستخدمة. في هذه الحالة، والأخضر (التجارة والنقل) والأحمر (تدتوماتو)، والأزرق (DAPI) الأسفار تستخدم الإشارات.
  2. الحصول على الصورة باستخدام الهدف المناسب لتصور خلايا فردية (مثل عادة 20 x أو 40 س الأهداف المستخدمة).
  3. قياس كثافة fluorescence في الصور [كنفوكل].
    1. فتح الصورة [كنفوكل] في "ي الصورة" وضبط السطوع/التباين لتصور إشارة fluorescence الآفة بشكل صحيح.
    2. تعريف المنطقة من الفائدة، وقبل استخدام خيار مستوى العتبة ، وتعيين حدود fluorescence السفلي والعليا حسب الضرورة.
    3. تعريف centroid واسطة تحديد ← متوسط قيمة الرمادي ← منطقة Centroid ← الحد إلى عتبة ضمن علامة التبويب تحليل في "صورة ج."
    4. استخراج قيمة كثافة fluorescence centroid أو قياس كثافة fluorescence يعني في آفة معين في وحدة المساحة (الأسفار متوسط الكثافة، مؤسسة مونتانيار) للتجارة والنقل وتدتوماتو. وهنا استخدمت المناطق من واحد ميكرومتر2 .
      ملاحظة: إجراء تحليل ثان أعمى يقلل التحيز عندما يعرف هوية العينة.
    5. رسم البيانات وإجراء التحليلات الإحصائية المناسبة لكل مقارنة.

4-التدفق الخلوي التحليل

  1. (اختياري) تحديد النشاط الانصهار للعدوى في يوم العدوى (من القسم 2.2.3)
    1. إلى 899 ميليلتر من 1 x PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) إضافة 100 ميليلتر من كل العدوى ووصمة 1 ميليلتر من غشاء بيرميانت الحمض النووي (انظر الجدول للمواد). كعنصر تحكم، يجب التأكد من إدراج عينة تفتقر إلى الأحماض النووية وصمة عار.
    2. أداء التدفق الخلوي في جميع العينات.
      ملاحظة: للتجربة الأولى، أنها مفيدة لتضمين عنصر تحكم فقط ناقل لانصهار الفائدة لتحديد الجهد المناسب لاستخدام. مشيراً إلى المراسل فصل واضح بين نماذج إيجابية وسلبية أمر أساسي لتحليل البيانات، وكذلك أعلاه إشارة خلفية.
    3. لتحديد السكان البكتيرية، وصمة عار على المحور (ص) أحداث الأرض باستخدام الحمض النووي والإمام المبعثر (س).
    4. رسم بوابة إدراج حول الأحداث التي وصمة عار الحمض النووي على حد سواء إيجابية والحجم الصحيح للبكتيريا استناداً إلى مبعثر إلى الأمام (بين 0.5 إلى 2.0 ميكرون المكوّرات س.).
      ملاحظة: تكون صارمة عند تحديد هذه الفئة من السكان كما أنها حاسمة لتشمل الأحداث التي من الواضح أنها في حدود هذه البارامترات. تأكد من أن هذه البوابة لا يشمل جميع الأحداث لعناصر التحكم السلبي في ظل ظروف أخرى. في هذه الدراسة، حوالي 70% السكان خلية اجتمعت هذه الشروط في التحليل.
  2. تحليل عينات الأنسجة بعد التضحية:
    1. Euthanize الحيوانات والحصاد الكلي اليسرى (راجع الخطوة 2، 3) ونقل إلى ضرب حبة أنابيب تحتوي على 1 مل 1 × PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) و 250 ميليلتر من حبات البورسليكات 2 مم.
    2. تعطيل الأنسجة للإفراج عن الخلايا البكتيرية. للكلى واستخدام الخالطون لتعطيل الخلايا. هنا، استخدمت s 30 ثلاث رشقات نارية عند 6800 دورة في الدقيقة مع 1 دقيقة فترات الجليد الرطب بين دورات التبريد للتقليل من عينات التدفئة.
