Summary
여기서 제시된 것은 성체 제브라피쉬 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA 전달 및 에펜디모글리아 세포 라벨링을 위한 전기개공 방법이다. 이 프로토콜은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 추적하는 빠르고 효율적인 방법이며 광범위한 유전 조작에 전기 증시인을 적용할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다.
Abstract
전기 개출은 세포막에 일시적인 기공을 생성하고 투과성을 증가시켜 다른 분자가 세포에 도입 될 수 있도록 하는 형질전환 방법입니다. 이 논문에서, 전기 천공은 성인 얼룩말 말살기의 심실 영역을 일렬로 세워 ependymoglial 세포에 플라스미드를 소개하는 데 사용됩니다. 이들 세포의 일부분은 줄기 세포 특성을 보여주고 제브라피시 뇌에서 새로운 뉴런을 생성한다. 그러므로, 그들의 행동을 공부하는 것은 신경 발생과 재생에 있는 그들의 역할을 결정하기 위하여 필수적입니다. 전기 개공을 통해 플라스미드를 도입하면 단일 에펜디모글리아 셀의 장기 라벨링 및 추적이 가능합니다. 또한 Cre recombinase 또는 Cas9와 같은 플라스미드는 단일 ependymoglial 세포로 전달될 수 있어 유전자 재조합 또는 유전자 편집을 가능하게 하고 제어된 천연 에서 세포의 자율 적인 유전자 기능을 평가할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 환경. 마지막으로, 이 상세한, 단계별 전기 천공 프로토콜은 다수의 단일 ependymoglial 세포에 플라스미드의 성공적인 도입을 얻기 위해 사용된다.
Introduction
Zebrafish는 찔린 상처 부상 후 뇌 재생을 검사하는 우수한 동물 모델입니다. 포유류에 비해, 진화 사다리에, 제브라피시와 같은 덜 진화 된 종은 일반적으로 구성 신경 발생의 높은 비율을 보여주고 성인 신경 줄기 세포 거주의 넓은 영역, 전반에 걸쳐 새로운 뉴런의 일정한 생성으로 이어지는 성인 생활에서 대부분의 뇌 영역. 이 기능은 포유류 1에 비해 제브라피시의 상당히 높은 재생 능력과 상관 관계가 나타납니다1,제브라피쉬는 효율적으로 연구대부분의뇌 손상 모델에서 새로운 뉴런을 생성하는 놀라운 잠재력을 가지고2, 3,4,5,6,7,8. 여기에서, 얼룩말 말살론은 성인기에 있는 눈에 띄는 신경 발생을 가진 두뇌 지역이기 때문에, 공부됩니다. 이러한 성인 신경발생 영역은 성인 포유류뇌의신경발생 영역과 상동성이며9,10,11.
얼룩말기 말뇌에 풍부한 신경 영역은 세포 또는 ependymoglia 세포 같이 방사형 신경교의 존재 때문에 존재합니다. Ependymoglial 세포는 상주 성체 신경 줄기 세포역할을 하며 뇌의 손상및 재생 모두에서 새로운 뉴런의 생성을 담당하고 있으며3,5. 계보 추적 실험은 심실 ependymoglia가 상해에 반응한다는 것을 보여주었습니다, 그 때 증식하고 병변사이트5로이동하는 새로운 neuroblasts를 생성합니다. zebrafish 말뇌파의 적중특성으로 인해, ependymoglial 세포는 심실 표면을 일렬로 세우고 심실 벽을 건설합니다. 등쪽 심실 벽은 등쪽 에펜디멀 세포층에 의해 형성된다(도1A). 중요한 것은, 제브라피쉬 ependymoglia는 포유류 방사형 글리아 및 형형 세포 둘 다의 특성을 구현합니다. 긴 방사형 과정은 방사형 신경교 세포의 전형적인 특징이며, 반면 세포 확장 및 단단한 접합부 (뿐만 아니라 심실 위치)는 ependymal 세포12,13,14의전형적인 특징이다. 따라서, 이들 세포는 에펜디모글리아 세포라고 한다.
