Summary
여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.
Abstract
세균성 독성 유전자는 다른 환경 신호에 응답 하는 여러 요인에 의해 종종 transcriptional 수준에서 통제 된다. 몇 가지 요인을 행동 직접 독성 유전자; 다른 다운스트림 레 귤 레이 터의 식이나 레 귤 레이 터 활동에 영향을 주는 신호의 축적을 조정 하 여 병을 제어 합니다. 레 귤 레이 션 생체 외에 성장 하는 동안 광대 하 게 공부 하고있다, 동안 상대적으로 작은 유전자 발현은 감염 시 조정 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 이러한 정보는 특정 유전자 제품은 치료 적 개입에 대 한 후보 때 중요 하다. Transcriptional 접근 같은 양적, 실시간 RT-PCR 및 RNA-Seq는 글로벌 수준에 유전자 발현 검사 하지만 호스트 RNA 및 샘플에 비해 세균 RNA의 낮은 풍부를 포함 하 여 많은 기술 문제에서 고통 하는 강력한 방법을 RNases에 의해 저하입니다. 평가 규칙 형광 기자를 사용 하 여 상대적으로 쉽게 하 고 독특한 스펙트럼 특성을 가진 형광 성 단백질으로 다중화 될 수 있다. 메서드는 복잡 한 3 차원 건축과 physiochemical 그라디언트 세균성 규제 네트워크에 영향을 주는 조직에서 유전자 발현의 단일 셀, spatiotemporal 분석 할 수 있습니다. 이러한 정보는 데이터 대량 인구 이상 평균 하는 때 손실 됩니다. 여기, 세균성 병원 체 제자리에서 유전자 발현을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 간단한 조직 처리 및 기자 단백질에서 형광의 직접 관찰을 기반으로 합니다. 우리는 포도 상 구 균 thermonuclease (nuc), 유전자 제품 면역 회피 및 전 비보, vivo에서 전체 독성은의 식을 검사 하 여이 시스템의 유틸리티를 보여 줍니다. 우리는 nuc gfp 신장 농 양 표현 하는 표시 완전히 면역 응답에와 함께 종사 하는 농에 nuc 발기인 활동의 명백한 공간 규정에 인해 이질적인 유전자 발현을 일부 공개. 까지의 유전자 시스템 어떤 박테리아와 감염 모델, 전 임상 연구 및 신약 개발에 대 한 귀중 한 정보를 제공 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.
Introduction
박테리아는 차동 적응과 생존에 필요한 유전자를 표현 하 여 생리 적 조건 및 그들의 환경에의 영양 상태에 변경 변경에 응답 합니다. 예를 들어, 기회 주의 병원 체는 몸 표면에 상대적으로 낮은 밀도, 그리고 자주 무해 한 식민지. 그러나, 박테리아는 물리적, 화학적 장벽을 침투 하 고, 일단 그것은 호스트 면역 세포 카운터 방어와 제한 된 양분 가용성1맞설 까 해야 합니다. 예를 들어, 황색 포도상구균 인구의 약 1/3를 asymptomatically colonizes 하지만 치명적인 피부 및 연 조직 감염, 도왔습니다, 심장 내 막 염, 그리고 bacteremia2의 원인입니다. S. 구 균 병원 체로 서의 성공은 종종 대사 유연성 뿐만 아니라 혈 류를 탈출 하 고 주변 조직 에서에서 복제에 박테리아 수 있도록 표면에 연결 하 고 분 비 독성 요인의 특성을 사용합니다 3,,45. 호스트 죽음 포도 질병 때문 이며 진화 막다른 한계 전송 새 호스트6, 때문에 독성 요소 생산 하겠다는 신중 하 게 제어 해야 합니다.
밀도, 성장 단계, neutrophil 관련 요인, 및 독성 유전자가에 표현 되도록 양분 가용성 단백질 및 비 코딩 RNAs 응답 다양 한 환경 자극의 복잡 한 규제 네트워크, 세포 등에서 정확한 시간과 위치 호스트 조직7,8,9,10,11,,1213. 예를 들어, SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS) 조절 센서 키 (SaeS)와 응답 레 귤 레이 터 (SaeR)14를 통해 여러 독성 요인의 표현. SaeS는 호스트 신호 (예:, 인간 호 중구 펩 티 드 [HNPs] calprotectin)8,,1516응답에서 보존된 히스티딘 잔류물에 autophosphorylated입니다. Phosphoryl 그룹은 다음 aspartate 잔류물에 전송 SaeR, DNA 묶는 단백질으로 활성화 (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS fibronectin 의무적인 단백질 (FnBPs), coagulase14,18,,1920, leukocidins, 등 병 인에 기여 하는 20 개 이상의 유전자를 통제 한다. 대상 SaeR의 수준으로 유발 확률이 높은 친 화력과 낮은 선호도 유전자 대상으로 분류 될 수 있다 ~ P 상승의 신호21에 노출 되 면. SaeR/S 활동 Agr 쿼럼 감지 시스템 같은 유전자 발현의 다른 레 귤 레이 터, 독 소 단백질 (썩 음), 그리고 대체 시그마 요인 B (SigB)22,,2324의 진압에 의해 제어 됩니다.