    3. بيليه الحطام الأنسجة أكبر من سينتريفوجينج في 250 x ز لمدة 3 دقائق في ميكروسينتريفوجي منضدية تبريده إلى 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بشكل عام، هناك بيليه خلية في الجزء السفلي من الأنبوب وطبقة من الحطام العائم في الجزء العلوي. طبقة وسطى مائي يحتوي على الخلايا البكتيرية.
    4. نقل 10 ميليلتر من الطبقة المائية في أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة 1.5 مل يحتوي على 1 ميليلتر من الحمض النووي وصمة عار في 989 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (إجمالي حجم 1 مل).
    5. أداء التدفق الخلوي باستخدام نفس المعلمات اقتناء البيانات والنابضة بالنسبة لقاح الأولية.
      ملاحظة: عدد خلايا بكتيرية ستكون منخفضة للغاية نظراً لأن العينة تحتوي أساسا على الحطام الأنسجة. يمكن أيضا استخدام الخيار "بوابة لايف" إذا كانت الخلايا وصمة عار الحمض النووي إيجابية وبوابات الحجم عندما يتم تحميل البيانات إلى التطبيق. هذا سوف يساعد أيضا تحليل أكثر من الأحداث المستهدف وتقليل حجم الملف. يتم عد الأحداث تقريبا 1 مليون لكل عينة، ولكن أكثر الأحداث التهم قد يكون من الضروري تبعاً لخطورة الإصابة وحجم الأنسجة التي تم تحليلها.
    6. تحليل البيانات: تحديد يعني شدة الفلورسنت (MFI) لكل فلوروفوري في عينة معينة باستخدام بوابات إدراج العزم في قسم 4.1.4. تطبيع عينات في برمجيات تحليل تدفق الحدث التهم الموجهة إليه. 10,000 التهم الموجهة إليه عادة ما تكون كافية في التحليل.
      ملاحظة: فإنه ليس من غير المألوف للعثور على العينات التي تحتوي على أقل من هذا العدد من الأحداث أن الأمر يعتمد على شدة الخراج تشكيل والعدوى. الأحداث واستخدام هذا النهج، 500-40,000 توجد عادة في الأنسجة المصابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وضعنا بلازميد المستمدة من بماد32 التي يمكن أن يحقق أي مراسل بناء الانصهار في الكروموسوم من جزئ مثلى كروس مزدوجة (الشكل 1). هذا البناء يسمح للتحليل الكمي لأي منطقة التنظيمية التي تدعم إنتاج البروتين بروتينات فلورية خضراء وإشارة مضيئة فوق الخلفية. بلازميد يمنح المقاومة الأمبيسلّين (Apr) لصيانة ونشر في كولاي ويمنح الاريثروميسين المقاومة (مص) في المذهبة س. كما يمنح البناء المقاومة كلورامفينيكول (صادمن سم)، الذي يسمح بسهولة نقل الانصهار مراسل المتكاملة بين مختلف سلالات متحولة للتحليل الجيني تطورا في المذهبة س.

كدليل على المبدأ، نحن تنصهر فيها نشاط المنطقة التنظيمية نشاط التجارة والنقل. وقد اختير لمنتجها الجينات مطلوب لضراوة الكامل ومطلوب لتقييد الضامة من س المذهبة-التي يسببها الخراجات42، 43. كان إدماج بنية الصبغي كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 4-6 من البروتوكول. ثم نقل إلى AH3926 التي تحتوي على مزيج-تدتوماتوsarAP1ف الانصهار المتكامل. سارة المروج P1 قد ثبت سابقا أن يكون مؤثرا نشط44 وهكذا، تسميات كافة الخلايا.

