Summary
Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.
Abstract
La electroporación es un método de transfección en el que se aplica un campo eléctrico a las células para crear poros temporales en una membrana celular y aumentar su permeabilidad, permitiendo así introducir diferentes moléculas en la célula. En este artículo, la electroporación se utiliza para introducir plásmidos a las células ependigliales, que recubren la zona ventricular del telencéfalo adulto del pez cebra. Una fracción de estas células muestra propiedades de células madre y genera nuevas neuronas en el cerebro del pez cebra; por lo tanto, estudiar su comportamiento es esencial para determinar sus funciones en la neurogénesis y la regeneración. La introducción de plásmidos a través de la electroporación permite el etiquetado y seguimiento a largo plazo de una sola célula ependymoglial. Además, los plásmidos como Cre recombinase o Cas9 pueden ser entregados a células ependymoglial únicas, lo que permite la recombinación genética o la edición genética y proporciona una oportunidad única para evaluar la función génica autónoma de la célula en un control natural Ambiente. Por último, este protocolo de electroporación detallado paso a paso se utiliza para obtener una introducción exitosa de plásmidos en un gran número de células ependimarinas individuales.
Introduction
Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos1, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados2, 3,4,5,6,7,8. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto demamíferos9,10,11.
Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.
Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes16,17,18,19.
Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo20 o manipular vías específicas de manera autónoma celular21,22.
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Protocol
Todos los animales utilizados en este protocolo se mantuvieron en condiciones estándar de cría, y los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices y reglamentos de manipulación de la UE y el Gobierno de Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparación de la mezcla de plásmido para la electroporación
- Diluir el plásmido de interés en agua estéril y añadir solución de tinción verde rápida [1 mg/ml]. Asegúrese de que la concentración final del plásmido es de 1 g/L. Añadir la mancha a una concentración no superior al 3%, ya que su único propósito es colorear la solución y visualizar la inyección ventricular.
- Una vez preparada, mezcle la solución de plásmido pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces o tocando con los dedos. Conservar a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.
NOTA: Para la coelectroporación de dos plásmidos en la misma célula, asegúrese de que la concentración de cada plásmido individual utilizado en la mezcla sea de al menos 0,8 ng/L con una relación molar de 1:1 para obtener una eficiencia de coelectroporación del 80%-90%.
2. Preparativos para el procedimiento de inyección y electroporación
- Preparar los capilares de vidrio (diámetro exterior 1 mm, diámetro interior 0,58 mm) necesarios para la inyección en el aparato de tracción de agujas.
- Para inyectar la cantidad correcta de plásmido (ver arriba), tire del capilar a una temperatura de 68,5 oC con dos pesos ligeros y dos pesados (ver Tabla de Materiales para las especificaciones del tirador).
NOTA: En caso de que se utilice un tirador diferente, calibrar el capilar para entregar el volumen adecuado de mezcla de electroporación. - Ajuste manualmente el dispositivo de inyección a una presión de inyección de 200 hPa (girando la perilla Pi) y presión constante de 0 hPa. Ajuste manualmente el tiempo de inyección al modo manual y controle la presión con el pedal.
- Ajuste el dispositivo de electroporación a "modo LV" con cinco pulsos a 54–57 V (25 ms cada uno con intervalos de 1 s). Conecte los electrodos al dispositivo.
- Preparar una pecera con agua de pescado limpia, donde el pescado se despertará de la anestesia después del procedimiento de electroporación. Airear el agua manteniendo la piedra de aire unida a la bomba de aire durante todo el período de recuperación hasta que el pez se despierte por completo.
- Tome una esponja de cocina regular y haga un corte longitudinal en la esponja para sujetar el pescado durante el procedimiento de inyección y electroporación (ver publicación anterior3).
NOTA: La esponja de cocina debe lavarse o intercambiarse regularmente para eliminar posibles sustancias químicas tóxicas. - Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido multiusos altamente conductivo junto a la configuración de inyección y electroporación.
NOTA: Esto garantizará una conductividad eléctrica adecuada y, en consecuencia, la distribución de células electroporadas a lo largo de todo el telencéfalo.