nuc 황색 포도상구균 에 성폭력 종속 독성 유전자 이며 neutrophilic extracellular t비난 (그물)에서 탈출 한 동안 보급을 위한 필수적 이다 thermonuclease (Nuc)를 인코딩하는 감염25,26의 과정. Nuc 의 식은 강하게 직접 측 쇄 사슬 아미노산, GTP27, 존재 코디에 의해 하지 억압 이며 직접 포도 액세서리 레 귤 레이 터 단백질 사라28,29에 의해 억압 , 그의 활동이 산소 (산화 환 원 상태)와 산도30에 의해 좌우 된다. 성폭력 및 nuc 돌연변이 감염 마우스 모델에서 감쇠는, 그에 주어진 그들의 해당 활동26,31을 억제 하는 화학 개입 개발에 관심이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 감염 시 그들의 규제에 관한 어떠한 정보도가 있다.
형광 기자 모니터링 하 고 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 정량 사용 되었습니다. 여기, 우리는 S를 측정 하는 방법 제시. 감염 시 균 유전자 발현,와 결합 될 때 체 외 transcriptome 분석 및 자기 공명 영상 (MRI) 및 자기 공명 음 분광학 (MRS) 같은 강력한 이미징 기술을 계시 할 수 있다 어떻게 세균 생리학은 vivo 및 특정 틈새에서 영양소의 상대적 나타났는데에서 통제 된다. 메서드는 그러므로 유전 시스템과 어떤 세균성 병원 체에 적용할 수 있습니다.
게놈 통합 벡터의 개요입니다.
게놈 통합 벡터 pRB4 500 기본 쌍 각 동종 재결합을 촉진 하기 위하여 S. 구 균 USA300 SAUSA300_0087 pseudogene의 상류와 하류 지역에서 포함 되어 있습니다. pRB4는 리스로 마이 신 저항 카세트 (ermC)와 recombinants32의 블루/화이트 심사에 대 한 내 베타-galactosidase 유전자 bgaB 를 포함 하는 온도 민감한 pMAD 벡터 등뼈에서 파생 됩니다. 조작된 기자 구문 또한 들어 페니 저항 마커 (고양이) 게놈 통합 및 플라스 미드 제거 뿐만 아니라 관심 superfolder 녹색 규제 영역을 융합 EcoRI와 SmaI 사이트 후 선택 형광 성 단백질 (sGFP) (그림 1). 그것은 알려져 그 리보솜 바인딩 사이트 (RBS)의 기자의 활동에 영향을 하며 종종 경험적 최적화33. 따라서,는 RBS는 제공 되지. 여기, 네이티브 리보솜 바인딩 사이트는 유전자 발현의 좀 더 자연 스러운 패턴에 대 한 제공 하는 데 사용 됩니다 하지만 다른 사이트를 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 조지타운 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 형광 기자 스트레인의 발생
- 게놈 통합 pRB4 벡터 순차적으로 EcoRI 및 SmaI 금지 효소로 소화. 제조 업체의 프로토콜을 따르고 25 ° C에서 1 µ g의 pRB4 사용 하 여 SmaI와 하룻밤 소화를 설정 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 두 번째 소화 EcoRI 반응 혼합물에 추가 하 여 진행. 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 효소 비활성화.
- PCR 증폭의 genomic DNA에서 (이 경우는 ~ 350 기본적인 쌍 DNA 파편 포함 하는 thermonuclease [nuc] 발기인 지역), 규제 지역 5' EcoRI 금지 사이트와 3' SmaI 제한 사이트. SmaI 인식 시퀀스 프레임에 있어야 변환 시작 codon로. 이 연구에서 PCR 뇌관 앞으로 oRB015와 제조 업체의 권장 사항에 따라 높은 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 수행 되었다 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') 및 뇌관 oRB016 (역 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). 어 닐 링 온도 53 ° c 이다. 제조업체의 지침에 따라 PCR 청소 키트를 사용 하 여 결과 조각 정화.
- EcoRI와 SmaI 단계 1.1에서에서 수행 결과 PCR 제품을 소화 하 고 소화 DNA 파편을 사용 하 여 T4 DNA 리가 제조업체에서 권장 하는 대로 통합 구조를 생성 pRB4의 동일한 사이트에 선. 대장균 으로 결 찰 혼합물을 소개 하 고 구문을 시퀀스를 확인 합니다.
- Electroporate S. 구 균 긴장 RN4220에 구조는 이전34를 설명합니다. 간단히, 1 µ g의 플라스 미드를 사용 하 여 전기 유능한 세포의 70 µ L로 (100 Ω, 25 µ F, 및 2.3 kV) B2 국물 (1% [w/v] 카 제인의 2.5% [w/v] 효 모 추출 물, 2.5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K2포4, 0.5% [w/v] 포도 당). 에 리스로 마이 신 (5 µ g mL-1)과 (X-여자; 80 µ g mL-1) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 허용 온도 (30 ° C)에 리스로 마이 신 저항 (Emr)을 선택 합니다. 결과 transformants는 플라스 미드로 인코딩된 β-galactosidase 활동으로 인해 블루.