أننا التحقق أولاً من أن اندماج المراسل كانت نشطة خلال في المختبر يهز النمو قارورة في مرق الصويا تريبتيك (TSB؛ وسيلة غنية ومعقدة) وأن كانت مستويات الأسفار أعلاه الخلفية الفلورية السيارات الخلوية (الشكل 2). لتحديد كيف تتصرف للصحفيين الفلورسنت المجراة في، كان نموذجا خراج كلوي معدلة المستخدمة5. مجموعات من الإناث C57BL/6 الفئران طعن عن طريق الوريد مع زيمبابوي كل الخلايا لاك س المذهبة التي تفتقر إلى اندماج المراسل أو خلايا LAC تحمل اندماج كل نشاط-سجفب و sarAp1-تدتوماتو 1 × 107 . وكانت الحيوانات التضحية ثلاثة أيام بعد الإصابة. ثم، أجهزة المقطوع كانت ثابتة في الفورمالين 10% [v/v] مخزنة، مقطوع البرد، والمصورة بالفحص المجهري [كنفوكل] بعد تلطيخ DAPI كما هو موضح في الخطوات 2 و 3 (الشكل 3أ، ب). حللت الصور باستخدام "صورة ي" وتم قياس fluorescence في وحدة المساحة في الآفات الكلوية. كما هو موضح في الشكل 3جيم، نشاط التجارة والنقل الانصهار الأسفار كان في المتوسط ما يقرب من أعلى 9-fold في الخلايا التي تحمل من الانصهار في الخلايا التي لا تحمل الانصهار مراسل؛ إشارة هذا الأخير يشكل الحد الأقصى للكشف (السيارات-الأسفار) (قارن نشاط-سجفب لأمريكا اللاتينية والكاريبي). وبالمثل، كان فsarAP1-تدتوماتو الانصهار الأسفار ~ 6-fold أعلى من عنصر التحكم لا مراسل (الشكل 3ﻫ، قارن sarAP1--tdT مقابل أمريكا اللاتينية والكاريبي). استخدام التدفق الخلوي، نمط الأنشطة مراسل أكدت استخدام هوموجيناتيس الكلي والتدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوة 4، على الرغم من إضعاف الخلافات في الأسفار كانت أقل (الشكل 3د، و).

من المثير للاهتمام، يبدو البيانات الأسفار من الآفات التي شكلتها الخلايا تحمل اندماج المراسل الفلورسنت إظهار التغير أعلى من تلك التي تفتقر إلى الصحفيين. نحن تساءلت أن كان التباين في القياسات الأسفار ولاحظ نتيجة التعبير غير المتجانسة للصحفيين (أي من أصول بيولوجية). وفي الواقع، مسافة ~ 100 ميكرومتر وجد أن بعض الآفات وأعرب الصحفيين أما أحدهما أو كليهما (الشكل 4). الأهم من ذلك، دراسة النشاط مراسل مع القرار خلية مفردة في المجتمعات الخراج العنقوديات (الحويصلات) كشفت عن التنظيم المكاني نشاط التعبير في الخراجات مقيدة تلطيخ DAPI قوية، يرجح أن المقترنة تكوين وإطلاق خارج الخلية العَدلات الفخاخ (الشكل 5أ-ج)45. على سبيل المثال، قمنا بقياس fluorescence الانصهار سجفب نشاط أعلى بكثير في جوهر الكيس على الهامش (الشكل 5باء وهاء) بالمقارنة مع الداخلية. في الخراج نفسه، النمط للأسفار الانصهار sarAp1-تدتوماتو ويبدو أن مقلوب (الشكل 5د). بيد أن النمط لم يكن معتدا به إحصائيا باستخدام نفس العدد من الحيوانات (الشكل 5واو).

