Summary
Beskrivs här är en metod för att analysera bakteriell genuttryck i djurvävnader på cellnivå. Denna metod ger en resurs för att studera den fenotypiska mångfald som inträffar inom en bakteriepopulation svar på vävnad miljön under en infektion.
Abstract
Bakteriella virulensgener är ofta reglerade på transkriptionell nivå av flera faktorer som svarar på olika Miljösignaler. Vissa faktorer verkar direkt på virulensgener; andra styr patogenes genom att justera uttrycket av nedströms tillsynsmyndigheter eller ansamling av signaler som påverkar aktiviteten av regulator. Medan förordning har studerats ingående under in vitro- tillväxt, är relativt lite känt om hur genuttrycket justeras under infektion. Sådan information är viktigt när en särskild gen produkt är en kandidat för terapeutisk intervention. Transkriptionell metoder som kvantitativa, real-time RT-PCR och RNA-Seq är kraftfulla sätt att undersöka genuttryck på global nivå men lider många tekniska utmaningar inklusive låg överflöd av bakteriell RNA jämfört värd RNA, och prov nedbrytning av RNaser. Utvärdera förordning med hjälp av fluorescerande reportrar är relativt lätt och kan vara multiplexade med fluorescerande proteiner med unika spektrala egenskaper. Metoden möjliggör encelliga, spatiotemporal analys av genuttryck i vävnader som uppvisar komplexa tredimensionella arkitektur och fysiokemiska övertoningar som påverkar bakteriella regulatoriska nätverk. Sådan information går förlorad när data är i genomsnitt under bulk befolkningen. Häri, beskriver vi en metod för att kvantifiera genuttryck i bakteriella patogener i situ. Metoden bygger på enkla vävnad behandling och direkt observation av fluorescens från reporter proteiner. Vi visar nyttan av detta system genom att undersöka uttrycket av Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), vars gen produkt krävs för immun skatteflykt och full virulens ex vivo och in vivo. Vi visar att nuc-gfp är starkt uttryckt i nedsatt bölder och avslöja heterogena genuttryck på grund delvis skenbara rumsliga förordning nuc arrangören aktivitet i bölder engagerade med immunsvaret. Metoden kan tillämpas på någon bakterie med en manipulatable genetiska system och någon infektion modell, att ge värdefull information för prekliniska studier och läkemedelsutveckling.
Introduction
Bakterier reagera på förändrade fysiologiska förhållanden och förändringar i den näringsmässiga delstaten sin omgivning genom att differentially uttrycka gener som krävs för anpassning och överlevnad. Exempelvis kolonisera opportunistiska patogener kropp ytor vid relativt låga tätheter, och är ofta ofarliga. Men när bakterien har trängt in fysiska och kemiska hinder, måste det brottas med värd immunceller Counter försvar och begränsade näringsämnen tillgänglighet1. Som ett exempel, Staphylococcus aureus colonizes ungefär en tredjedel av befolkningen asymptomatiskt men är också orsaken till förödande hud och mjukdelsinfektioner, osteomyelit, endokardit och bakteriemi2. Framgången för S. aureus som en patogen är ofta tillskrivas dess metaboliska flexibilitet samt en arsenal av surface-associerade och utsöndrade virulensfaktorer som gör att bakterien att fly i blodomloppet och replikera i perifera vävnader 3,4,5. Eftersom värd dödsfall på grund av staphylococcal sjukdom är en evolutionär återvändsgränd och gränser överföring till nya värdar6, måste åtagandet att virulens factor produktion kontrolleras noga.
Ett komplext regulatoriska nätverk av proteiner och icke-kodande RNAs svarar på en mängd stimuli från omgivningen, inklusive cell densiteten, tillväxtfas, neutrofila-associerade faktorer och näringsämnen tillgänglighet, att säkerställa att virulensgener uttrycks på den exakt tid och plats inom värd vävnader7,8,9,10,11,12,13. Exempelvis reglerar SaeR/S tvåkomponentssystem (TCS) uttryck för flera virulensfaktorer via den sensorn kinase (SAE: er) och svar regulator (SaeR)14. Kapacitetsminskningen är autophosphorylated på ett bevarat histidin rester i svar till värd signaler (t.ex., humana neutrofila peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Phosphorylen gruppen överförs sedan till en aspartat rester på SaeR, aktivera den som en DNA-bindande protein (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS reglerar över 20 gener som bidrar till patogenes inklusive Fibronektin bindande proteiner (FnBPs), leukocidins och koagulas14,18,19,20. Mål kan klassificeras till hög affinitet och låg affinitet gen mål, vilket sannolikt induceras som nivån på SaeR ~ P stiger när de utsätts för sina ledtrådar21. SaeR/S verksamhet styrs av andra regulatorer av genuttryck som Agr quorum sensing systemet, repressor gifter proteinkälla (röta), och den alternativa sigma faktor B (SigB)22,23,24.