참고: 임상 분리로 DNA의 이동 때문에 강한 제한 수정 장벽35매우 어렵습니다. 따라서, 그것은 부족 하 고 높은 변환 가능한 제한 때문에 S. 구 균 RN4220 퓨전 구문의 중간 받는 사람으로 사용 되었다. - S. 구 균 USA300 스트레인 electroporation 또는 살 균 소 중재 변환36 을 사용 하 여 허용 온도에서 관심사의 플라스 미드를 전송 합니다. 간단히, Φ11 살 균 소 입자 5mm CaCl2 를 포함 하는 TSA 격판덮개를 사용 하 여 기증자 스트레인에 30 ° C에서 하룻밤 그리고 다음 0.45 μ M 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 여과 하 여 소독을 전파 합니다. 그들r S. 구 균 긴장 락 transduce lysates 사용.
참고: 락 널리 임상 분리 이전 Em 민감한 의해 만들어진 TSB 매체 수 여 Emr 37,38네이티브 플라스 미드 pUSA03의 변형 치료에 직렬 통로 이다. - 앞에서 설명한32염색체에 두, 연속 동종 재결합 이벤트에 구조를 통합. recombinants 페니, 리스로 마이 신은 취약 음 (s), 및 더 이상 파랑의 페니-내성 (Cmr)에 TSA 격판덮개 5 μ g m l-1 를 포함 하는.
참고: 가능 하면 다시 생체 외에서 스트레인 통로39 및 온도 교대와 관련 된 돌연변이의 축적을 피하기 위하여 변환 페이지 중재를 통해 USA300로 표시 된 퓨전 소개.
2. 동물 감염: 준비 Inoculum, 전신 감염, 및 조직 처리
-
세균성 inoculum의 준비
- 냉동된 글리세롤 재고에서 혈액 한 천 배지에서 격리에 대 한 관심의 S. 구 균 종자를 행진. 적혈구 (Rbc) lyse 그들의 능력에 기반 하는 hemolytic 고기 확인 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어와 양식 투명 영역 합니다.
- 메 마른 유리관에 tryptic 간장 국물 (TSB)의 4 mL를 각 스트레인의 단일 식민지를 접종 하 여 숙박 문화를 시작 합니다. 약 70 ° 각도와 [RPM] 분당 70 회전 설정 튜브 롤러에서 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 튜브를 회전 합니다.
- 600에서 광학 밀도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 단계 2.1.2에서에서 문화의 nm (OD600). 메 마른 매체를 사용 하 여 광학 참조 (빈)로. 0.05에서 25 ml의 멸 균 Tryptic 간장 국물 (TSB) 별도의 OD600 이 세포를 희석, 125 mL DeLong 플라스 크 (볼륨 비율 플라스 크 5:1) 및 (에 대 한 올바른 열 전달 문화), 물 목욕 문화를 품 어 280 RPM에서 진동 하 고 37 ° c.로 설정
참고:는 inoculum의 성장; 다양 한 방법으로 수행할 수 있습니다. 지 수 단계 성장 하는 셀에 대 한 한 가지 방법은 제공 됩니다. 어쨌든, 그것은 지속적으로 동일한 메서드를 사용 하 여 접종에 대 한 셀을 준비 하는 것이 중요입니다. - 세600 ~ 1, 다시 시작 세600 세포 지 수 단계를 달성 하 고 야간 보육 동안 축적 요인 지 수 단계 수준으로 감소 되었습니다 0.05의 신선한 매체에 셀 희석.
- 실 온에서 10 분 동안 3000 x g 에서 centrifuging 여 지 수 단계 (OD600 ~0.6–0.8) 세포를 수확.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 1의 해당 볼륨에 두 번 알 약을 씻으십시오.
- 1 x 108 콜로 니 형성 단위 (CFUs) mL-1 의 농도를 1 x PBS (pH 7.4)에 셀을 일시 중지 하거나 원하는 적합 실험.
참고: 셀 크기와 모양의 스트레인-종속 변경 산란 속성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세600 사이의 CFU mL-1 관심의 각 변형에 대 한 관계를 결정 하는 것이 중요 하다 고, 궁극적으로 감염 복용량입니다.
-
동물 및 세균 감염의 준비
- 정화 다이어트 아 인-93에 7 일 동안 마우스를 적응. 다이어트는 표준 마우스 차 우40에 사용 되는 식물 기반 재료의 소비와 관련 된 조직 자동-형광을 줄이면서 적절 한 영양을 제공 하 공식화 했다.
참고: 여성 C57/BL6 마우스 (6-8 주 이전) 여기에, 사용 된다 그러나 마우스 긴장과 섹스 연구에 따라 달라 집니다. - 감염, 전에 미지근한 물으로 마우스 꼬리 혈관 같은데요.
- 생산 조직의 감염을 꼬리 정 맥을 통해 세균 inoculum의 100 µ L를 주입 하 여 동물을 감염. Cytometry 수행 하는 경우 초기 inoculum의 약 수를 저장 (섹션 4 참조).
- 동물을 매일 모니터링 하 고 검토 하 고 하나의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 모니터링 시스템을 사용 하 여 자신의 건강 상태를 평가.
- 원하는 기간에 대 한 진행에 감염을 수 있습니다. 여기, 실험 종료 3 일 후 감염입니다.
참고: 이러한 조건 하에서 박테리아, 면역 세포5,41의 동심 층으로 둘러싸여 있고 섬유 소 예금의 포도 농 공동체 농에 의하여 이루어져 있다.