Figure 1
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي من pRB4 بلازميد مراسل التكاملية الجينوم. PRB4 بلازميد مشتق بماد مع مصدر درجة حرارة حساسة للنسخ المتماثل في المذهبة س. (أوري pE194ts). توجد ثلاث علامات مقاومة المخدرات: (ط) بلوخ، يمنح مقاومة الأمبيسلّين في الإشريكيّة القولونية؛ (ثانيا) ارمك، منح المقاومة الاريثروميسين في المذهبة س.؛ (ثالثا) و القط، يمنح مقاومة الكلورامفينيكول في المذهبة س. بناء مراسل يحيط به ~ 500 bp كل من المنبع والمصب تسلسل بسيودوجيني SAUSA300_0087 (مرجع الجينوم: FPR3757) مزدوجة كروس مثلى جزئ والجينوم التكامل. سجفب، أخضر نيون البروتين الجينات؛ خدمات العملاء، وموقع الاستنساخ؛ ترينيداد وتوباغو، فاصل النسخي ثنائي الاتجاه القوى. الشكل ليس بمقياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : أنا ntegrated نشاط-سجفب و sarAp1-تدتوماتو يتم التعبير عن الصحفيين أثناء النمو في المختبر . نمت إلى المرحلة الأسية في TSB المذهبة س لاك الخلايا (البرية من نوع [وزن])، مع ودون نشاط-سجفب (A) أو (ب) sarAp1-تدتوماتو الصحفيين) وإعادة المخفف في المتوسط نفس. تم قياس الكثافة البصرية (OD) والأسفار في قيم الكثافة البصرية المشار إليه. قيم الكثافة طرح الخلفية الفلورية (الإثارة/الانبعاثات: سجفب، 485/535 نانومتر؛ تدتوماتو [tdT]، 535/590 nm) قسمت بقيم الكثافة الضوئية لتوليد "النسبية Fluorescence وحدات". البيانات هي الوسيلة +/-وزارة شؤون المرأة من تجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الصحفيين الفلورسنت مرئية في الأنسجة الكلوية. مجموعات من الفئران C57BL/6 13 تم الطعن عن طريق الوريد مع أمريكا اللاتينية والكاريبي الخلايا أو الخلايا LAC تحمل كل نشاط سجفب و sarAp1-تدتوماتو (tdT)، والعدوى وسمح بالمضي قدما لمدة ثلاثة أيام. كانت euthanized الفئران، وتم تجهيز الأجهزة كما هو موضح في الخطوتين 2 و 3 من البروتوكول. قسم الكلي الممثل تظهر آفات متعددة والأسفار المرتبطة بها (أ) سجفب نشاط و (ب) sarAp1-تدتوماتو. تغيير حجم أشرطة = 250 ميكرومتر (10 x الهدف). وحدات Fluorescence النسبي في وحدة المساحة (رفو [ميكرومتر2]-1) المرتبطة بالآفات الكلوية وقيست باستخدام تحليل الصور كما هو موضح في الخطوة 3، 3 وتم رسمها ل (C) نشاط سجفب و (ه) sarAp1-تدتوماتو؛ كل نقطة تمثل آفة واحدة وأشرطة تبين أن الوسيط؛ 3-5 الآفات حلل كل الماوس. تحليل التدفق الخلوي (د) نشاط سجفب والأسفار الانصهار sarAp1-تدتوماتو (F) في السكان البكتيرية المعزولة من الكلي المصابة هوموجيناتيس ثلاثة أيام بعد الإصابة. تتم الإشارة إلى كثافة Fluorescence يعني (MFI) بشريط الصلبة، وكل نقطة الكلي واحد. أمريكا اللاتينية والكاريبي، ريبورتيرلس البرية من نوع السلالة. الإحصاءات: اختبار مان-ويتني؛ ف < 0.05. البيانات هي الممثل لتجربتين مستقلة. موجات الإثارة للقنوات الأسفار التي كما يلي: DAPI، 405 نانومتر؛ بروتينات فلورية خضراء، 488 نانومتر؛ تدتوماتو، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط. وجمعت بيانات fluorescence المنبعثة عبر مجموعة من الأطوال الموجية: DAPI، 419-481 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ سجفب، 505-551 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ تدتوماتو، 575-630 نيوتن متر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : معرض الخراجات التعبير المتغير للصحفيين في الأنسجة الكلوية. وقد تحدي مجموعات من الفئران C57BL/6 13 مع زيمبابوي في المذهبة س. الخلايا عن طريق الذيل-الوريد 1 × 107 . وكانت الحيوانات euthanized ثلاثة أيام بعد الإصابة. تم حصادها الكلي، ثابتة، ومقطعة للأسفار مجهرية (40 x