NUC är en Sae-beroende virulens gen i Staphylococcus aureus och kodar thermonuclease (Nuc), som är nödvändig för att fly från neutrophilic extracellular trappar (nät) och för spridning under de Kursen infektion25,26. Uttrycket av nuc är också starkt indirekt förträngas av CodY i närvaro av grenade aminosyror och GTP27, och direkt förträngas av proteinet staphylococcal tillbehöret regulator SarA28,29 , vars verksamhet påverkas av syre (redox staten) och pH30. Med tanke på att sae och nuc mutanter är försvagade i musmodeller av infektion, finns det intresse att utveckla kemiska interventioner som hämmar deras motsvarande aktiviteter26,31. Trots detta finns det ingen information angående deras reglering under infektion.
Fluorescerande reportrar har använts för att övervaka och kvantifiera genuttryck på enstaka cellnivå. Häri, presenterar vi en metod för att kvantifiera S. aureus genuttryck under infektion som, när det paras ihop med in vitro-transkriptom analys och kraftfulla avbildningstekniker som magnetisk resonanstomografi (MRT) och magnetisk resonans spektroskopi (MRS), kan avslöja hur bakteriell fysiologi är reglerade i vivo och de relativa förekomsten av näringsämnen i vissa nischer. Metoden kan tillämpas på alla bakteriella patogener med ett fogligt genetiska system.
Översikt av genomet integrativ vektorn.
Den genomet integrativ vektor pRB4 innehåller 500 baspar varje från uppströms och nedströms regioner av det S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene att underlätta homolog rekombination. pRB4 härstammar från temperaturkänsliga pMAD vector ryggraden som innehåller erytromycin resistance kassett (ermC) och termostabila beta-galaktosidas gen bgaB blå/vit screening av rekombinanter32. Den bakåtkompilerade reporter konstruktionen innehåller kloramfenikol motstånd markör (katt) för urval efter genomet integration och plasmid eliminering, liksom mina och Bruno platser till säkring regionen föreskrivande av intresse för superfolder grön fluorescerande protein (sGFP) (figur 1). Det är känt att valet av Ribosomen bindningsstället (RBS) påverkar aktiviteten av reportern, och kräver ofta empiriska optimering33. Således tillhandahålls en RBS inte. Här webbplatsen infödda ribosom bindning används för att ge för ett mer naturligt mönster av genuttryck, men andra platser får användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Georgetown University.
1. generation fluorescerande Reporter stam
- Smälta genomet integrativ pRB4 vector sekventiellt med mina och Bruno restriktionsenzym. Efter tillverkarens protokollet, ställa in en övernattning matsmältningen med Bruno använder 1 µg av pRB4 vid 25 ° C, och fortsätt sedan med den andra matsmältningen för 1h vid 37 ° C genom att lägga till mina reaktionsblandningen. Inaktivera enzymer genom inkubation vid 65 ° C i 20 min.
- PCR förstärka regionen föreskrivande av intresse från genomiskt DNA (i detta fall en ~ 350 baspar DNA-fragment som innehåller thermonuclease [nuc] promotor regionen), införliva en 5' Mina begränsning plats och en 3' Bruno begränsning plats. Sekvensen SmaI erkännande måste vara i-ram med den translationella start-kodon. I denna studie utfördes PCR med en HiFi-DNA polymeras enligt tillverkarens rekommendationer med forward primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') och reverse primer () oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Glödgning temperaturen var 53 ° C. Rena den resulterande fragment med en PCR-sanering efter tillverkarens anvisningar.
- Smälta PCR-produkten med mina och Bruno som utförs i steg 1,1 och ligera det smält DNA-fragmentet till samma platser i pRB4 med T4 DNA-ligase som rekommenderas av tillverkaren för att generera den integrativa konstruktion. Införa ligering blandningen i E. coli och bekräfta konstruera sekvens.
- Electroporate bygga in S. aureus -stam RN4220 som tidigare beskrivits34. I korthet, använda 1 µg av Plasmiden med 70 µL av electro-kompetenta celler (100 Ω, 25 µF, och 2,3 kV) i B2 buljong (1% [volymvikt] kasein hydrolysat, 2,5% [volymvikt] jästextrakt, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [volymvikt] K2PO4, 0,5% [w/v] glukos). Välj för erytromycin resistance (Emr) vid tillåtande temperatur (30 ° C) på tryptic soy agar (TSA) kompletteras med erytromycin (5 µg mL-1) och 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1). De resulterande transformants är blå på grund av plasmid-kodade β-galaktosidas aktivitet.