- 정화 다이어트 아 인-93에 7 일 동안 마우스를 적응. 다이어트는 표준 마우스 차 우40에 사용 되는 식물 기반 재료의 소비와 관련 된 조직 자동-형광을 줄이면서 적절 한 영양을 제공 하 공식화 했다.
-
수확 하는 기관 및 조직 처리
- CO2 흡입 및 보조 방법으로 자 궁 경부 전위에 의해 동물 안락사 고 검 시를 수행 합니다.
- 신장 (오른쪽) 및 다른 중요 한 장기 (심장, 간, 폐, 비장)을 수확 하 고 10% [v] 버퍼링 말린을 포함 하는 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브로 전송. 이러한 장기 2.3.4 아래 단계를 계속 수행 하십시오.
- 살 균 2 mL 충격 방지 튜브 2 m m 실리 카 구슬의 1 mL 균 1 x PBS (pH 7.4) ~ 500 µ L을 포함 하는 왼쪽된 신장 전송. 4.2 단계로이 기관으로 진행 합니다.
- 2.3.2 부드러운 진동 또는 회전 24 시간 이상 하지만 이상의 48 시간 실 온에서 어둠 속에서 수정 단계에서 장기를 허용 합니다.
- 매체를 동결 명확한 조직에 장기를 포함 하 고 저장-80 ° c.에 조직
- 10 µ m 두께의 조각으로 cryostat, 조직 섹션을 사용 하 여.
- 어둠 속에서 20 분에 대 한 사전 청소, 충전 유리 슬라이드에 섹션을 건조, 하드 설치 매체와 함께 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 적용 하 고 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에 탑재 된 슬라이드를 치료 하 고 장기 저장을 위한 4 ° C에 전송.
3. 레이저 스캐닝 Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리
- 사용 되 고 형광 기자에 대 한 적절 한 레이저를 사용 하 여 병 변을 찾을 수 마운트 슬라이드를 검사 합니다. 이 경우, 그린 (GFP), 레드 (tdTomato), 그리고 파랑 (DAPI) 형광 신호 사용 됩니다.
- 개별 셀을 시각화에 대 한 적절 한 목표를 사용 하 여 이미지를 획득 (예를 들어, 일반적으로 20 x 또는 40 x 목표 사용 된다).
-
공초점 이미지의 형광 강도 측정 합니다.
- 이미지 J에 confocal 이미지를 열고 제대로 병 변의 형광 신호를 시각화 하기 위해 밝기/대비를 조정 합니다.
- 관심, 그리고 임계 처리 옵션을 사용 하 여 영역을 정의 필요에 따라 하위 및 상위 형광 한계를 설정.
- 선택 하 여 중심을 정의 영역 → 평균 회색 값 → 중심 → 임계값 제한 제이 이미지에서 분석 탭
- 중심 형광 강도 값을 추출 하거나 GFP와 tdTomato에 대 한 단위 지역 (의미 형광 강도, MFI) 당 주어진된 병 변에서 평균 형광 강도 측정 합니다. 여기, 1 µ m2 의 영역 사용 되었다.
참고: 멀게 두 번째 분석 샘플의 정체성 알려져 때 바이어스를 최소화 합니다. - 데이터를 플롯 하 고 각 비교에 대 한 적절 한 통계 분석을 수행.
4. 교류 Cytometry 분석
-
(선택 사항) (2.2.3 단원)에서 감염의 날에는 inoculum의 융합 활동을 결정
- 1 x 899 µ L를 살 균 PBS (pH 7.4) 100 µ L의 각 inoculum 추가 하 고 막 permeant 핵 산의 1 µ L 얼룩 ( 재료의 표참조). 컨트롤, 핵 산 얼룩 부족 샘플을 포함 해야 합니다.
- 모든 샘플에 cytometry를 수행 합니다.
참고: 첫 실험에 대 한 사용 하 여 적절 한 전압을 결정 하는 관심의 융합에 대 한 벡터만 컨트롤을 포함 해야 유용 합니다. 긍정적이 고 부정적인 샘플 간의 구분이 분명 데이터 분석을 위해 필수적인 기자를 나타내는 이다 배경 신호 이상. - 세균성 인구를 식별 하려면 핵 산 얼룩 (y 축)을 사용 하 여 이벤트를 플롯 하 고 분산형 (x 축)를 전달 합니다.
- 두 핵 산 얼룩 긍정적인 이벤트와 앞으로 분산형 ( S. 구 균에 대 한 0.5 ~ 2.0 µ m) 사이 따라 박테리아의 정확한 크기 포함 게이트를 그립니다.
참고: 이러한 매개 변수에서 명확 하 게 이벤트를 포함 하는 것이 중요으로이 인구를 식별할 때 엄격한 수.입니다 이 게이트는 다른 조건 하에서 부정적인 컨트롤에 대 한 모든 이벤트를 제외 해야 합니다. 이 연구에서는 약 70%는 세포 인구 만난 분석에서 이러한 요구 사항을.
-
희생 후 조직 샘플의 분석:
- 동물 안락사, 왼쪽된 신장 (2.3 단계 참조), 수확 및 비드 구타로 이동 관 포함 1 mL 균 PBS (pH 7.4) x 1 및 2 m m 붕 구슬의 250 µ L.