الهدف) كما هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول. يظهر هي الآفات الثلاث على مقربة مع مستويات متغيرة من (أ) نشاط سجفب والأسفار sarAp1-تدتوماتو (ب). (ج) الحمض النووي من العنقوديات والمضيف يتم الإشارة إلى الخلايا تلطيخ DAPI. يتم دمج قنوات الأخضر والأحمر في (د). واعتبرت نتائج مماثلة في أقسام أخرى. الصور تم الحصول عليها باستخدام هدفا 40 x؛ شريط المقياس = 25 ميكرومتر. موجات الإثارة للقنوات الأسفار التي كما يلي: DAPI، 405 نانومتر؛ بروتينات فلورية خضراء، 488 نانومتر؛ تدتوماتو، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط. وجمعت بيانات fluorescence المنبعثة عبر مجموعة من الأطوال الموجية: DAPI، 419-481 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ سجفب، 505-551 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ تدتوماتو، 575-630 نيوتن متر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : نشاط-سجفب مكانياً وينظم في خراج العنقوديات الصغير-البيئة- ليزر [كنفوكل] مسح الصور مجهرية (كلسم) من آفة المجتمع (SAC) الخراج العنقوديات المذهبة س. سلالة LAC تحمل نشاط-سجفب و sarAp1-تدتوماتو مراسل الأنشطار التي تنتجها. يظهر هي (أ) دمج القنوات نشاط-سجفب sarAp1-تدتوماتو، (ب) نشاط سجفب الفلورية (الأخضر)، (ج) DAPI تلطيخ الأحماض النووية (الأزرق)، و (د) sarAp1-تدتوماتو الفلورية (أحمر). تشير العلامات النجمية إلى الخلايا الموجودة في لب (centroid) وتشير الأسهم إلى الخلايا على الهامش. كثافات الأسفار سجفب نشاط-(ه) و (و) sarAp1-تدتوماتو وترد للخلايا في محيط من الكيس وجوهر. موجات الإثارة للقنوات الأسفار التي كما يلي: DAPI، 405 نانومتر؛ بروتينات فلورية خضراء، 488 نانومتر؛ تدتوماتو، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط. وجمعت بيانات fluorescence المنبعثة عبر مجموعة من الأطوال الموجية: DAPI، 419-481 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ سجفب، 505-551 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ تدتوماتو، 575-630 نيوتن متر. يتم اشتقاق البيانات من الكليتين 8 (واحد لكل الماوس)، والآفات 1-2 تم تصويرها من كل الكلي. أشرطة تشير إلى متوسط. خط متقطع، حد كشف. الإحصاءات: التوزيع الطبيعي للبيانات، للطالب اختبار t (مزاوج)، * * *ف < 0.05. (شريط المقياس = 20 ميكرومتر؛ وينطبق على جميع الصور.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأمراض المعدية البكتيرية مشكلة صحية متزايدة في جميع أنحاء العالم بسبب الحصول على مقاومة المضادات الحيوية محددات46. لأن التكيف مع البيئات المضيف أمر ضروري للنمو والبقاء على قيد الحياة خلال العدوى، استراتيجيات تستهدف البرامج تعبير الجينات التي تزيد من اللياقة البدنية الممرض قد تكون مفيدة علاجية. واحد مثل هذا البرنامج هو مجموعة الجينات التي تسيطر عليها نظام مركبين ساير/S (TCS)، المعروض سابقا تلعب دوراً أساسيا في مأمن التهرب من47. ساير/S هو الناجم عن مجموعة متنوعة من العوامل، لا سيما تلك المرتبطة العَدلات8،20. خلال العدوى، يتسبب المذهبة س رد قوي تحريضية التي يعينون العَدلات والأخرى البالعات إلى موقع الإصابة2. اتبع ترسب تسييل نخر وفيبرينوجين، تشكيل خراج لمنع المزيد من الضرر الأنسجة48. داخل هذه المواقع المتميزة محصنة، تستخدم الخلايا المذهبة س. عدد من المنتجات المعتمدة على ش الجينات لإعادة برمجة الخراج لتسهيل الضرب البكتيرية5،48. واحد ساي-تعتمد على الجينات، نشاط، رموز نوكلاس ويؤيض شبكات لإنتاج 2-ديوكسيادينوسيني لقتل الضامة43. وهكذا، هو نشاط إنزيم يفرز مهمة أساسية لضراوة كامل42 وهو المعرب عنها في فيفو (الشكل 3، الرقم 4، و الشكل 5).