3. Anestesia de pez cebra
- Antes de la anestesia, prepare una solución de siembra de anestesia con 0.2% MS222 en agua destilada y ajuste el pH a 7 con tampón Tris-HCl. Diluir esta población 1:10 (es decir, a 0,02% MS222) utilizando agua de pescado.
- Anestesiar a los peces manteniéndolos en esta solución de trabajo hasta que el movimiento del cuerpo y las branquias disminuya (normalmente durante un par de minutos).
4. Inyección de solución de plásmido
- Llene el capilar de vidrio preparado con 10 ml de solución de plásmido utilizando puntas de microcargador. Evitar la formación de burbujas de aire dentro del capilar.
- Pulse Menú/Cambiar capilar en el dispositivo de inyección. Inserte y fije la aguja en el soporte de la aguja.
- Bajo un estereomicroscopio con un aumento de 3.2x o 4x, corte sólo la punta del capilar usando fórceps finos. Cambie el dispositivo de inyección del modo Cambiar capilar al modo Inyección y, a continuación, aplique presión con un pedal para asegurarse de que la solución de plásmido se está quedando sin problemas y sin obstáculos.
- Transfiera el pescado del tanque de cría al recipiente (caja de plástico) con solución anestésica. Espere unos minutos hasta que disminuya el movimiento de las branquias.
- Coloque el pescado en la esponja premojada con el lado dorsal hacia arriba. Realice todos los siguientes pasos de inyección bajo el estereomicroscopio para garantizar la precisión del procedimiento.
- Usando una microcuchilla dissección de acero inoxidable con filo de 40 mm y 0,5 mm de espesor, cree un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo(Figura 1B),justo al lado de la frontera con tectum óptico.
NOTA: Este paso debe realizarse cuidadosamente ya que el agujero debe ser muy pequeño y superficial, penetrando únicamente el cráneo, para evitar daños cerebrales. - Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero.
- Inserte la punta del capilar a través del orificio en el cráneo cuidadosamente hasta que llegue al ventrículo telencéfalo (ver Figura 1B). Esto requerirá penetración a través de la capa celular epentimal dorsal. Tenga especial cuidado de no insertar el capilar demasiado profundamente para evitar el contacto con el tejido cerebral. Mantenga el capilar precisamente entre los hemisferios, permaneciendo dentro del ventrículo justo después de perforar la capa épica dorsal.
NOTA: Este es un paso muy delicado. La precisión de este procedimiento se mejora utilizando líneas mutantes de pigmentación como brassy24,permitiendo una mejor visualización de la posición capilar de vidrio durante la inyección. - Con la punta capilar dentro del ventrículo, inyectar la solución plásmido aplicando presión con el pedal durante unos 10 s, que corresponde a aproximadamente 1 l de solución de plásmido.
NOTA: Si cambia el tirador de la aguja, los capilares o el inyector, el sistema debe calibrarse para administrar siempre 1 l de solución de plásmido. La calibración se puede realizar midiendo el diámetro de la gota de plásmido expulsada en un aceite mineral (por ejemplo, aceite de parafina) y posteriormente calculando el volumen de la gota. Después de 10 s de inyección, debe haber 1 l de líquido plásmido expulsado en el aceite mineral. - Confirme el éxito del paso anterior observando la propagación del líquido por todo el ventrículo.
5. Electroporación
- Retire el pescado de la configuración de la inyección mientras lo mantiene en la esponja.
- Sumerja el lado interno de la punta de los electrodos en el gel de ultrasonido.
- Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido.
- Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, colocando el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza del pez y el electrodo negativo en el lado dorsal(Figura 1C),mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja. Esto establece la dirección del flujo de la corriente necesaria para electroporato ependymoglia situado en la zona subventricular.
- Presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo(Figura 1C). Administre la corriente con el pedal. Mantenga los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados.
6. Recuperación de peces
- Deje que los peces se recuperen en el tanque previamente preparado y aireado continuamente hasta que despierte. Gel de lidocaína se puede aplicar en el cráneo con el fin de aliviar cualquier dolor posiblemente desarrollado.