- 세균성 세포 출시 조직 방해. 신장 세포를 방해 하는 균질 화기를 사용 합니다. 여기, 냉각 기간 주기 사이 젖은 얼음에 1 분으로 6800 rpm에서 3 개의 30 s 파열 난방 샘플을 최소화 하기 위해 사용 되었다.
- 펠 릿 centrifuging 250 x g 탁상 microcentrifuge 3 분에 의해 더 큰 조직 파편 4 ° c.에 냉각
참고: 일반적으로, 셀 펠 렛 튜브와 상단에 떠 있는 파편의 층의 밑에 있다. 중간의 수성 층 세균 셀을 포함합니다. - PBS의 989 µ L에서 핵 산 얼룩의 1 µ L을 포함 하는 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 관으로 수성 층에서 10 µ L를 전송 (전체 용량 1 mL).
- 동일한 데이터 수집 매개 변수를 사용 하 여 및 초기 inocula에 관해서는 게이팅 cytometry를 수행 합니다.
참고: 세균성 세포 수 샘플은 주로 조직 파편을 포함 하기 때문에 매우 낮은 것입니다. "라이브 게이트" 옵션 세포는 핵 산 얼룩 긍정적이 고 크기 문이 데이터 응용 프로그램에 로드 되 면 경우에 사용할 수 있습니다. 이 또한 대상 이벤트의 더 분석 하 고 파일 크기를 줄일 데 도움이 됩니다. 샘플 당 거의 1 백만 이벤트 계산 됩니다, 하지만 더 많은 이벤트 카운트는 감염의 심각도 및 조직 분석의 크기에 따라 필요할 수 있습니다. - 데이터 분석: 결정 각 fluorophore 섹션 4.1.4 결정 포함 게이트를 사용 하 여 주어진된 샘플에 대 한 형광 강도 (MFI)을 의미. 이벤트 카운트를 흐름 분석 소프트웨어에서 샘플을 정상화. 10000 카운트는 분석에서 일반적으로 충분 하다.
참고: 이후이 농 양 형성, 감염의 심각도에 따라 이벤트의이 수 보다는 더 적은 포함 하는 샘플을 찾아내는 것은 드물지 않다. 이 접근, 500-40, 000를 사용 하 여 이벤트는 일반적으로 감염 된 조직에서 발견 된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 어떤 기자를 제공할 수 있는 pMAD32 에서 파생 된 플라스 미드를 개발 더블 크로스 오버 동종 재결합 (그림 1)에 의해 염색체에 퓨전 구문. 이 구조는 GFP 단백질 생산 배경 위에 형광 신호를 지 원하는 어떤 규제 지역의 정량 분석에 대 한 수 있습니다. 플라스 미드 암 피 실린 저항 (Apr) 유지 보수 및 대장균 에서 전파에 대 한 수 여 하 고에 리스로 마이 신 저항 (Emr)를 수 여 S. 구 균. 구조는 페니 저항 (rCm), 정교한 유전자 분석에 대 한 다양 한 돌연변이 체 긴장 사이 기자는 통합된 융합의 쉽게 전송 허용에 또한 수 여 S. 구 균.
원리의 증거로 우리 융합 nuc gfp nuc 규제 지역 그것의 유전자 제품 전체 독성에 대 한 필요이 필요 농42, 유도에서 미 균-대 식 세포를 제한 때문에 선정 되었다 43. 구성은 프로토콜의 1.4-1.6 단계에 설명 된 대로 염색체에 통합 이었다. AH3926 PsarAP1-tdTomato 융합을 포함 하는 통합된 융합 다음 이송 됐다. 사라 P1 발기인 이전 constitutively 활성44 로 표시 되었습니다, 따라서, 모든 셀 라벨.
처음 기자 융해 했다 생체 외에서 동안 액티브 Tryptic 간장 국물 (TSB, 풍부 하 고 복잡 한 매체)에서 플라스 크 성장 동요 그리고 형광의 수준 세포 자동 형광 배경 (그림 2) 위에 확인 합니다. 형광 기자 vivo에서 동작 방법을 결정, 수정 된 신장 농 양 모델 사용된5이었다. 여성 C57BL/6 쥐의 그룹은 1 x 107 CFU S. 구 균 락 셀 기자 융해 부족 또는 nuc-sGFP 및 sarAp1 tdTomato 융해를 들고 락 셀의 각 정 맥 도전 했다. 동물 희생된 3 일 게시물 감염 했다입니다. 그런 다음 수확된 장기 10% [v] 버퍼링 포 르 말린에 고정 했다, cryo sectioned, 그리고 DAPI 얼룩 설명한 후 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지에서 단계 2와 3 (그림 3A, B). 신장 병 변에서 단위 면적 당 형광 측정 되었다와 이미지 이미지 J를 사용 하 여 분석 했다. 그림 3C에서처럼 nuc gfp 융해 형광 들고 안 들고 기자 퓨전; 셀 보다 융합 세포에 거의 9-fold 더 높은 평균에 있던 후자의 신호 검출 (자동-형광) (비교 sGFP 엔 유씨 락)도 구성합니다. 마찬가지로, PsarAP1-tdtomato 퓨전 형광 했다 ~ 접을 아니 기자 컨트롤 (그림 3E, sarAP1-tdT vs 락 비교) 보다 더 높은. Cytometry 사용 하 여, 기자 활동의 패턴 신장 homogenates를 사용 하 여 확인 및 flow cytometry 4 단계에 설명 된 대로, 비록 배 형광에 차이 (그림 3D, F) 낮은 했다.