Obs: Överföring av DNA till kliniska isolat är extremt svårt på grund av en stark begränsning-modifiering barriär35. Således användes S. aureus RN4220 som en mellanliggande mottagare av den fusion bygga eftersom det är begränsningen bristfällig och mycket föränderlig. - Överföra plasmid till S. aureus USA300 stam av intresse med hjälp av elektroporation eller phage-medierad transduktion36 vid tillåtande temperatur. I korthet, sprida Φ11 bacteriophage partiklar på den givaren stam med TSA plattor som innehåller 5 mM CaCl2 övernattning på 30 ° C och sedan sterilisera genom filtrering genom ett 0,45 µM cellulosaacetat spruta filter. Använd lysates för att transduce S. aureus -stam LAC till Emr.
Obs: LAC är en allmänt använd kliniska isolat som gjordes tidigare Em känsliga av seriell passage i TSB medium att bota stam av den infödda plasmiden pUSA03 som ger Emr 37,38. - Integrera konstruktionen av två, på varandra följande homolog rekombination händelser i kromosomen som tidigare beskrivits32. Rekombinanter är kloramfenikol-resistenta (Cmr) på TSA plåtar som innehåller 5 μg mL-1 kloramfenikol, erytromycin-känsliga (Erms) och ingen längre blå.
Obs: När det är möjligt återinföra den markerade fusionen till USA300 via phage-medierad transduktion att undvika ansamling av mutationer som förknippas med in vitro-stam passage39 och temperatur SKIFT.
2. djurens infektion: Förberedelse av inokulatet, systemisk infektion och vävnad behandling
-
Beredning av bakteriell inokulum
- Strimma S. aureus -stammar av intresse för isolering på blodagar tallrikar från en fryst glycerol lager. Inkubera vid 37 ° C för 16 – 24 h att bekräfta Hemolytiskt fenotyper baserat på deras förmåga att lysera röda blodkroppar (RBC) och formulär avmarkerar transparent zoner.
- Initiera övernattning kulturer genom ympning enstaka kolonier varje stam till 4 mL tryptic soy buljong (TSB) i steril glasrör. Rotera rören vid 37 ° C för 16 – 24 h i en tube roller vid cirka ett 70° vinkel och 70 varv per minut [RPM].
- Använd en spektrofotometer för att mäta optisk densitet vid 600 nm (OD600) av kulturer från steg 2.1.2. Använd sterilt medium som en optisk referens (tomt). Späd dessa celler till en OD600 0,05 i 25 ml av sterila Tryptic Soy buljong (TSB) i separata, 125 mL DeLong kolvar (5:1 kolv volym-förhållande) och inkubera kulturer i ett vattenbad (för korrekt värmeöverföring till kulturer), skakningar vid 280 RPM och inställd på 37 ° C.
Obs: Tillväxt av inokulatet kan utföras på olika sätt; en metod för att odla celler till exponentiell fas presenteras. Oavsett, är det viktigt att konsekvent använda samma metod för att förbereda cellerna inympning. - På en OD600 ~ 1, åter späd cellerna till färska medium till en start OD600 0,05 att säkerställa cellerna uppnå exponentiell fas och att faktorer som ansamlas under natten inkubation har reducerats till exponentiell fas nivåer.
- Skörda cellerna under exponentiell fas (OD600 ~0.6–0.8) genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta pellets dubbelt i motsvarande volym av steril 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; pH 7,4).
- Avbryta cellerna i 1 x PBS (pH 7,4) till en koncentration av 1 x 108 kolonibildande enheter (CFUs) mL-1 eller för önskad experimentera.
Obs: är det viktigt att bestämma förhållandet mellan OD600 och CFU mL-1 för varje stam av intresse eftersom stam-beroende förändringar av Cellstorlek och form kan påverka ljusspridande egenskaper och slutligen, den infektion dos.
-
Förberedelse av djuren och bakteriell infektion
- Acklimatisera möss i 7 dagar på renat diet AIN-93. Kosten är framtagen för att ge tillräcklig näring samtidigt minska vävnad auto-fluorescens samband med konsumtion av växtbaserade ingredienser som används i vanlig mus chow40.
Obs: C57/BL6 honmöss (6-8 veckor gamla) används här, men musen belastningen och kön beror på studien. - Innan infektion, vidgas mus svans vener med ljummet vatten.
- Infektera djuren genom att injicera 100 µL av den bakteriella inokulatet via svans-vener att producera en systemisk infektion. Spara en alikvot av det inledande inokulatet om utföra flödescytometri (se avsnitt 4).
- Övervaka djur dagligen och utvärdera deras hälsostatus som använder ett övervakningssystem granskats och godkänts av en institutionell djur vård och användning kommittén.
- Tillåta infektionen till framsteg under önskad. Här är experimenten avslutat 3 dagar efter infektion.
Obs: Under dessa förhållanden består bölder av en stafylokock abscess gemenskap av bakterier, omges av fibrin insättningar, och omges av koncentriska lager av immunceller5,41.
- Acklimatisera möss i 7 dagar på renat diet AIN-93. Kosten är framtagen för att ge tillräcklig näring samtidigt minska vävnad auto-fluorescens samband med konsumtion av växtbaserade ingredienser som används i vanlig mus chow40.
-
Skörda organ och vävnad behandling
- Euthanize djuren av CO2 inandning och cervikal dislokation som en sekundär metod och utför obduktion.
- Skörda njure (höger) och andra vitala organ (hjärta, lever, lungor, mjälte) och överför till 15 mL polypropylene rören som innehåller 10% [v/v] buffrad formalin. Fortsätt med dessa organ att kliva 2.3.4 nedan.
- Överföra den vänstra njuren till en steril 2 mL slagtålig tub som innehåller ~ 500 µL av 2 mm kvarts pärlor och 1 mL steril 1 x PBS (pH 7,4). Fortsätt med detta organ till steg 4,2.
- Tillåta organ från steg 2.3.2 fixar i mörker vid rumstemperatur med milda skakningar eller rotation för minst 24 timmar, men inte mer än 48 timmar.
- Bädda in organ i tydlig vävnad frysning medium och lagra vävnader vid-80 ° C.
- Använda en kryostaten, avsnitt vävnad i skivor 10 µm tjocklek.
- Torka i avsnitt på en pre rengjorda, laddade glasskiva i 20 min i mörker, applicera hårt monteringsmedium med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) fläcken, och applicera täckglas. Bota monterade diabilder i rumstemperatur över natten, och överföra till 4 ° C för långsiktig lagring.
3. laserscanning konfokalmikroskopi och bildbehandling
- Undersöka monterade diabilder för att lokalisera lesioner med hjälp av lasrar lämpliga för fluorescerande reportern som används. I detta fall, grön (GFP), röd (tdTomato) och blå (DAPI) fluorescens används signaler.
- Förvärva bilden med lämpliga mål för att visualisera enskilda celler (t.ex. 20 x eller 40 x mål används vanligtvis).
-
Mäta fluorescens stödnivåerna i confocal bilder.
- Öppna den confocal bilden i bild J och justera ljusstyrka/kontrast för att ordentligt visualisera fluorescens signalen av lesionen.
- Definiera regionen av intresse, och med hjälp av tröskelvärde alternativet, ange nedre och övre fluorescens gränser som behövs.
- Definiera centroiden genom att välja område → grå medelvärdet → centroiden → begränsa tröskelvärdet för under fliken analysera i bild J.
- Extrahera centroiden fluorescens intensitetsvärdet eller mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten i en viss lesion per ytenhet (genomsnittlig fluorescensintensiteten, MFI) för god Jordbrukarsed och tdTomato. Här, användes områden av en µm2 .
Obs: En blindad andra analys minimerar bias när provet identitet är känd. - Plotta data och utföra lämpliga statistiska analyser för varje jämförelse.
4. Flödesanalys flödescytometri
-
(Valfritt) Bestäm fusion aktivitet av inokulatet dag av infektionen (från avsnitt 2.2.3)
- Till 899 µL av 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (pH 7,4) tillsätt 100 µL av varje inokulatet och 1 µL membran diffusionskoefficient nukleinsyra fläckar (se Tabell för material). Som en kontroll, vara noga med att inkludera ett prov som saknar nukleinsyra fläcken.
- Utföra flödescytometri på alla prover.
Obs: För det första experimentet är det användbart att inkludera en vektor endast kontroll för fusion av intresse att bestämma korrekt spänningen till använda. En tydlig åtskillnad mellan positiva och negativa prover är viktigt för analys av data, som visar reportern är väl över bakgrund signal. - För att identifiera den bakteriella populationen, rita händelser med hjälp av nukleinsyra fläcken (y-axeln) och vidarebefordra scatter (x-axeln).
- Rita en inkludering grind runt händelser som är både nukleinsyra fläcken positiva och rätt storlek av bakterien baserat på framåt scatter (mellan 0,5 till 2,0 µm för S. aureus).
Obs: Vara noggranna när de identifierar denna patientgrupp eftersom det är kritiskt att inkludera händelser som är tydligt inom dessa parametrar. Var noga med detta utfärda utegångsförbud för utesluter alla händelser för de negativa kontrollerna under andra förhållanden. I denna studie, ungefär 70% cell befolkningen uppfyllde dessa krav i analysen.
-
Analys av vävnadsprover efter offer:
- Euthanize djuren, skörda vänster njurarna (se punkt 2.3) och överföring till bead-slog rör innehållande 1 mL av 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (pH 7,4) och 250 µL av 2 mm Borsilikat pärlor.
- Störa vävnader för att släppa bakterieceller. För njurarna, använda en Homogenisatorer för att störa celler. Här, användes tre 30 s skurar vid 6800 rpm med 1 min kylning perioder på våt is mellan cykler att minimera värme prover.
- Pellet större vävnad skräp genom centrifugering vid 250 x g i 3 min i en bordsskiva mikrocentrifug kylas till 4 ° C.
Obs: Det är vanligtvis en cellpelleten längst ned på röret och ett lager av flytande skräp på toppen. Mellersta vattenskiktet innehåller bakteriecellerna. - Överför 10 µL från vattenskiktet i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 1 µL av nukleinsyra fläcken i 989 µL PBS (total volym 1 mL).
- Utföra flödescytometri med samma data förvärv parametrar och gating när det gäller de ursprungliga inokulat.
Obs: Bakteriella blodkroppar blir mycket låg eftersom provet innehåller huvudsakligen vävnad skräp. Alternativet ”Live gate” kan också användas om cellerna är nukleinsyra fläcken positiva och storlek-gated när data läses in i programmet. Detta hjälper även att analysera flera av målet händelser och minska filstorleken. Nästan en miljon händelser per prov räknas, men mer event räknas kan vara nödvändigt beroende på svårighetsgraden av infektionen och storlek av vävnad som analyseras. - Dataanalys: Bestämma menar fluorescerande intensitet (MFI) för varje fluorophore i ett givet prov via integration portar bestäms i avsnitt 4.1.4. Normalisera prover i mjukvara Flödesanalys till händelsen räknas. 10 000 punkter är vanligen tillräckligt i analysen.
Obs: Det är inte ovanligt att hitta prover som innehåller mindre än detta antal händelser eftersom detta är beroende av abscess formation och infektion svårighetsgrad. Använder denna metod, 500-40.000 finns evenemang normalt i infekterad vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utvecklade en plasmid som härrör från pMAD32 som kan leverera någon reporter fusion konstruera i kromosomen av dubbla crossover homolog rekombination (figur 1). Denna konstruktion möjliggör kvantitativ analys av någon reglerande region som stöder produktionen av GFP protein och fluorescerande signal ovanför bakgrund. Plasmiden ger ampicillin-resistens (Apr) för underhåll och förökning i E. coli och ger erytromycin resistens (Emr) i S. aureus. Konstruktionen ger också kloramfenikol resistens (Cmr), vilket möjliggör enkel överföring av integrerade reporter fusion mellan olika muterade stammar för sofistikerade genetisk analys i S. aureus.
Som bevis för principen, smält vi den nuc reglerande regionen att gfp. nuc valdes eftersom dess genprodukten krävs för full virulens och krävs för att begränsa makrofager från S. aureus -inducerad bölder42, 43. Konstruktionen var integrerad i kromosomen som beskrivs i steg 1.4-1.6 i protokollet. Den integrerade fusionen överfördes sedan till AH3926 som innehåller en PsarAP1- tdTomato fusion. SarA P1 Arrangören har visat tidigare att vara konstitutivt aktiv44 och således etiketter alla celler.
Vi verifierat först att de reporter fusioner var aktiv under in vitro skaka kolven tillväxt i Tryptic Soy buljong (TSB; en rik, komplex medium) och att nivåerna av fluorescens var över cellulära auto-fluorescerande bakgrunden (figur 2). För att avgöra hur de fluorescerande reportrarna uppträder i vivo, var en modifierad njurabscess modell används5. Grupper av kvinnliga C57BL/6 möss utmanades intravenöst med 1 x 107 CFU varje av S. aureus LAC celler saknar reporter fusioner eller LAC celler bär både nuc-sGFP och sarAp1-tdTomato fusioner. Djuren var offrade tre dagar efter infektion. Sedan skördade organ har fastställts i 10% [v/v] buffrad formalin, cryo-sektioneras och avbildad av konfokalmikroskopi efter DAPI färgning som beskrivs i steg 2 och 3 (figur 3A, B). Bilderna analyserades med bild J och fluorescens per ytenhet i de renala lesionerna mättes. Som visas i figur 3C, var nuc-gfp fusion fluorescens i genomsnitt nästan 9 högre i celler som bär fusion än i celler som inte transporterar reporter fusion; den sistnämnda signalen utgör detektionsgränsen (auto-fluorescens) (jämför nuc-sGFP till LAC). Likaså PsarAP1- tdtomato fusion fluorescens var ~ 6 gånger högre än den någon reporter kontroll (figur 3E, jämför sarAP1- tdT vs LAC). Med hjälp av flödescytometri, mönstret av reporter aktiviteter bekräftades med hjälp av njure homogenates och flödescytometri som beskrivs i steg 4, om luckan skillnader i fluorescens var lägre (figur 3D, F).
Intressant, tycktes fluorescens data från lesioner som bildas av celler bära fluorescerande reporter fusioner Visa högre variabilitet än de saknar reportrar. Vi undrade om variationen i fluorescens mätningar observerade var på grund av heterogena uttryck av reportrarna (det vill säga biologiska ursprung). Ja, inom ~ 100 µm avstånd konstaterades det att vissa lesioner uttryckt antingen en eller båda reportrar (figur 4). Ännu viktigare, att undersöka reporter aktivitet med enstaka cell upplösning i staphylococcal abscess samhällen (SBO) avslöjade rumsliga förordning nuc uttryck i bölder avgränsat med stark DAPI färgning, sannolikt associerade med den bildning och frisättning av neutrofila extracellulära fällor (figur 5A-C)45. Vi mätte till exempel betydligt högre nuc-sGFP fusion fluorescens i den inredda kärnan av SAC jämfört med i periferin (figur 5B, E). I samma abscess, mönstret för sarAp1-tdTomato fusion fluorescens föreföll vara inverterad (figur 5D). Mönstret var dock inte statistiskt signifikant med samma antal djur (figur 5F).
Figur 1 : Schematisk framställning av genomet integrativ reporter plasmiden pRB4. Plasmiden pRB4 är ett derivat av pMAD med en temperatur känslig ursprunget för replikering i S. aureus (Ori pE194ts). Det finns tre drog resistens markörer: (i) bla, ger resistens mot ampicillin i Escherichia coli; (ii) ermC, ger erytromycin resistens i S. aureus; och (iii) katt, ger resistens mot kloramfenikol i S. aureus. Den reporter bygga flankeras av ~ 500 bp varje från uppströms och nedströms sekvenser av pseudogene SAUSA300_0087 (referera genomet: FPR3757) för dubbla crossover homolog rekombination och arvsmassan integration. sGFP, grönt fluorescerande protein genen; CS, kloning webbplats; TT, stark dubbelriktad transkriptionell terminator. Siffran är inte skalenlig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Jag ntegrated NUC-sGFP och sarAp1-tdTomato reportrar uttrycks under in vitro-tillväxt . S. aureus LAC celler (wild-type [WT]), med och utan den (A) nuc -sGFP eller (B) sarAp1-tdTomato reportrar) var vuxit till exponentiell fas i TSB och åter utspädd i samma medium. Vid de angivna optiska density värdena mättes optiska densitet (OD) och fluorescens. Bakgrund-subtraheras fluorescens intensitetsvärden (excitation/utsläpp: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) delades av optisk densitet värdena att generera relativa fluorescens enheter. Data är medel + / SEM från två oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Fluorescerande reportrar är synliga i nedsatt vävnad. Grupper av 13 C57BL/6 möss utmanades intravenöst med LAC celler eller LAC celler bär både nuc-sGFP och sarAp1-tdTomato (tdT), och infektionen tilläts fortsätta i tre dagar. Möss var euthanized och organ bearbetades enligt beskrivningen i steg 2 och 3 i protokollet. Representativa njure avsnitt visar multipla lesioner och den associerade fluorescensen för (A) nuc-sGFP och (B) sarAp1-tdTomato. Skala barer = 250 µm (10 x-objektiv). Den relativa fluorescens enheter per ytenhet (RFU [μm2]-1) med renala lesioner mättes med bildanalys enligt beskrivningen i steg 3.3 och var ritade för (C) nuc-sGFP ochE sarAp1-tdTomato; varje prick representerar en lesion och staplarna anger medianen; 3-5 lesioner analyseras per mus. Flödesanalys för flödescytometri (D) nuc-sGFP och (F) sarAp1-tdTomato fusion fluorescens i bakteriell populationer isoleras från infekterade homogenates tre dagar post njurinfektion. Menar fluorescens intensitet (MFI) indikeras av solid bar, och varje punkt är en njure. LAC, reporterless vildtyp stam. Statistik: Mann-Whitney Test; p < 0,05. Data är representativa för två oberoende experiment. Magnetiseringen våglängder för fluorescens kanalerna är följande: DAPI, 405 nm. GFP, 488 nm. tdTomato, 561 nm. Utsläppta fluorescens data samlades över ett spektrum av våglängder: DAPI, 419-481 nm. sGFP, 505-551 nm. tdTomato, 575-630 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bölder uppvisar varierande uttryck för reportrar i nedsatt vävnader. Grupper av 13 C57BL/6 möss utmanades med 1 x 107 CFU av S. aureus celler via svans-venen. Djuren var euthanized tre dagar efter infektion. Njurarna har skördats, fasta och sektionerad för fluorescensmikroskopi (40 x-objektiv) som beskrivs i steg 2 i protokollet. Visas tre lesioner i närheten med varierande nivåer av (A) nuc-sGFP och (B) sarAp1-tdTomato fluorescens. (C)-nukleinsyra från stafylokocker och värd celler indikeras av DAPI färgningen. De gröna och röda kanalerna slås samman i (D). Liknande resultat sågs i andra avsnitt. Bilderna förvärvades använder ett 40 x-objektiv; Skalstapeln = 25 µm. Magnetiseringen våglängder för fluorescens kanalerna är följande: DAPI, 405 nm. GFP, 488 nm. tdTomato, 561 nm. Utsläppta fluorescens