재생 중에 단일 ependymoglial 세포의 생체 내 거동을 따르려면, 그들은 안정적으로 표지 될 필요가있다. 형광 현미경 검사법에 대한 생체 내 세포 표지의 다양한 방법은 내인성 리포터 또는 친유성염료(15)와같은 이전에 기술되어 왔다. 이러한 방법은 전기 천공과는 달리 더 오랜 시간이 필요할 수 있으며 종종 단일 세포 라벨링 또는 영구 장기 추적의 가능성을 제공하지 않습니다. 전기 천공은, 그러나 (단 하나 세포 표지 이외에) 호스트 세포로 새로운 DNA를 소개의 가능성을 제안합니다. 더욱이, 세포 내로의 DNA 전달의 다른 방법에 비해, 전기천공은16,17,18,19중가장 효율적인 방법 중 하나인 것으로 입증되었다.
여기서 제시된 것은 성체 얼룩말기 말뇌골론에서 단일 에펜디모글리아 세포에 라벨을 붙이기 위한 목적으로 정제된 전기 개루 프로토콜이다. 이 프로토콜은 장기간20에 걸쳐 이를 따르거나 세포 자율 방식으로 특정 경로를 조작하기 위해 단일 ependymoglial 세포의 라벨링을허용한다 21,22.
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Protocol
이 프로토콜에 사용된 모든 동물은 표준 축산 조건하에서 보관되었으며, EU 및 상부 바이에른 정부의 취급 지침 및 규정에 따라 실험이 수행되었습니다(AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. 전기 포공용 플라스미드 혼합물 의 준비
- 멸균수에 관심 있는 플라스미드를 희석하고 빠른 녹색 얼룩 스톡 용액 [1 mg/mL]을 추가합니다. 플라스미드의 최종 농도가 1 μg/μL인지 확인하십시오.
- 일단 준비되면, 위아래로 여러 번 또는 손가락으로 두드리는 하여 플라스미드 용액을 섞는다. 사용 전까지 실온(RT)에 보관하십시오.
참고: 동일한 세포에 두 플라스미드의 공동 전기화를 위해, 혼합물에 사용되는 각 개별 플라스미드의 농도가 80%-90% 공동 전기화 효율을 얻기 위해 1:1의 몰 비율로 0.8 ng/μL 이상인지 확인한다.
2. 주입 및 전기 증식 절차 준비
- 바늘 당기기의 주입에 필요한 유리 모세혈관(외경 1mm, 내경 0.58mm)을 준비한다.
- 올바른 양의 플라스미드를 주입하려면(위 참조) 68.5°C의 온도에서 두 개의 가볍고 두 개의 무거운 무게로 모세관을 당깁니다(풀러 사양에 대한 재료 표 참조).
참고: 다른 풀러를 사용하는 경우 모세관을 보정하여 적절한 양의 전기 천자 혼합물을 전달합니다. - 사출 장치를 200 hPa의 사출 압력(Pi 노브를 돌려) 및 0 hPa의 일정한 압력으로 수동으로 설정합니다. 수동으로 분사 시간을 수동 모드로 설정하고 풋 페달로 압력을 제어합니다.
- 전기 개출 장치를 54-57V(각각 1s 간격으로 25ms)에서 5개의 펄스로 "LV 모드"로 설정합니다. 전극을 장치에 연결합니다.
- 깨끗한 물고기 물로 하나의 어항을 준비, 여기서 물고기는 전기 천공 절차 후 마취에서 깨어날 것이다. 물고기가 완전히 깨어날 때까지 전체 복구 기간 동안 에어 펌프에 부착 된 공기 돌을 유지하여 물을 aerate.
- 일반 부엌 스폰지를 가지고 주사 및 전기 증시 동안에 물고기를 개최 스폰지에 세로 컷을합니다 (이전 출판물참조 3).
참고: 부엌 스폰지는 정기적으로 세척하거나 잠재적 인 독성 화학 물질을 제거하기 위해 교환해야합니다. - 소량의 고전도성 다목적 초음파 젤을 주입 및 전기 화 기 설정 옆에 놓습니다.
참고: 이것은 적절한 전기 전도도를 보장하고, 결과적으로, 전체 텔렌세판론에 걸쳐 전기 세포의 분포를 보장합니다.
3. 제브라피시 마취
- 마취 전에 증류수에서 0.2 % MS222로 마취의 재고 용액을 준비하고 Tris-HCl 버퍼로 pH를 7로 조정하십시오. 생선물을 사용하여 이 스톡을 1:10(즉, 0.02% MS222)로 희석합니다.
- 몸과 아가미의 움직임이 가라 앉을 때까지이 작업 솔루션에 그들을 유지 하 여 물고기를 마 세 게 (일반적으로 몇 분 동안).
4. 플라스미드 용액 주입
- 마이크로 로더 팁을 사용하여 10 μL의 플라스미드 용액으로 준비된 유리 모세관을 채웁니다. 모세관 내부에 기포가 형성되는 것을 피하십시오.
- 사출 장치에서 메뉴/변세관 을 누릅니다. 바늘을 삽입하고 바늘 홀더에 고정하십시오.
- 3.2x 또는 4x배배의 배율의 입체 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 모세관 의 끝만 자른다. 변속 모세관 모드에서 주입 모드로 사출 장치를 전환한 다음 풋 페달로 압력을 가하여 플라스미드 용액이 바늘에서 쉽게 실행되고 방해가 되지 않도록 합니다.
- 축산 탱크에서 마취 용액이있는 용기 (플라스틱 상자)로 물고기를 옮니다. 아가미의 움직임이 가라 앉을 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
- 등쪽쪽을 위로 향하여 미리 젖은 스폰지에 생선을 넣습니다. 절차의 정확성을 보장하기 위해 입체 현미경에서 다음 의 모든 주입 단계를 수행합니다.
- 40mm 절삭날과 0.5mm 두께의 스테인레스 스틸에서 해부 마이크로 나이프를 사용하여, 말렌세팔론의 후방에 물고기 두개골에 작은 구멍을 만들(그림 1B),광학 tectum와 국경 바로 옆에.
참고: 이 단계는 구멍이 뇌 손상을 피하기 위해 두개골만 관통하는 매우 작고 피상적이어야하기 때문에 신중하게 수행해야합니다. - 필요에 따라 물고기를 기울이고 구멍을 통해 모세관 팁의 침투를 용이하게하기 위해 올바른 각도로 두개골을 향해 유리 모세관의 끝을 방향.
- 두개골의 구멍을 통해 모세관의 끝을 조심스럽게 삽입하여 텔렌스뇌실 심실에 도달할 때까지 하십시오(그림 1B참조). 이것은 등쪽 ependymal 세포 층을 통해 침투를 요구할 것이다. 특히 모세관을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의하여 뇌 조직과의 접촉을 피하십시오. 등등 ependymal 층을 관통 한 직후 심실 내부에 남아있는 반구 사이에 정확하게 모세관을 유지합니다.
참고: 이것은 매우 섬세한 단계입니다. 이 절차의 정확도는 황동24와같은 착색 돌연변이 라인을 사용하여 향상되어 주입 시 유리 모세관 위치를 더 잘 시각화 할 수 있습니다. - 심실 내부의 모세관 팁을 사용하여 약 10 s의 풋 페달에 압력을 가하여 플라스미드 용액을 주입하십시오.