흥미롭게도, 형광 기자 융해를 운반 하는 세포에 의해 형성 된 병 변에서 형광 데이터 부족 기자 보다 더 높은 변동성을 보여 등장. 우리 궁금 여부 관찰 형광 측정에서 변형 기자의 다른 유형의 표현으로 (즉, 생물학 근원의). 일부 병 변 중 하나 또는 둘 다 기자 (그림 4) 표현, ~ 100 µ m 거리 내에서 발견. 중요 한 것은, 강한 DAPI 얼룩, 아마 연관과 circumscribed 농에 nuc 식의 공간 조절 밝혀 단일 셀 해상도 포도 농 사회 (Sac)에서 기자 활동을 검사는 형성과 neutrophil 세포 외의 릴리스 트랩 (그림 5A-C)45. 예를 들어, 우리는 (그림 5B, E) 주변에 그와 비교 하는 골목의 내부 코어에 상당히 높은 nuc sGFP 퓨전 형광 측정. 같은 농 sarAp1 tdTomato 퓨전 형광 패턴 것으로 나타났다 (그림 5D) 거꾸로. 그러나, 패턴 (그림 5F) 동물의 동일한 수를 사용 하 여 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다.
그림 1 : 게놈 통합 기자 플라스 미드 pRB4의 도식 대표. 플라스 미드 pRB4 S. 구 균 오 라 pE194 (ts)에 복제의 온도 중요 한 근원으로 pMAD의 파생입니다. 3 약물 저항 마커 있다: (i) 즐, 대장균;에서 암 피 실린에 저항을 부여 (ii) ermC, S. 구 균;에 리스로 마이 신 저항을 부여 그리고 (iii) 고양이, 페니 미 균에 저항을 부여. 기자 구조 ~ 500에 의해 형벌 이다 bp pseudogene SAUSA300_0087 의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스에서 각 (게놈을 참조: FPR3757) 두 배 크로스 오버 동종 재결합 및 통합을 위한 게놈. sGFP, 녹색 형광 단백질 유전자; CS, 복제 사이트; TT, 강력한 양방향 transcriptional 종결자 그림은 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 나 ntegrated nuc-sGFP 그리고 sarAp1-tdTomato 생체 외에서 성장 하는 동안 기자는 표현 . S. 구 균 락 셀 (야생-타입 [WT]), (A) nuc-sGFP 또는 (B) sarAp1 tdTomato 기자 없이) 고 다시 동일한 매체에 희석 TSB에 지 수 단계 성장 했다. 광학 밀도 (OD) 및 형광 표시 된 광학 밀도 값에 측정 되었다. 배경 빼기 형광 강도 값 (여기/방출: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT] 535/590 nm) 상대 형광 단위를 생성 하는 광학 밀도 값으로 분할 되었다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 SEM + 수단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 형광 기자 신장 조직에서 볼 수 있습니다. 그룹 13 C57BL/6 마우스의 정 맥 락 셀 또는 락 셀 nuc sGFP 과 sarAp1-tdTomato (tdT), 도전 그리고 감염 3 일 동안 진행 하는 것이 허용 되었다. 마우스 했다 안락사 고 장기 2-프로토콜의 3 단계에 설명 된 대로 처리 했다. 여러 병 변 (A)에 대 한 관련 된 형광을 보여주는 대표적인 신장 섹션 엔 유씨-sGFP 및 (B) sarAp1-tdTomato. 스케일 바 = 250 µ m (10 x 목표). 단위 면적 (RFU [μ m2]-1) 연관 신장 병 변 당 상대 형광 단위 단계 3.3에에서 설명 된 대로 이미지 분석을 사용 하 여 측정 되었다와 대 한 표시 했다 (C) 엔 유씨-sGFP 및 (전자) sarAp1-tdTomato; 각 점 대표 한 병 변 및 막대 표시 중간; 3-5 병 변 마우스 당 분석입니다. Nuc-sGFP (D) (F) sarAp1 tdTomato 퓨전 형광 감염된 신장 homogenates 3 일 게시물 감염 으로부터 격리 하는 세균성 인구에의 교류 cytometry 분석. 말은 형광 강도 (MFI) 단단한 막대로 표시 되 고 각 점은 한 신장. 락, reporterless 야생-타입 스트레인 통계: 맨-휘트니 테스트; p < 0.05입니다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 대표. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 농 전시 신장 조직에서 기자 들의 가변 식. 13 C57BL/6 마우스의 그룹 1 x 107 CFU 꼬리 정 맥을 통해 미 균 세포의 도전 되었다. 동물 안락사 3 일 게시물 감염 했다입니다. 신장, 고정, 및 형광 현미경 검사 법 (40 x 목표)에 대 한 프로토콜의 2 단계에서 설명한 대로 sectioned 수확 했다. Nuc sGFP (A) (B) sarAp1 tdTomato 형광 변수 수준의 가까이에 3 개의 병 변은입니다. (C) 핵 산 포도 상 구 균 및 호스트에서 셀 표시 됩니다 DAPI 얼룩으로. 녹색과 빨강 채널은 (D)에 병합 됩니다. 유사한 결과 다른 섹션에서 본 했다. 이미지는 40 x 목표;를 사용 하 여 인수 했다 눈금 막대 25 µ m =. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : nuc-sGFP 포도 농 마이크로-환경에서 규제 공간. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) S. 구 균 긴장 락 들고 nuc-sGFP 및 sarAp1 tdTomato 기자 융해에 의해 생성 한 포도 농 양 커뮤니티 (SAC) 병 변의 이미지. (A)은 엔 유씨-sGFP 와 sarAp1-tdtomato, (B) nuc sGFP 형광 (녹색)에 대 한 채널을 병합 (C) DAPI 핵 산 (파란색), 및 (D) 의 얼룩 sarAp1-tdTomato 형광 (레드). 별표 표시 셀 코어 (중심)에 고 화살표는 주변에 있는 셀을 나타냅니다. 형광 강도 (E) nuc-sGFP 및 (F) sarAp1 tdTomato 셀 코어 및 SAC의 주변에 대 한 표시 됩니다. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 데이터 (마우스 당 1 개), 8 신장에서 파생 되 고 1-2 병 변 각 신장에서 몇 군데 있었다. 막대 중간을 나타냅니다. 파선, 탐지의 한계입니다. 통계: 스튜던트 t-검정 (홀된), 데이터의 정규 분포 * * *p < 0.05. (눈금 막대 = 20 µ m; 모든 이미지에 적용 됩니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
세균 감염 증은 항생제 내성 결정 요인46의 수집으로 인해 전세계 증가 건강 문제. 호스트 환경에 적응 성장과 감염 동안 생존을 위해 필수적 이다, 때문에 병원 체 적당을 증가 하는 유전자 식 프로그램을 대상으로 전략 therapeutically 유용한 증명할 수 있습니다. 하나는 이러한 프로그램이 SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS), 면역 회피47에 필수적인 역할을 이전 표시에 의해 통제 하는 유전자의 집합입니다. SaeR/S는 다양 한 요인, 특히 그 중 성구8,20와 관련 된에 의해 유도 된다. 감염, 동안 S. 구 균 중 성구 및 다른 식 세포는 감염2의 사이트에 보충 강한 염증 반응 elicits. 액 화 괴 사 및 섬유 소 증 착 따라 조직 손상48을 더 방지 하기 위하여 농 양을 형성 합니다. 이러한 면역 권한이 사이트 내에서 미 균 세포 세균 곱하기5,48를 촉진 하기 위하여 농 프로그램을 성폭력 종속 유전자 제품의 번호를 사용 합니다. 1 성폭력 종속 유전자, nuc, nuclease에 대 한 코드 고 대사 2'-deoxyadenosine 대 식 세포43를 죽 일를 생산 하는 그물. 따라서, Nuc 전체 독성42 필수적 이며 표현 vivo에서 (그림 3, 그림 4및 그림 5)는 중요 한 secreted 효소 이다.
S. 구 균 의 독성 요인 광범위 하 게 연구, 하지만 박테리아는 호스트에서 어떻게 성장 하는지은 understudied 지역 감염 동안 그것의 생리학은 규제 하는 방법을 이해 하는. 여기는 세균성 유전자 발현 및 선택의 부재에서 플라스 미드 손실에 대 한 우려를 완화 수정된 통합 벡터를 사용 하 여 단일 세포 수준에서 동작을 검색 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 방법론 permeabilize 세포 벽, 하지 않고 그리고 항 체 및 라벨에 대 한 필요 없이 농에 유전자 발현의 직접적인 시각화 수 있습니다. 우리 신장 농 양 3 일 야생-타입 세포에 의해 형성 된 낭 게시 감염 급성 전신 감염 모델에서에서 sarAp1 tdTomato 퓨전 nuc sGFP 퓨전의 강한 식 감지. 그러나, 실험 설계는 다른 사이트에 있는 유전자 발현에 관한 질문에 답변을 수정할 수 있습니다. 실제로, C57BL/6 마우스 수 없기 때문에 그들의 조직에서 미 균 을 지우려면, 박테리아 침범 다양 한 해 부 사이트 골격 시스템 (뼈와 관절)와 뇌, 심장, 비장, 그리고 간를 포함 하 여 모두 다른 생리학 그리고 영양 속성5,49. 따라서, 많은 호스트 조직의 성격을 S. 구 균 을 사용 하 여 배울 수 있습니다. 그것은 특정 호스트 틈새는 자연에 hypoxic 또는 그렇지 않으면 강한 산소 그라데이션50전시 알려져 있다 주의 하는 것이 중요. 형광 단백질 활동, 분자 산소를 필요 하 고 일부는 다른 사람 보다는 산소 부분 압력에 민감한51. 우리가 볼 형광 깊은 농 양, 시간 신호는 크기는 과소 평가 될 수 있습니다. 코 돈 최적화 된 형광 단백질 Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 사용 하기 위해 개발을 사용 하 여52이 관심사 완화 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 참고로 두 번째 포인트 형광 단백질은 (sGFP와 tdTomato)이이 연구에 사용 된 기자 종자에 의해 생산 안정입니다. 따라서, 형광 데이터 최근 응답 보다는 오히려 실험의 과정을 통해 축적을 반영합니다. 불안정 한 sGFP 또는 tdTomato 유전자를 포함 하는 구조를 생성 크게 동적 실험에 대 한 시스템의 유틸리티를 증가할 것입니다.