data samlades över ett spektrum av våglängder: DAPI, 419-481 nm. sGFP, 505-551 nm. tdTomato, 575-630 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : NUC-sGFP regleras rumsligt i staphylococcal abscess mikro-miljön. Confocal laserscanning mikroskopi (CLSM) bilder av en stafylokock abscess gemenskapen (SAC) lesion produceras av S. aureus -stam LAC redovisade nuc-sGFP och sarAp1-tdTomato reporter fusioner. Visas är (A) samman kanaler för nuc-sGFP och sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescens (grön), (C), DAPI färgning av nukleinsyror (blå), och (D), sarAp1-tdTomato fluorescens (röd). Asteriskerna visar celler i kärnan (centroiden) och pilar indikerar celler i periferin. Fluorescens stödnivåerna för (E) nuc -sGFP och (F) sarAp1-tdTomato visas för celler i kärna och periferi av SAC. Magnetiseringen våglängder för fluorescens kanalerna är följande: DAPI, 405 nm. GFP, 488 nm. tdTomato, 561 nm. Utsläppta fluorescens data samlades över ett spektrum av våglängder: DAPI, 419-481 nm. sGFP, 505-551 nm. tdTomato, 575-630 nm. Uppgifterna hämtas från 8 njurar (en per mus) och 1-2 lesioner var avbildade från varje njure. Staplarna anger medianen. Streckad linje, detektionsgränsen. Statistik: Normal distribution av data, Students t-test (oparade), ***p < 0,05. (Skalstapeln = 20 µm, gäller för alla bilder.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriella infektionssjukdomar är ett ökande hälsoproblem över hela världen på grund av förvärvet av antibiotikaresistens bestämningsfaktorer46. Eftersom anpassning till värdmiljöer är viktigt för tillväxt och överlevnad under infektion, strategier inriktning gen uttryck program som ökar patogen fitness kan visa sig användbar terapeutiskt. Ett sådant program är uppsättningen av gener som kontrolleras av den SaeR/S tvåkomponentssystem (TCS), visat tidigare att spela en viktig roll i immunförsvaret skatteflykt47. SaeR/S induceras av en rad faktorer, särskilt de som förknippas med neutrofiler8,20. Under infektion framkallar S. aureus en stark inflammatorisk reaktion där neutrofiler och andra fagocyter rekryteras till platsen för infektion2. Kondensering nekros och fibrin nedfall följer, bildar en abscess för att förhindra ytterligare vävnad skada48. Inom dessa immun privilegierade platser använder S. aureus celler ett antal Sae-beroende genprodukter för att omprogrammera abscess för att underlätta bakteriell multiplikation5,48. En Sae-beroende gen nuc, koder för nuclease och metaboliserar nät för att producera 2'-deoxyadenosin för att döda makrofager43. Nuc är således ett viktigt utsöndrade enzym som är viktigt för full virulens42 och är uttryckta i vivo (figur 3, figur 4och figur 5).
Även om virulensfaktorer av S. aureus har studerats ingående, är hur bakterien växer i mottagande ett understudied område, som är att förstå hur dess fysiologi regleras under infektion. Här beskriver vi en metod för avsökning av bakteriell genuttryck och beteende på den enda cellnivå med hjälp av en modifierad integrativ vektor som mildrar oro för plasmid förlust i avsaknad av urval. Vår metodik tillåter direkt visualisering av genuttryck i bölder utan att behöva permeabilize cellväggar och utan behov av antikroppar och märkning. Vi upptäckte starkt uttryck av nuc-sGFP fusion samt sarAp1-tdTomato fusion i njurabscess vätskefyllda blåsor bildas av vildtyp celler tre dagar efter infektion i en akut systemisk infektion modell. Experimentell design kan dock ändras för att besvara frågor angående genuttryck på andra platser. Verkligen, eftersom C57BL/6 möss inte går att rensa S. aureus från deras vävnader, bakterier invadera olika anatomiska platser inklusive skelettet (skelett och leder) och hjärnan, hjärtat, mjälten och levern, som alla har olika fysiologi och näringsmässiga egenskaper5,49. Således kan mycket läras genom att använda S. aureus sond beskaffenhet värd vävnader. Det är viktigt att notera att det är känt att vissa värd nischer är hypoxisk i naturen eller annars uppvisar en stark syre lutning50. Fluorescerande proteiner kräver molekylärt syre för aktivitet, och vissa är mer känsliga för oxygen partialtryck än andra51. Medan vi se fluorescens signal djupt inom abscess, storheter kan vara en underskattning. Använda kodon-optimerade fluorescerande proteiner som utvecklats för användning i Clostridium difficile kunde användas för att lindra denna oro52. En andra punkt att notera är att de fluorescerande proteiner (sGFP och tdTomato) som produceras av reporter stammar används i denna studie är stabila. De fluorescerande data speglar därför ackumulering under loppet av experiment i stället för en nyligen svar. Generera en konstruktion som innehåller en instabil sGFP eller tdTomato gen skulle kraftigt öka nyttan av systemet för dynamisk experiment.