참고: 바늘 풀러, 모세 혈관 또는 인젝터를 변경하는 경우 항상 1 μL의 플라스미드 용액을 제공하기 위해 시스템을 보정해야합니다. 캘리브레이션은 광유(예를 들어, 파라핀 오일)로 추방된 플라스미드 액적의 직경을 측정하고 이어서 액적의 부피를 계산함으로써 수행될 수 있다. 10 s의 주입 후, 미네랄 오일로 추방 된 플라스미드 액체의 ~ 1 μL이 있어야합니다. - 심실 전체에 걸쳐 액체의 확산을 관찰하여 이전 단계의 성공을 확인합니다.
5. 전기 천공
- 스폰지에 들고 있는 동안 주입 셋업에서 물고기를 제거합니다.
- 초음파 젤에 전극 끝의 내부면을 담급전시.
- 소량의 초음파 젤로 생선 텔렌스팔론을 덮습니다.
- 물고기 머리를 전극 사이에 놓고, 포지티브 전극을 물고기 머리의 복부쪽에 놓고 등쪽(그림1C)에음극을 놓고 스폰지에 물고기의 몸을 유지합니다. 이것은 심실 영역에 위치한 전기 ependymoglia에 필요한 전류의 흐름의 방향을 설정합니다.
- 전극을 텔레렌팔론에 대해 부드럽고 정밀하게 누릅니다(그림1C). 풋 페달로 전류를 관리합니다. 5개의 펄스가 모두 완료될 때까지 전극을 제자리에 고정합니다.
6. 물고기 복구
- 물고기가 깨어날 때까지 이전에 준비된 지속적으로 포번수 탱크에서 물고기를 회복시키십시오. 리도카인 젤은 아마도 개발 된 통증을 완화하기 위해 두개골에 적용 할 수 있습니다.
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Representative Results
기재된 전기천공 방법은 플라스미드 DNA를 에펜디모글리아 세포내로 전달할 수 있으며, 이는 얼룩말 말살기 및 등쪽 에펜디알 세포층 바로 아래에 표면적으로 위치한다(도1A).
전기 천공의 결과가 양성인 경우, 표지된 단일 에펜디모글리아 세포(도 2A, B의적혈구)는 다른 에펜디모글리아 세포 들 사이에서 관찰될 수 있다(도 2A, B에서백색). 전기 천공 과정의 효율에 따라, 더 높은(도 2A)이하(도 2B)회교 신경통 세포의 수가 표지될 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜은 이전에 게시된20개보다더 많은 레이블이 지정된 셀수를 생성하며, 이는 그림 3A 및 비디오 1에서명백하게 나타납니다. 표지된 세포의 가장 높은 밀도는 주입된 플라스미드 액체가 반구 사이에 분배되는 방식으로 인해 두 반구의 내부, 심실 측에서 주로 나타나는 경향이 있음을 언급 할 가치가 있습니다(그림 3A). 비디오 1에서,제브라피시 말렌세팔론의 한 반구가 3D로 제시되고, 방사형 과정을 가진 ependymoglial 세포는 측에서 볼 수 있습니다. 세포는 두 개의 플라스미드, tdTomato-mem (세포막에 고정된 적색 형광 단백질) 및 H2B-YFP 플라스미드(라벨링 핵)로 공동 전기화및 표지된다. 노란 원으로 둘러싸인 2 개의 핵의 세포 분열에 유의해야 한다.
전기 증시에 실패하면 매우 적은 수또는 라벨이 부착된 에펜디모글리아 세포가 없습니다. 이 결과는 일반적으로 모세관의 끝이 등쪽 ependymal 세포 층을 관통하지 않는 부정확한 주입에 의해 설명 될 수있다. 이 경우, 플라스미드 용액은 말순뇌부 심실을 채우는 대신 등쪽 ependymal 세포 층 위에 퍼립니다. 이것은 전적으로 표지되는 ependymal 세포로 이끌어 냅니다(그림 3B). 등쪽 ependymal 세포 (그림 3B에서파란색 화살표)는 ependymoglial 세포 (그림 3A에서노란색 화살표)와 형태학적으로 다릅니다. 그들의 소종은 더 크고 입방체이며 방사형, 길쭉한 과정을 가지고 있지 않습니다. 이는 에펜디모글리아 세포층의 측면 도면을 비교한 것에서분명하다(도 4A,B). TdTomato-mem 표지된 세포는 대부분 ependymal 세포이며, 이는 ependymoglia의 층 위에 위치한다(그림 4B). 대조적으로, 도 4A에서,tdTomato-mem 을 발현하는 플라스미드는 개별 에펜디모글리아 세포에 도입된다. 따라서, 그들은 tdTomato-mem 그들의 초기 라벨 이외에 표현 (이 경우, 형질 전환 gfap:GFP 물고기 라인, 흰색에서 볼).
이 프로토콜은 단기-21 또는 장기3 기간 동안 부상 후 제브라피시 텔렌세팔론에서 에펜디모글리아 세포의 행동에 대한 라벨링 및 후속 다음을 가능하게 한다. 이것은 살아있는, 생체 내 화상 진찰을 통해 달성되고 재생과 신경 발생에 있는 그들의 역할의 질문을 해결하는 것을돕습니다.
그림 1: 에버티피쉬 텔렌팔론의 관상 동맥 부술의 개략적 표현. (A)제브라피쉬 텔렌세팔론의 관상동맥 부속을 구성하여 심실 표면을 일렬로 세우고 심실 벽을 구축하는 뇌회경 세포의 위치를 강조합니다. 등도 성 회엽층은 두 개의 반구를 연결하고 심실 (V)을 덮고, 두 세포 층 사이에 위치: ependymoglial 및 ependymal. 그림 2와 그림 3에검은 색 화살표와 눈의 표현은 뷰를 나타냅니다. (B)왼쪽에 있는 제브라피쉬 머리 의 사진은 흰색 파선으로 텔렌팔론의 위치를 강조합니다. 유리 모세관은 모세관 삽입을 위한 표적 부위와 함께 빨간색으로 묘사됩니다. 오른쪽 사진은 붉은 색플라스미드 주사의 위치를 보여주는 제브라피시 뇌의 회로도입니다. 유리 모세관이 말렌세팔론을 만지지 않으며 플라스미드가 말뇌파 바로 위에 심실로 주입된다는 점에 유의해야합니다. T = 말렌전, OT = 광학 tectum. (C)왼쪽에 그려진 제브라피시 헤드(측면도)의 사진이며, 오른쪽에는 말렌세프론을 표적으로 하기 위해 전극의 위치를 나타내는 머리(측면도)의 묘사가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 효과적인 전기 개공 결과를 보여주는 현미경. (A)더 크거나(B)성인 제브라피쉬 말순도에서 의 전기화 된 에펜디모글리아 세포의 수가 더 적은 3차원 표현은, 위에서 본 바와 같이. 전기포공은 모든 에펜디모글리아 세포에서 GFP 형광 단백질(흰색으로 묘사)을 발현하는Tg(gfap:GFP)어라인에서 이루어졌다. 개별 전기 세포는 pCS2-tdTomato-mem plasmid3로표시되어 있습니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성공과 실패한 전기 천공의 차이를 묘사한 공초점 현미경 사진. (A)많은 수의 pCS-tdTomato-mem 전기 화구를 가진 BABB 클리어제브라피쉬 텔렌세폰(REF)의 3차원 공초점 이미지. 길고 길쭉한 과정 (노란색 화살표)을 가진 ependymoglial 세포의 형태에 주목해야합니다. 노란색 파선으로 강조 표시된 두 말뇌구 반구를 모두 관찰 할 수 있습니다. (B)pCS2-tdTomato-mem 플라스미드의 전기 천공 실패의 공초점 이미지. 대부분 등쪽 에펜디멀 세포는 라벨이 붙어 있으며, 몇몇 에펜디모글리아 세포는 tdTomato-mem 플라스미드를 발현한다. 형형세포(파란색 화살표)의 형태에 대한 명확한 차이를 주목해야 합니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전기포상 및 비전기화 된 ependymoglial 세포의 3D 측면 보기. (a)3차원 측면 표현 은 전형 에펜디모글리아 세포, Tg(gfap:GFP) 및 pCS2-tdTomato-mem(노란색 화살표)에 대해 양성이다. (B)실패한 전기 포더레이션의 3D 측면 표현. Tg(gfap:GFP)ependymoglia 층 위의 pCS2-tdTomato-mem 양성 세포의 위치에 유의해야 한다. 가장 가능성이 등쪽 ependymal 층 세포는 전기 화되었다 (파란색 화살표). 배율 막대 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 제브라피쉬 텔렌세팔론 및 전기화 된 에펜디모글리아 세포의 3D 영화. 