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Representative Results
El método de electroporación descrito permite la entrega de ADN plásmido en células ependymoglial, que se encuentran superficialmente en el telencéfalo de pez cebra y justo debajo de la capa de células epentimales dorsales(Figura 1A).
Si el resultado de la electroporación es positivo, se pueden observar células ependymoglial (células rojas en la Figura 2A,B)entre otras células ependimogliales (blancas en la Figura 2A,B). Dependiendo de la eficiencia del proceso de electroporación, se puede etiquetar un número mayor(Figura 2A)o inferior(Figura 2B) de células epenymoglial. Sin embargo, este protocolo produce un mayor número de celdas etiquetadas que20publicados anteriormente, lo que es evidente en la Figura 3A y el Vídeo 1. Vale la pena mencionar que la mayor densidad de células etiquetadas tiende a emerger principalmente en el lado interno, ventricular de ambos hemisferios(Figura 3A),debido a la forma en que el líquido plásmido inyectado se distribuye entre los hemisferios. En el vídeo 1,un hemisferio del telencéfalo de pez cebra se presenta en 3D, y las células ependigliales con procesos radiales se pueden ver desde el lado. Las células están coelectroporadas y etiquetadas con dos plásmidos, tdTomato-mem (proteína fluorescente roja anclada a la membrana celular) y plásmido H2B-YFP (núcleos de etiquetado). Debe tenerse en cuenta la división celular de dos núcleos rodeados de círculos amarillos.
La electroporación sin éxito da como resultado un número muy bajo o ninguna célula ependymoglial etiquetada. Este resultado se puede explicar generalmente por inyección inexacta, en la que la punta del capilar no penetra en la capa celular epentimal dorsal. En este caso, la solución de plásmido se extiende por encima de la capa celular ependimal dorsal en lugar de rellenar el ventrículo telencéfalo. Esto lleva a que las células epentimales se etiqueten únicamente(Figura 3B). Las células ependimales dorsales (flechas azules en la Figura 3B)difieren morfológicamente de las células ependymoglial (flecha amarilla en la Figura 3A). Su soma es más grande y cuboide, y no poseen procesos radiales y alargados. Esto es evidente al comparar una vista lateral de la capa de células ependymoglial(Figura 4A,B). Las células etiquetadas con TdTomato-mem son las células ependimales, que se encuentran por encima de la capa de ependymoglia(Figura 4B). Por el contrario, en la Figura 4A,se introduce un plásmido de expresión tdTomato-mem en las células ependimoglialindividuales individuales. Por lo tanto, expresan tdTomato-mem además de su etiquetado inicial (en este caso, línea de pescado transgénico gfap:GFP, visto aquí en blanco).
Este protocolo permite el etiquetado y posterior seguimiento del comportamiento de las células ependigliales en el telencéfalo de pez cebra después de una lesión durante un período de tiempo a corto plazo de21 o largo plazo3. Esto se logra a través de imágenes en vivo e in vivo y ayuda a abordar la cuestión de sus funciones en la regeneración y neurogénesis.