여기에 설명 된 기자 시스템 양적 유전자 규칙에서 생체 외에서 그리고 에 비보를 공부 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 기자는 염색체에 단일 복사본에 유지 하기 때문에 시스템은 강력 하 게 표현한 유전자 (즉, 높은 발기인 활동 데)에 적합. 생 합성 유전자 또는 유전자 다른 낮은 표현된 하지 볼 수 있습니다 형광 식의 수준 탐지 또는 배경 자동 형광의 제한 값 보다 떨어질 수 있기 때문에. 리보솜 바인딩 사이트 (RBS) 기자 융해33의 활동 영향 알려져 있습니다. 이 문제에 대 한 잠재적인 해결책은 번역 개시 지역 (사격)53 같은 강한 RBS를 사용 하 여 또는 염색체에 관심의 발기인의 탠덤 복사본을 통합 하. 또는, 안정적인 멀티 복사 플라스 미드 사용된54일 수 있었다.
설명 하는 방법의 한계는, 조직에서 추출한 RNA 로부터 cDNA 준비와 달리 상대적으로 적은 수의 유전자 수 수 심문 동시에 (스펙트럼 중복 없이 사용 가능한 형광 채널에 의해 제한). 그러나, 무엇을 얻 었 수 있습니다 잠재적으로 더 유익. qRT-PCR 및 다른 정보 대량 인구 평균 인구가 감염의 사이트에 캡처할 수 없습니다. 사실, 우리 nuc sGFP 의 수준에이 관찰 하 고 sarAp1 tdTomato 식에 농 양 병 변 사이 가까운 근접 (그림 4). 이것은 무슨 최근에 Cassat 외 에 의해 보고 되었다 55 이 시점에서이 기원은 알려져 있지 않다. 그러나, 영양소, 영양소 수집 시스템의 변수 유도 나 다른 호스트 요인 가능성이 현상을 설명할 수 있었다. 또한, 호스트 병원 체 상호 작용은 장기 또는 복잡 한 3 차원 구조와 다양 한 세포 유형 농의 microenvironments 내에서 발생 합니다. 이 구조 내에서 조직 pH, osmolarity, 산소, 및 양분 가용성, 대사 zonation56,57으로 알려진 현상이 상당히 달라질 수 있습니다. 우리는 serendipitously 공간 규제의 패턴 농 양 (그림 5)에 야생-타입 세포에서 발생 한다 발견 했다. 이것은 우리의 지식에 감염 시 그람 양성 병원 체에 있는 그것의 종류의 첫 번째 관찰 이다. 공간 규정 보고 여기 비슷합니다 데이비스 그 외 여러분 에 의해 얻은 그람 음성 병원 체 페스트 pseudotuberculosis58의 microcolonies를 포함 하는 비장 조직에. 해당 인스턴스에서 호스트 생성 질소 산화물 (NO *) 자극된의 microcolony에는 확산 NO *, 인테리어를 살려주는 가장 가까운 주변에서 셀에 질소 산화물 dioxygenase (Hmp)의 생산 세포의 표현을 유도 하는 필요 hmp. 포도 농 양, nuc 식에서는 코어의 골목, 그리고 주변을 따라 약한에 가장 강한입니다. 농 호 중구의 팔목에 의해 포위 된다, 때문에 그것은 neutrophil 파생 큐 셀 두 phenotypically 고유 인구 morphogenic 연상으로 편광 포도 상 구 균의 동작 지도 추측을 유혹 높은 생활59에서 개발 하는 동안 감 별 법의 규칙. 이 패턴의 기계적 underpinning 알 고 우리의 실험실에 강렬한 연구의 주제 이다.
우리는 우리의 방법은 감염 시 개별 셀에 유전자 발현의 세부 연구는 효과적인 도구를 제공 합니다 믿습니다. 메서드를 관찰 하 고 결국이의 생리 적 기원과 조직에서 유전자 발현의 공간적 패턴을 이해 하는 독특한 기회를 제공 합니다. 이 이질적인 행동 해야 될 고려 새로운 치료 modalities를 개발할 때로 셀 (즉, 그는 유전자 표현)의 부분 모집단은 치료에 의해 타겟이 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
교류 cytometry 분석에 대 한 PsarAP1-tdTomato 퓨전, 그리고 카 렌 크레스 웰의 선물에 감사 알렉산더 Horswill 하 고. 우리는 또한 통계 분석에 대 한 조언을 Alyssa 킹을 감사합니다. 이 작품은 NIH 탐사/발달 연구 상 (그랜트 AI123708) 및 교직원 시작 자금 연료 부스터 부분에 투자 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 해석, 또는 게시에 대 한 작품을 제출 하도록 결정에 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F.
- Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
- Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
- Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
- Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
- Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
- Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
- Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
- Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
- Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
- Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
- Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
- Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
- Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
- Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
- Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
- Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
- Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
- Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
- Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
- Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
- Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
- Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
- Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
- Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
- Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
- Novick, R. P.
- Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
- Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
- Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
- Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
- Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
- Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
- Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
- Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
- Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
- Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
- Bose, J. L.
- Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
- Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
- Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
- Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
- Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
- Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).