비디오는 3D로 얼룩말 기 말뿔소의 한 반구를 보여줍니다. Ependymoglial 세포는 두 개의 플라스미드와 함께 전기화됩니다: tdTomato-mem (세포막에 고정된 적색 형광 단백질) 및 H2B-YFP 플라스미드 (라벨링 핵). 옆으로 관찰 할 수있는 방사형 공정으로 개별적으로 라벨이 부착 된 ependymoglia. 노란색 원은 H2B-YFP 라벨 염색질에 의해 시각화 된 유사체 그림과 ependymoglial 세포를 강조. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
이러한 전기 개공 프로토콜은 개별 에펜디모글리아 세포를 라벨링하는 신뢰할 수 있는 생체 내 방법이다. 프로토콜은 뉴런 또는 올리고엔드로시트와 같은 다른 세포 유형에 라벨을 붙이기 위해 추가적인 적응이 필요할 수 있다. 성공적인 라벨링을 달성하기 위해, 다른 프로모터를 함유하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 치킨 베타 액틴 프로모터, eF1alpha, CMV 및 유비퀴틴 프로모터는 이전에 에펜디모글리아 및 그들의자손(23)에서상이한 트랜스유전자의 발현을 유도하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이식 유전자 발현의 상이한 역학은 계정으로 취해야 하는 관찰되었다. 예를 들어, CMV 프로모터 구동 이식유전자 발현은 매우 빠르며(24시간 후에 발현이 보일 수 있음), eF1alpha는 더 오래 걸린다. 라벨링 외에도, 전기천공 프로토콜은 Cre 재조합 또는 CRISPR Cas9 기술22를사용하여 유전자 편집의 빠르고 간단한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 더욱이, 플립 카세트25의사용은 세포 유형별 Cre 라인에서 플라스미드 및 그들의 전기포공화를 함유하고 있는 후 생성된 에펜디모글리아 자손에서 라벨링 또는 유전자 편집을 허용하는 방법의 명확한 연장으로 작용할 수 있다. 전기 화.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 주사 단계 동안, 실험은 주입된 플라스미드 양이 각 개별 어류에 대해 동일하도록 주의해야 하며, 따라서 표지된 세포의 수는 비교적 비슷하게 유지된다. 이것은 유리 모세관 개구부의 크기를 제어함으로써 달성 될 수있다, 각 팁의 절단은 서로 다른 모세 혈관 사이에 일정해야한다는 것을 의미 또는 교정은 각각의 개별 모세관에 대해 수행되어야한다. 또한, 발 페달에 의해 조절 되는 주입의 기간, 각 개별 주입에 대 한 동일 해야. 둘째, 마이크로 나이프로 만든 두개골에 구멍의 적절한 위치는 텔렌세팔론 전체에 걸쳐 플라스미드 액체의 적절한 분산에 매우 중요합니다. 프로토콜에 명시된 바와 같이 모세관 팁으로 등지 성 형화 세포 층을 관통하는 것이 똑같이 중요합니다. 또한, 생성된 구멍이 너무 크지 않아 서투르니혼합물과 뇌척수액이 담사음에서 새어나오는 것을 방지하는 것이 필수적입니다. 또 다른 중요한 단계는 적용된 전류의 강도입니다. 적용 된 전류의 강도가 항상 정확하지 않은 화면에 나타나는 전압에서 많이 벗어나지 않도록 전기 개화 장치가 가능한 한 정확하게 작동하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 값이 일치하지 않는 경우, 투여된 전류가 권장54-57 V보다 높게 투여되어 어류 생존을 손상시킬 수 있기 때문에 전기개행 장치에서 전류의 강도를 조절할 필요가 있다.