Reporter systemet beskrivs här ger ett kraftfullt verktyg för att kvantitativt studera genen förordning in vitro- och in vivo. Eftersom reportern upprätthålls i exemplar på kromosomen, är systemet väl lämpad för starkt uttryckt gener (som är, att ha hög arrangören aktivitet). Biosyntetiska gener eller andra ödmjuk uttryckt gener syns inte eftersom nivån av fluorescens uttryck kunde falla under gränsen för upptäckt eller bakgrund auto-fluorescens. Det är känt att Ribosomen bindningsstället (RBS) påverkar aktiviteten av reporter fusioner33. En möjlig lösning på detta problem är att använda en starkare RBS såsom översättning inledande regionen (TIR)53 eller att integrera tandem kopior av främjare av intresse i kromosomen. Alternativt kan stabil flera exemplar plasmider vara begagnade54.
En begränsning av den metod som beskrivs är att, till skillnad från en cDNA förberedelse från RNA som utvinns ur vävnader, ett relativt litet antal gener kan förhöras samtidigt (begränsas av tillgängliga fluorescerande kanaler utan spektrala överlappning). Men kan vad är vunnit vara potentiellt mer informativ. qRT-PCR och andra utläsningar att den genomsnittliga befolkningens bulk förmår fånga befolkningen heterogenitet på platsen för infektionen. Faktiskt, vi observerade heterogenitet i nivån på nuc-sGFP och sarAp1-tdTomato uttryck mellan abscess lesioner i närheten (figur 4). Detta liknar vad rapporterades nyligen av Cassat o.a. 55 vid denna tid, denna heterogenitet ursprung är inte känt. Men kunde näringsämnen tillgänglighet, variabel induktion av näringsämne förvärv system eller andra värd faktorer möjligen förklara fenomenet. Dessutom sker värd-patogen interaktionen inom mikromiljö av organ eller bölder som har komplexa tredimensionella struktur och olika celltyper. Inom dessa strukturer, kan vävnader variera avsevärt med avseende på pH, osmolaritet, syresättning och näringsämnen tillgänglighet, ett fenomen som kallas metabola Colouir56,57. Serendipitously upptäckte vi att ett mönster av rumsliga förordning uppstår vildtyp celler som är bosatta i abscess (figur 5). Detta är att vår kunskap den första observationen av sitt slag i grampositiva patogener under infektion. Rumsliga förordningen rapporterade här är liknande som erhölls av Davis et al. mjälten vävnad innehållande microcolonies av gramnegativ patogen Yersinia pseudotuberculosis58. I det fallet, värd produceras kväveoxid (NO *) stimuleras produktionen av kväveoxid dioxygenas (Hmp) i celler i periferin av microcolony som är närmast den diffuserande nr *, sparsam inredning celler behöver inducerar uttryck av hmp. I staphylococcal bölder är nuc uttryck starkast på kärnan i SAC, och svagaste längs periferin. Eftersom bölden är omgiven av en manschett av neutrofiler, är det frestande att spekulera att neutrofiler-derived cues vägleder beteendet hos de stafylokocker, polariserande cellerna in två fenotypiskt distinkta populationer som påminner om morfogena reglering av differentiering under utveckling i högre liv59. Den mekanistiska basen av detta mönster är okänt och är föremål för intensiv studie i vårt laboratorium.
Vi tror att vår metod ger ett effektivt verktyg för att studera de fina detaljerna av genuttryck i enskilda celler under infektion. Metoden ger en unik möjlighet att observera och så småningom förstå fysiologiska beskärningarna av heterogenitet och rumsliga mallning av genuttryck i vävnader. Denna heterogena beteende måste beaktas vid utveckling av nya behandlingsformer, som endast en subpopulation av celler (dvs.de som uttrycker generna) kan riktas av den terapeutiska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Alexander Horswill för gåvan av PsarAP1- tdTomato fusion och Karen Creswell för hjälp med flödescytometri Flödesanalys. Vi tackar också Alyssa King för råd om statistisk analys. Detta arbete finansierades delvis av en NIH undersökande/utvecklings Research Award (grant AI123708) och start fakultetsmedel till SRB. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning eller beslutet att lämna arbetet för publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
- Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
- Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
- Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
- Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
- Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
- Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
- Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
- Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
- Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
- Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
- Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
- Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
- Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
- Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
- Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
- Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
- Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
- Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
- Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
- Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
- Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
- Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
- Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
- Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
- Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
- Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
- Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
- Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
- Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
- Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
- Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
- Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
- Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
- Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
- Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
- Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
- Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
- Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
- Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
- Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
- Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
- Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).