كيف تنمو هذه البكتيريا في البلد المضيف على الرغم من أن عوامل الفوعة في المذهبة س. وقد درست على نطاق واسع، ومنطقة المداريين، كما فهم كيف ينظم في الفسيولوجيا أثناء الإصابة. هنا يصف لنا طريقة لسبر الجينات البكتيرية والسلوك على مستوى خلية مفردة باستخدام ناقل تكاملية معدلة أن يخفف القلق لفقدان بلازميد في غياب التحديد. يسمح منهجيتنا للتصور مباشرة من التعبير الجيني في الخراجات دون الحاجة إلى بيرميبيليزي جدران الخلايا، ودون الحاجة للأجسام المضادة ووضع العلامات. أننا نكتشف التعبير القوى عن الانصهار سجفب نشاط فضلا عن الانصهار sarAp1-تدتوماتو في خراج كلوي الأكياس التي شكلتها الخلايا البرية من نوع ثلاثة أيام بعد الإصابة في نموذج عدوى الجهازية حادة. ومع ذلك، يمكن تعديل التصميم التجريبي للإجابة على أسئلة تتعلق بالتعبير الجيني في مواقع أخرى. في الواقع، نظراً للفئران C57BL/6 قادر على مسح المذهبة س. من أنسجتها، البكتيريا تغزو المواقع التشريحية المتنوعة بما في ذلك نظام الهيكل العظمى (العظام والمفاصل) والدماغ، والقلب والطحال، والكبد، وجميعها مختلفة علم وظائف الأعضاء والخصائص الغذائية5،49. وهكذا، يمكن أن نتعلم الكثير باستخدام S. المذهبة للتحقيق في طبيعة أنسجة المضيف. من المهم ملاحظة أن من المعروف أن بعض منافذ المضيف التاكسج في الطبيعة أو خلاف ذلك يحمل أكسجين قوية تدرج50. البروتينات الفلورية تتطلب الأوكسجين الجزيئي للنشاط، وبعضها أكثر حساسية للضغوط الجزئية الأوكسجين من غيرها51. وبينما نرى fluorescence إشارة عميقة داخل الخراج، قد تكون المقادير نقلل. استخدام البروتينات الفلورية الأمثل كودون تطويرها لاستخدامها في المطثيّة العسيرة التي يمكن استخدامها للتخفيف من حدة هذا القلق52. نقطة ثانية ملاحظة أن البروتينات الفلورية (سجفب وتدتوماتو) التي تنتجها مراسل السلالات المستخدمة في هذه الدراسة مستقرة. ولذلك، تعكس البيانات الفلورسنت تراكم على مدى التجربة بدلاً من استجابة الأخيرة. توليد بنية تحتوي على سجفب غير مستقرة أو جين تدتوماتو أن زيادة كبيرة في الأداة المساعدة للنظام للتجارب الديناميكية.

نظام مراسل الموصوفة هنا يوفر أداة قوية للكمية دراسة الجينات التنظيم في المختبر و في فيفو. بسبب المراسل في نسخة واحدة على الصبغي، فالنظام مناسبة تماما للجينات المعرب عنها بقوة (وهذا، وجود نشاط المروج العالية). السكروز الجينات أو جينات أخرى أعرب الرخيصة قد لا تكون مرئية لأن مستوى الأسفار التعبير يمكن أن تقع الحد الأدنى للكشف أو خلفية السيارات-الأسفار. ومن المعروف أن الموقع ملزم الريبوسوم (RBS) يؤثر على نشاط اندماج المراسل33. حل محتمل لهذه المشكلة هو استخدام RBS أقوى مثل منطقة (TIR) بدء الترجمة53 أو دمج نسخ جنبا إلى جنب من المروجين للفائدة في الكروموسوم. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون مستقرة نسخة متعددة والبلازميدات المستخدمة54.