현장에서 일반적으로 사용되는 플라스미드 전달 및 셀 라벨링을 위한 다른 방법에 비해 전기 천공은 명백한 장점이 있습니다. 위에서 언급 한 중요한 단계에도 불구하고, 전기 전지가 관찰 될 수 없거나 등쪽 ependymal 세포가 실수로 전기 화되는 것은 매우 드물게 발생합니다. 일반적으로, 이 전기 천공 프로토콜의 성공률은 90 %-95 %이며 우리는 전기 천공 후 거의 TUNEL + 세포를 관찰하지 않습니다. 예를 들어, 전기개광 동안, 양이온리포솜(예를 들어, 리포펙타민)은 사용되지 않으며, 따라서 그 사용과 연결된 독성은26을완전히 회피한다. 이전에는 지방흡입 및 전기천공이 동등한 효율율(텔렌셀론당 20-50세포)을 갖는다는27. 그러나, 이 최적화된 프로토콜은 일반적으로 텔렌팔론 당 100-200개의 세포를 산출한다. 바이러스 벡터와 비교하여, 생체 안전은 전기 천공에 문제가되지 않습니다.
또한, 일반적으로 사용되는 AAV 또는 렌티바이러스는 제브라피시 뇌에서 검출 가능한 형질전환의 발현을 생성하지 못하며,28. 마지막으로, Cre-lox 시스템은 요즘 제브라피시에 일반적으로 사용되지만, 플라스미드 전기 천공은 물고기 사육 및 성장에 필요한 긴 대기 시간을 필요로하지 않으며 개별 세포 라벨링 및 추적을 허용하기 때문에 더 빠릅니다. 그러나, 이러한 기술은 실험 동물의 성공적인 전기 천공 및 높은 생존율을 달성하기 위해 고도로 숙련 된 과학자를 필요로 (우리는 일반적으로 ~ 70 %-80 %의 생존율을 경험). 이 비율은 또한 실험자에 따라서 변동하는 경향이 있습니다. 절차를 배우는 것은 연습이 필요하고 일반적으로 세 가지 시험이 필요합니다. 그러나, 이것은 개인의 수동 손재주에 따라 달라 지 며 경우에 따라 더 오래 걸릴 수 있습니다.
제시된 전기 개화 프로토콜은 최적의 결과를 얻기 위해 필요한 예방 조치와 함께 많은 수의 ependymoglial 세포를 전기화하는 빠르고 매우 효율적인 방법입니다. 성인 얼룩말 말살기 의 전기 기광은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 신경 발생 및 재생 과정에서 그들의 역할을 공부하기 위해 중요합니다. 최근에는 전형및 StagR-Cas9기술(22)을통한 유전자 편집을 통해 성인 제브라피쉬 텔렌스팔론의 여러 유전자의 동시 중단에 성공이 달성되고 있다. 이것은 유전 조작의 넓은 범위에 대한 전기 poration의 많은 가능성 그리고 미래 응용을 엽니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고의 편집제임스 콥티에 특별한 감사. 우리는 또한 SFB 870및 SPP "Olfaction의 통합 분석"과 SPP 1738 "신경계 발달, 가소성 및 질병에서 비 코딩 RNA의 새로운 역할", SPP1757에 의해 독일 연구 재단 (DFG)에서 JN에 자금을 감사하게 인정합니다. " Glial 이질성", 시스템 신경학에 대한 뮌헨 클러스터의 프레임 워크 내에서 우수 전략 (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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