Figura 1: Representación esquemática de la sección coronal del telencéfalo de pez cebra everitoso. (A) Esquema de una sección coronal de telencéfalo de pez cebra, destacando la posición de las células ependitogliales, que están forrando la superficie ventricular y construyendo la pared ventricular ventral. La capa epidérmica dorsal está uniendo los dos hemisferios y cubriendo el ventrículo (V), situado entre dos capas celulares: ependimoglial y ependimal. La flecha negra y la representación del ojo indican vista se muestran en las figuras 2 y 3. (B) A la izquierda, una fotografía de la cabeza del pez cebra tomada desde arriba, destacando la posición del telencéfalo con una línea blanca discontinua. Un capilar de vidrio se representa en rojo, junto con el sitio de destino para la inserción capilar. En la imagen, a la derecha, hay un esquema del cerebro de la pez cebra que muestra la posición de la inyección de plásmido en rojo. Cabe señalar que el capilar de vidrio no toca el telencéfalo y que el plásmido se inyecta justo por encima del telencéfalo en el ventrículo. T - telencéfalo, OT - tectum óptico. (C) Representado a la izquierda es una fotografía de la cabeza del pez cebra (vista lateral), y a la derecha hay una representación de la cabeza (vista lateral) que muestra la posición de los electrodos con el fin de apuntar al telencéfalo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Micrografías que muestran resultados de electroporación eficaces. Representación tridimensional de un (A) mayor o (B) menor número de células ependymoglial electroporadas en el telencéfalo de pez cebra adulto, como se ve desde arriba. La electroporación se realizó en Tg (gfap:GFP) línea de peces que expresa la proteína fluorescente GFP (representada en blanco) en todas las células ependimoglial. Las células electroporadas individuales están etiquetadas con plásmido pCS2-tdTomato-mem3. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Micrografías confocales que representan la diferencia entre electroporación exitosa e infructuosa. (A) Imagen confocal tridimensional del telencéfalo de pez cebra (REF) con un gran número de células ependymoglial electroporadas pCS-tdTomato-mem. Se debe observar la morfología de las células ependigliales con procesos largos y alargados (flechas amarillas). Se pueden observar ambos hemisferios telencéfalos, resaltados con líneas amarillas discontinuas. (B) Imagen confocal de electroporación infructuosa del plásmido pCS2-tdTomato-mem. La mayoría de las células ependimales dorsales están etiquetadas, y pocas células ependigliales expresan plásmido tdTomato-mem. Debe observarse la clara diferencia en la morfología de las células ependimales (flechas azules). Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vistas laterales 3D de células ependymoglial electroporadas y no electroporadas. (A) Representación lateral tridimensional células ependymoglial, positivas tanto para Tg(gfap:GFP) como pCS2-tdTomato-mem (flecha amarilla). (B) Representación lateral 3D de electroporación infructuosa. Se debe observar la ubicación de las células positivas pCS2-tdTomato-mem por encima de la capa de epend(gfap:GFP). Lo más probable es que las células de la capa ependymal dorsal fueron electroporadas (flecha azul). Barras de escala a 30 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Película 3D de telencéfalo de pez cebra y células ependymoglial electroporadas. El vídeo muestra un hemisferio del telencéfalo de pez cebra en 3D. Las células ependymoglial se coelectroporan con dos plásmidos: tdTomato-mem (proteína fluorescente roja anclada a la membrana celular) y plásmido H2B-YFP (núcleos de etiquetado). Ependymoglia etiquetada individualmente con procesos radiales que se pueden observar aparte. Los círculos amarillos resaltan la célula ependymoglial con figura mitótica visualizada por cromatina etiquetada H2B-YFP. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
Este protocolo de electroporación es un método in vivo fiable de etiquetado de células epentimoglial individuales. El protocolo puede necesitar una adaptación adicional para etiquetar otros tipos de células como neuronas u oligodendrocitos. Para lograr un etiquetado exitoso, se pueden utilizar plásmidos que contengan diferentes promotores. Promotor de actina de pollo-beta, eF1alpha, CMV y promotor de ubiquitina se han utilizado previamente para impulsar la expresión de diferentes transgenes en ependymoglia y su progenie23. Sin embargo, se observó una cinética diferente de la expresión transgénica que debe tenerse en cuenta. Por ejemplo, la expresión transgénica impulsada por el promotor CMV es muy rápida (la expresión podría verse después de 24 h), mientras que eF1alpha tarda más tiempo. Aparte del etiquetado, el protocolo de electroporación se puede utilizar como una plataforma rápida y directa de edición genética con el uso de técnicas Cre recombinase o CRISPR Cas922. Además, el uso de plásmidos que contienen volteo25-que contiene plásmidos y su electroporación en líneas Cre específicas de tipo celular puede servir como una extensión clara de un método que permita el etiquetado o la edición genética en la progenie ependymoglial generada después Electroporación.
Este protocolo tiene varios pasos críticos. En primer lugar, durante el paso de inyección, el experimental debe tener cuidado de que la cantidad de plásmido inyectado es igual para cada pez individual, de manera que el número de células etiquetadas siga siendo comparativamente similar. Esto se puede lograr controlando el tamaño de la abertura capilar de vidrio, lo que significa que el corte de cada punta debe ser constante entre diferentes capilares o se debe realizar calibración para cada capilar individual. Además, la duración de la inyección, regulada por un pedal, debe ser la misma para cada inyección individual. En segundo lugar, la posición adecuada de un agujero en el cráneo hecho con el microcuchillo es crucial para la correcta dispersión del líquido plásmido a lo largo del telencéfalo. Es igualmente importante penetrar la capa de células epentimales dorsales con la punta capilar, como se indica en el protocolo. Además, también es esencial que el agujero creado no sea demasiado grande para evitar que la mezcla de plásmido y el líquido cefalorraquídeo salgan del telencéfalo. Otro paso crítico es la fuerza de la corriente eléctrica aplicada. Es importante asegurarse de que el dispositivo de electroporación funciona de la forma más precisa posible, de modo que la fuerza de la corriente aplicada no se desvíe mucho de la tensión que aparece en la pantalla, lo que no siempre es preciso. Si estos valores no son consistentes, es necesario ajustar la fuerza de la corriente en el dispositivo de electroporación, ya que una corriente administrada superior a la recomendada 54-57 V puede comprometer la supervivencia de los peces.
En comparación con los otros métodos para la entrega de plásmidos y el etiquetado celular comúnmente utilizados en el campo, la electroporación tiene ventajas obvias. A pesar de los pasos críticos mencionados anteriormente, sucede muy raramente que no se pueden observar células electroporadas o que las células ependimales dorsales se electroporan por error. Generalmente, la tasa de éxito de este protocolo de electroporación es 90%-95% y observamos casi ninguna célula TUNEL+ después de la electroporación. A diferencia de la lipofección, por ejemplo, durante la electroporación, no se utilizan liposomas catiónicos (por ejemplo, lipofectamina) y por lo tanto la toxicidad relacionada con su uso se evita por completo26. Anteriormente se informó que la lipofección y la electroporación tienen las mismas tasas de eficiencia (20-50 células por telencéfalo)27. Sin embargo, este protocolo optimizado generalmente produce 100-200 células por telencéfalo. En comparación con los vectores virales, la bioseguridad no es un problema con la electroporación.
Además, los AAV o lentivirus de uso común no producen una expresión detectable de transgenes en el cerebro del pez cebra17,28. Por último, aunque el sistema Cre-lox se utiliza comúnmente en el pez cebra, la electroporación de plásmido es más rápida ya que no requiere largos tiempos de espera necesarios para la cría y el cultivo de peces y permite el etiquetado y el rastreo celular individual. Sin embargo, esta técnica requiere que los científicos altamente cualificados logren una electroporación exitosa y altas tasas de supervivencia de animales experimentales (normalmente experimentamos tasas de supervivencia de 70%-80%). Esta tasa también tiende a fluctuar dependiendo del experimentador. Aprender el procedimiento requiere práctica y normalmente toma tres pruebas. Sin embargo, esto depende de la destreza manual del individuo y puede tomar más tiempo en algunos casos.
El protocolo de electroporación presentado es un método rápido y altamente eficiente para electroportar un gran número de células ependymoglial con las precauciones necesarias para obtener resultados óptimos. La electroporación del telencéfalo adulto de pez cebra es crucial para visualizar las células ependymoglial individuales y estudiar sus funciones en la neurogénesis y los procesos de regeneración. Recientemente, se ha logrado el éxito en la interrupción simultánea de múltiples genes del telencéfalo adulto de pez cebra a través de la edición de genes a través de las técnicas de electroporación y StagR-Cas922. Esto abre muchas posibilidades y futuras aplicaciones de electroporación para una amplia gama de manipulaciones genéticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Un agradecimiento especial a James Copti por editar el manuscrito. También agradecemos la financiación a JN de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) por el SFB 870 y SPP "Análisis Integrativo de Olfacción" y SPP 1738 "Funciones emergentes de ARN no codificantes en el desarrollo del sistema nervioso, plasticidad y enfermedad", SPP1757 " Heterogeneidad glial", y Estrategia de Excelencia en el marco del Clúster de Neurología de Sistemas de Múnich (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
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