حد من الأسلوب الموصوفة، خلافا إعداد كدنا من الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنسجة، عدد صغير نسبيا من الجينات يمكن أن استجوب في وقت واحد (محدودة بالقنوات الفلورسنت المتاحة دون التداخل الطيفي). ومع ذلك، ما هو المكتسبة يمكن أن يحتمل أن تكون غنية بالمعلومات أكثر. قرة--بكر وقراءات أخرى أن متوسط السكان الأكبر غير قادر على التقاط عدم تجانس السكان في موقع الإصابة. وفي الواقع، لاحظنا عدم التجانس في مستوى نشاط سجفب والتعبير sarAp1-تدتوماتو بين الآفات الخراج في مقربة (الشكل 4). هذا مماثل لما أبلغت مؤخرا كاسات et al. 55 وفي هذا الوقت، أصل هذا التباين غير معروف. ومع ذلك، توافر المغذيات أو متغير التعريفي لنظم حيازة المواد المغذية الأخرى عوامل المضيف ربما يمكن تفسير هذه الظاهرة. وعلاوة على ذلك، يحدث تفاعل المضيف الممرض داخل ميكرونفيرونمينتس من الأجهزة أو الخراجات التي لها بنية معقدة ثلاثية الأبعاد ومختلف أنواع الخلايا. داخل هذه الهياكل، ويمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا فيما يتعلق بدرجة الحموضة، الاسموليه، الأوكسجين، وتوافر المغذيات، ظاهرة المعروفة باسم تقسيم الأيضية56،57الأنسجة. سيرينديبيتوسلي اكتشفنا أن نمط التنظيم المكاني ينشأ في الخلايا البرية من نوع المقيمين في الخراج (الشكل 5). هذا هو على حد علمنا الملاحظة الأولى من نوعها في مسببات المرض إيجابية أثناء الإصابة. وأفادت اللائحة المكانية هنا هو مماثلة لتلك التي حصل عليها ديفيس et al. في أنسجة الطحال الذي يحتوي على ميكروكولونيس من العوامل الممرضة سلبية الغرام واليرسينيا بسيودوتوبيركولوسيس58. في هذا المثال، أنتجت المضيف أكسيد النيتريك (NO *) حفز خلايا إنتاج أكسيد النيتريك ديوكسيجيناسي (Hmp) في الخلايا في محيط ميكروكولوني الأقرب إلى نشرها لا *، تدخر الداخلية الحاجة إلى الحث على التعبير عن hmp. في الخراجات العنقوديات، التعبير نشاط أقوى في جوهر الكيس، وأضعف على طول المحيط. سبب الخراجات محاطة صفعة العَدلات، المغري إلى التكهن بأن الرموز المستمدة من العَدلات هي توجيه سلوك العنقوديات، استقطاب الخلايا إلى اثنين من السكان متميز phenotypically تذكرنا morphogenic تنظيم التمايز خلال التنمية في أعلى الحياة59. الدعامة الميكانيكية لهذا النمط غير معروف، وهو موضوع دراسة مكثفة في المختبر.

ونحن نعتقد أن لدينا أسلوب يوفر أداة فعالة لدراسة التفاصيل الدقيقة للتعبير الجيني في الخلايا الفردية أثناء الإصابة. الأسلوب الذي يوفر فرصة فريدة لمراقبة وفهم في نهاية المطاف أصول فسيولوجية من عدم التجانس والزخرفة المكانية للتعبير الجيني في أنسجة. هذا السلوك غير متجانسة يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند وضع أساليب العلاج الجديدة، كما قد تكون مستهدفة فقط يتدنى خلايا (أي، الذين يعبرون عن الجينات) بالعلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونحن نشكر ألكسندر هورسويل لهدية فsarAP1-تدتوماتو الانصهار، وكريسويل كارين للمساعدة في تحليل التدفق الخلوي. ونشكر أيضا الملك أليسا لإسداء المشورة بشأن التحليل الإحصائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا "تحكيم البحث" الاستكشافي/الخلقية المعاهد الوطنية للصحة (منحة AI123708) وكلية أموال بدء التشغيل إلى SRB. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسير أو مقرر أن يقدم عمل للنشر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

علم الوراثة، 144 قضية، التعبير الجيني، الفوعة، والأسفار، مجهرية [كنفوكل]، الأنسجة، البكتيريا، الممرض، التنظيم المكاني، "ساي اثنين مكون النظام"، نوكلاس، والكلى، وخراج
أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz,… More

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter