Summary
يمكن أن تركز الموجات فوق الصوتية مع وكلاء microbubble فتح حاجز الدم في الدماغ بشكل مركز وعابر. وقد استخدمت هذه التقنية لتقديم مجموعة واسعة من العوامل عبر حاجز الدم في الدماغ. توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل للتسليم المترجمة إلى الدماغ القوارض مع أو بدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي.
Abstract
جراحة تكسيف هو المعيار الذهبي للمخدرات المحلية وتسليم الجينات إلى الدماغ القوارض. هذه التقنية لديها العديد من المزايا على التسليم النظامي بما في ذلك التعريب الدقيق إلى منطقة الدماغ المستهدفة والحد من الآثار الجانبية الهدف. ومع ذلك، فإن جراحة تكسينية مجسمة هي شديدة التوغل مما يحد من فعاليتها الترجمية، وتتطلب أوقات تعافي طويلة، وتوفر تحديات عند استهداف مناطق متعددة في الدماغ. يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) بالاقتران مع الزبقات الدقيقة المتداولة لفتح حاجز الدم في الدماغ (BBB) في مناطق بحجم ملليمتر. يسمح هذا التعريب داخل الجمجمة من العوامل التي يتم تسليمها بشكل نظامي التي لا يمكن عادة عبور BBB. توفر هذه التقنية بديلاً غير جراحي للجراحة اجسارية. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع في مختبرات علم الأعصاب بسبب محدودية الوصول إلى المعدات والطرق الموحدة. والهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير نهج سطح المقعد لفتح FUS BBB (BBBO) بأسعار معقولة وقابلة للتكرار، وبالتالي يمكن اعتماده بسهولة من قبل أي مختبر.
Introduction
على الرغم من الاكتشافات العديدة في علم الأعصاب الأساسية، فإن عدد العلاجات الناشئة لاضطرابات النمو العصبي والاعصاب لا تزال محدودة نسبيا1،2. وقد اقترح فهم أعمق للجينات والجزيئات والدوائر الخلوية المشاركة في الاضطرابات العصبية العلاجات الواعدة التي لا يمكن إدراكها في البشر مع التقنيات الحالية3. غالباً ما تكون محدودة العلاجات الفعالة من قبل الحاجة إلى أن تكون penetrable الدماغ وموقع محدد4,5,6,7,8. ومع ذلك، فإن الطرق الحالية لتوصيل المخدرات المحلية إلى مناطق معينة من الدماغ (على سبيل المثال، الولادة عن طريق الحقن أو القنية) هي طرق غازية وتتطلب فتحًا في الجمجمة9. يمنع غزو هذه الجراحة الاستخدام الروتيني للتسليم الموضعي في الدماغ البشري. بالإضافة إلى ذلك ، تلف الأنسجة والاستجابات الالتهابية الناتجة هي الخلطات في كل مكان للدراسات الأساسية وما قبل الإكلينيكية التي تعتمد على الحقن داخل الدماغ10. القدرة على تسليم وكلاء nonininsiveively عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) واستهدافهم إلى مناطق محددة في الدماغ يمكن أن يكون لها تأثير هائل على علاجات الاضطرابات العصبية، في حين توفير في الوقت نفسه أداة تحقيق قوية للبحوث قبل الإكلينيكية.
طريقة واحدة من وسائل النقل المستهدفة عبر BBB مع الحد الأدنى من الضرر الأنسجة هو الموجات فوق الصوتية التركيز transcranial (فوس) جنبا إلى جنب مع microbubbles لفتح محوري وعابر BBB11،12،13،14،15،16. وقد اكتسب فتح FUS BBB الاهتمام الأخير لعلاج الاضطرابات العصبية ، السكتة الدماغية و الدبقية عن طريق توطين العلاجات لاستهداف مناطق الدماغ مثل العوامل العصبية17,18,19, العلاجات الجينية20,21,22, الأجسام المضادة23, الناقلات العصبية24, و الجسيمات النانوية25,26,27,28,29. مع مجموعة واسعة من التطبيقات وطبيعتها غير الباضعة30,31, فتح FUS BBB هو بديل مثالي للحقن التريو كسيائي داخل الجمجمة. وعلاوة على ذلك، نظرا لاستخدامها حاليا في البشر30،32، يمكن اعتبار التحقيقات قبل الظهر باستخدام هذه التقنية الترجمية للغاية. ومع ذلك ، FUS BBB فتح لم يتم بعد تقنية راسخة على نطاق واسع في العلوم الأساسية والبحوث قبل الكلينيكية بسبب عدم وجود إمكانية الوصول. لذلك، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنهج benchtop لفتح FUS BBB كنقطة انطلاق للمختبرات المهتمة في تأسيس هذه التقنية.
وقد أجريت هذه الدراسات مع إما الهواء عالية الطاقة المدعومة FUS محول الموجات فوق الصوتية محددة أو انخفاض الطاقة تخمد ركزت محول الغمر بالموجات فوق الصوتية. وكانت محولات مدفوعة من قبل مكبر للصوت RF السلطة مصممة للأحمال التفاعلية ومولد وظيفة benchtop القياسية. يمكن العثور على تفاصيل هذه العناصر في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة الدول الأمريكية.
1. التركيز على الموجات فوق الصوتية معدات القيادة الإعداد
- استخدام 50 أوم كابلات BNC محوري لتوصيل (1) مدخلات محول الموجات فوق الصوتية إلى إخراج مكبر للصوت RF و (2) مدخلات مكبر الصوت RF إلى إخراج مولد الدالة.
- تعيين وظيفة مولد وضع إلى انفجار الجيوب الأنفية مرة واحدة في الثانية مع دورة 1٪ واجب.
- لـ MHz 1 رطوبة منخفضة الطاقة غمر محول مع مسافة بؤرية 0.8 بوصة المستخدمة مع مضخم 50 dB RF، تعيين إعدادات البداية إلى: 1 ميغاهرتز موجة جيبية، 1 V الذروة إلى الذروة، 10K دورة، 1 s الفاصلة (أو الفترة).
- للهواء المدعوم، 1.1 ميغاهيرتز محول الطاقة العالية، تعيين الإعدادات الأولية إلى: 1.1 ميغاهيرتز موجة جيبية، 50 ميغا فولت الذروة إلى الذروة، 11k دورات، 1 S الفاصل الزمني.
ملاحظة: لا تقم بتشغيل محولات ما لم تكن مغمورة. لا تضع اليد أو جزء آخر من الجسم في التركيز بالموجات فوق الصوتية أو تلمس وجه محول أثناء العمل.
2. التركيز على الموجات فوق الصوتية benchtop الإعداد
- 3D طباعة الإطار stereotaxic وحامل الإطار stereotactic.
- ربط محول إلى مُوضع XYZ باستخدام المشبك الذي يحمل أنبوب PVC(الشكل 1a). قم بلصق المشبك على شريحة المحور X وقفل مع الجوز الجناح.
- إذا كان استخدام محول الموجات فوق الصوتية عالية الطاقة، إرفاقه إلى الأنابيب البلاستيكية باستخدام زوج متطابقة من المغناطيس. تأكد من أن المغناطيس واحد لديه ثقب والآخر لديه نتوء مطابقة. كاب الجزء السفلي من الأنابيب البلاستيكية وإرفاق واحدة من المغناطيس لذلك باستخدام الايبوكسي (انظر الشكل 1b).
- نعلق المغناطيس الثاني إلى مركز أعلى من محول الموجات فوق الصوتية عالية الطاقة باستخدام الايبوكسي. تأكد من أنه في مركز جدا من محول (الشكل 1c).
- في حالة استخدام محول الموجات فوق الصوتية عالي الطاقة، قم بعمل مؤشر لإبطال مُوضع XYZ. يشير طرف هذا المؤشر إلى الموقع في مساحة مركز تركيز محول الموجات فوق الصوتية عند توصيل محول الموجات فوق الصوتية بموضع XYZ. جعل مؤشر من 18 G قطع إبرة لتكون طول المسافة البؤرية من محول زائد سمك محول (الشكل 1d).
- تطبيق الايبوكسي إلى المغناطيس الثالث (هذا المغناطيس أيضا أزواج مع المغناطيس غطاء PVC) وإرفاقه إلى أعلى المؤشر. المؤشر سوف تكون قادرة على إرفاق ثم إلى المغناطيس على الأنابيب البلاستيكية لXYZ الإبطال (الشكل 1d).
- إذا كان استخدام محول الغمر منخفض الطاقة، 3D طباعة الملف للمؤشر ومقطع تصاعد.
- إرفاق محول الغمر منخفضة الطاقة إلى الأنابيب البلاستيكية عن طريق قص مقطع تصاعد على الأنابيب PVC وإدراج محول في الحلبة (الشكل 1F).
- جعل حمام الماء عن طريق الإلتصاق معا قطع من ورقة الاكريليك التي سوف تكون قادرة على بقية على رأس الحيوان فوق إطار stereotactic (الشكل 1e).
- قطع فتحة في الجزء السفلي من الحمام الذي هو حول حجم رأس الحيوان. تغطية ثقب في حمام الماء مع شريط بوليميد.
ملاحظة: يجب الحرص على ضمان عدم تسرب المياه حول الشريط البوليميد لأنها يمكن أن الرطب الفراء الفئران وتسبب انخفاض حرارة الجسم.
- قطع فتحة في الجزء السفلي من الحمام الذي هو حول حجم رأس الحيوان. تغطية ثقب في حمام الماء مع شريط بوليميد.
- جعل التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial عن طريق ملء 4 مم قطرها رقيقة قصفت البلاستيك أو الزجاج الكرة مع السائل المرئية التصوير بالرنين المغناطيسي (على سبيل المثال، فيتامين E النفط) وختم عليه. وضعه في حامل التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial على الجانب الأيمن من الإطار ستيريو 3D المطبوعة(الشكل 2a).
- تأمين بقوة حامل الإطار المطبوعة 3D إلى موضع XYZ في موقع جيد لتحديد المواقع الحيوانية. حرك علامة التبويب على الطرف الرستري لحامل الإطار إلى القناة المطابقة على السكك الحديدية المحور Y وتأمين مع مجموعة مسامير(الشكل 1h، السهام الحمراء).
- لقيادة مُوضع XYZ، قم بتثبيت USB إلى محول تسلسلي على جهاز كمبيوتر باتباع توجيهات الشركة المصنعة و توصيل المحول. تثبيت بيئة وقت التشغيل و برنامج تحكم المحرك على جهاز الكمبيوتر.
- تأكد من تحديد المنفذ التسلسلي المناسب في البرنامج عن طريق تحديد USB لتحويل تسلسلي في عنصر التحكم المنسدل تحديد المنفذ على اللوحة الأمامية لبرنامج وحدة التحكم. توصيل USB إلى محول تسلسلي إلى مربع تحكم المحرك السائر باستخدام كبل كروس تسلسلي 9-pin (على سبيل المثال، كبل مودم فارغ RS232).
- تشغيل برنامج وحدة تحكم لاختبار أن المحركات السائر يمكن أن تكون مدفوعة تحت مراقبة البرنامج. قد تتطلب هذه الخطوة المساعدة من دعم تكنولوجيا المعلومات المحلية.
3- إجراء الاستهداف داخل الجمجمة
ملاحظة: ذكور Sprague Dawley الفئران وزنها 250-350 غرام واستخدمت لهذه التجارب. الحيوانات كان لها حرية الوصول إلى الماء و الجرذان تشاو، وجرى الحفاظ على ضوء 12:12 ساعة: دورة مظلمة.
- وضع الحيوان تحت التخدير (3٪ isoflurane مع الأكسجين) والتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم. ثم أدخل القسطرة كما هو موضح أدناه.
- دفء الذيل مع مصباح لجعل من الأسهل لتصل إلى الوريد. يجب الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الحيوان أو لحرق الذيل.
- مرة واحدة في حالة من النوم الحيوان (لا يستجيب لقرصة إصبع القادوم)، إدراج 24 G الذيل الوريد القسطرة التي سيتم استخدامها لتقديم microbubbles، ايفانز صبغة زرقاء (EBD)، gadobutrol MRI التباين إذا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، وعامل تجريبي من الفائدة. بمجرد إصابة الوريد ، سيملأ الدم الغدد ، ويزيل الإبرة الداخلية ببطء بينما يدفع الغدد إلى الوريد.
ملاحظة: انظر دليل مثل ستيوارت وشرودر33 إذا كان يفعل حقن الوريد ذيل الفئران للمرة الأولى. - إذا لم يكن هناك تدفق للدم، قم بتحريك ادمة القسطرة ببطء خارج الوريد لاختبار أن الإبرة قد تكون قد مطعونة من خلال الوريد. إذا تدفق الدم عندما يتم سحب القسطرة قليلاً، ثم أولاً كزة ذهب من خلال الوريد ووضع القسطرة سوف تحتاج إلى إعادة تشغيل في مكان آخر على الذيل الذي هو روسسترال إلى الموقع السابق.
- املأ قابس القسطرة بالملوحة الملحية والمسمار في توصيل القسطرة في نهاية منفذ القسطرة بمجرد أن يمتلئ المنفذ بالدم. لف بعناية شريط المختبر حول القسطرة والذيل لإبقائه في مكانه. تبدأ مع قطعة صغيرة في الجزء العلوي والعمل في اتجاه السد، وترك نهاية جدا من القسطرة المكونات يتعرض.
- قم بتوصيل خط التخدير على موصل التخدير على الإطار المجسّم(الشكل 2a)وقم بإصلاح رأس الحيوانات في الإطار عن طريق وضع الفم على شريط العضة وتوجيه قضبان الأذن في كل من قنوات الأذن ، ثم شد مسامير المجموعة. تأكد من أن رأس الحيوانات آمن ومستوٍ.
- حرك الحيوان إلى سرير التصوير بالرنين المغناطيسي وربط خط التخدير بمخروط الأنف. في هذا البروتوكول تم استخدام 9.4 T صغيرة تحمل الرنين المغناطيسي الحيوانات.
- جمع الصور التاجية وتكيناتية T2 التي تلتقط الدماغ كله، فضلا عن التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial(الشكل 2b)لقياسات التنسيق. تزويد الفيزيائي أو التكنولوجيا المحلية التصوير بالرنين المغناطيسي المعلومات التالية حتى يتمكنوا من بناء بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي.
- للصور الإكللية(الشكل 2B الأعلى) ، استخدم المعلمات التالية: عدد الصور: 27 ، العرض: 62.2 مم ، الارتفاع: 62.2 مم ، العمق: 37.97 مم ، حجم Voxel: 0.24 × 0.24 × 1.41 مم3.
- للصور المحورية(الشكل 2b القاع)، استخدم المعلمات التالية: عدد الصور: 13، العرض: 61.47 مم، الارتفاع: 53.81 مم، العمق: 16.7 مم، حجم فوكسل: 0.41 × 0.21 × 1.29 مم3.
ملاحظة: ليس من الضروري أن يكون هذه المعلمات الدقيقة طالما أن التاجي في دقة الطائرة هو قريب من 0.25 ملم والصور تغطي الدماغ كله وfiducial.
- جمع القياسات تنسيق من الصور أعلاه عن طريق تسجيل المسافة من التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial إلى منطقة الدماغ التي سيتم استهدافها مع فوس.
- في الماسح الضوئي، على الصور التاجية التي تم جمعها في الخطوة 3.5، العثور على الصورة التي fiducial هو الأكبر، مما يدل على مركز fiducial. تسجيل المسافة من أعلى fiducial إلى منطقة الدماغ من الفائدة في مم (برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي سيكون لها مقياس أو أداة قياس نقطة، استشارة المحلية التصوير بالرنين المغناطيسي أو الفيزيائي حول كيفية القيام بذلك) في كل من اتجاه الوسيط / الجانبي وفي الاتجاه البطني الظهرية(الشكل 2B،أعلى).
- في الماسح الضوئي، على الصور المحورية التي تم جمعها في الخطوة 3.5، العثور على الصورة التي تظهر أعلى جدا من fiducial وقياس المسافة من مركز fiducial إلى منطقة الدماغ الهدف في كل من اتجاه الظهر /فيترالي وفي اتجاه وسطي / الجانب(الشكل 2B،أسفل).
- قارن بين القياسات الوسيطة / الجانبي وإذا كانت مختلفة استخدام المتوسط. سيتم استخدام هذه القياسات الإحداثيات لاحقاً في الخطوة 4.3 لتوجيه نقطة اتصال FUS إلى منطقة الدماغ الهدف مع موضع XYZ.
- جمع صور التصوير بالرنين المغناطيسي prescan. قارن هذه الصور إلى الصور التي تم جمعها بعد فتح FUS BBB(الشكل 4). سيتم استخدام الصور ذات الأوزان T1 لاحقًا لتصور افتتاح BBB ، سيتم استخدام الصور المرجحة T2 لاحقًا لضمان عدم حدوث تلف في الأنسجة بعد علاج FUS34.
- بالنسبة للصور المحورية المرجحة بـ T1، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 51.2 مم، العمق: 3.0 مم، حجم voxel: 0.23 × 0.2 × 0.23 مم3،عدد الصور: 13.
- بالنسبة للصور المحورية المرجحة بـ T2، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 51.2 مم، العمق: 2.6 مم، حجم voxel: 0.2 × 0.2 × 0.2 مم3،عدد الصور: 13.
- بالنسبة للصور التاجية المرجحة بـ T1، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 30 مم، العمق: 27 مم، حجم voxel: 0.16 × 0.16 × 1 مم3، عدد الصور: 27.
- بالنسبة للصور التاجية المرجحة بـ T2، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 30 مم، العمق: 27 مم، حجم voxel: 0.12 × 0.12 × 1 مم3، عدد الصور: 27.
ملاحظة: كما في الخطوة 3.5، يجب أن لا تكون هذه المعلمات التصوير نفس تماماً كما المسرودة. هذه الصور لها FOV أصغر ودقة أعلى من تلك التي تم تجميعها في الخطوة 3.5.
- حفظ الحيوان في إطار stereotaxic، نقل بسرعة الحيوان من السرير التصوير بالرنين المغناطيسي إلى سطح المقعد FUS الإعداد. تأكد من أن الحيوان لا يزال نائما لنقل تحت تأثير التخدير.
- لأوقات النقل الأطول، استخدم مربع لنقل كبير بما يكفي ليلائم الحيوان والإطار. مع قابس التخدير لا تزال تعلق، وضع الحيوان والإطار داخل منطقة الجزاء والسماح isoflurane الزائدة لملء مربع لبضع دقائق. افصل خط التخدير ونقل بسرعة.
4. تركيز إجراء الموجات فوق الصوتية
- عند وصوله إلى سطح المقعد FUS الإعداد، على الفور سد خط التخدير في مخروط الأنف والاستمرار في تشغيل 1.5-3٪ isoflurane مع الأكسجين. القيام بذلك في أسرع وقت ممكن لتجنب يستيقظ الحيوان.
- قم بزلاق الإطار إلى حامل الإطار ثم قم بمحاذاته في مكانه بحزم. استخدام مقصات لحلاقة رأس الحيوان. فرشاة بعيدا الشعر الزائد وتطبيق كريم مزيل الشعر على فروة الرأس. واسمحوا الجلوس لمدة 3 دقائق ومسح بعيدا بالماء والشاش.
- إذا لم يكن التصوير بالرنين المغناطيسي متاحًا لاستهدافه، استخدم إطارًا مجسمًا قياسيًا (غير مطبوع ثلاثي الأبعاد) لإبطال موضع المؤشر إلى البرما عن طريق لمس طرف المؤشر إلى البريغما (ستكون هناك حاجة إلى شق فروة رأس لهذا) وإبطال البرنامج أو تسجيل الإحداثيات. حرك حرف XYZ لأعلى بمقدار 50 مم بالنقر فوق الزر لأعلى 50 في البرنامج ومبادلة المؤشر للمحول. استنادا إلى أطلس دماغ الفئران كما هو موضح سابقا35، والانتقال إلى إحداثيات الدماغ المطلوب باستخدام أزرار يخطو في البرنامج. إذا كان استخدام هذا الأسلوب بدلاً من التصوير بالرنين المغناطيسي، انتقل لأسفل إلى المقطع 4.6.
- إذا كان استخدام التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي، إرفاق المؤشر وتحريك المؤشر إلى موقع التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial(الشكل 1d،ز). ضع المؤشر في أعلى مركز التصوير بالرنين المغناطيسي (يتم توفير ثقب صغير في أعلى الحامل فيديوسيل للإشارة). انقر فوق زر الموضع الخالية الذي هو النقطة التي تم حسابها من خلالها جميع المسافات في صورة MRI.
- إزالة المؤشر وتحريك الموضع إلى إحداثيات الوسيط/الجانبي وإحداثيات rostral/caudal. رفع الموضع حتى عن طريق الضغط على زر لأعلى 50 للسماح لوضع حمام الماء والموجات فوق الصوتية هلام. إذا تم الوصول إلى أعلى مفتاح السفر بمحور Z، سيتم إبطال موقع الإبطال. سيتم تعيين الإحداثيات الظهرية/البطنية بعد إضافة محول.
- تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على فروة رأس الحيوان ووضع حمام الماء على الحيوان مع نافذة الشريط البوليميد ضغطت على هلام. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في هلام الموجات فوق الصوتية.
- ملء حمام الماء بالماء دي الغاز.
- إذا كان استخدام محول الطاقة العالية، وخفض الموضع بحيث المغناطيس هو فقط فوق الماء. إرفاق محول إلى الموضع عن طريق خفض بعناية محول في الماء في زاوية لمنع فقاعات الهواء من الحصول على المحاصرين تحت الوجه وربط المغناطيس.
- إذا كان استخدام محول الغمر المنخفض الطاقة، خفض الموضع في الماء فقط فوق مقطع محول. ثم مقطع محول في مكان عن طريق خفض ببطء في الماء في زاوية لمنع فقاعات الهواء من الحصول على المحاصرين تحت الوجه.
ملاحظة: حمام شفاف مفيد عند النظر تحت واجهة محول للفقاعات. - خفض موضع إلى تنسيق الظهر /فينطال.
- قم بتشغيل AMP طاقة RF.
- حقن 1 مل / كغ من 3٪ ايفانز صبغة زرقاء (EBD) عن طريق التمسك تلميح إبرة في القسطرة المكونات والحقن. السماح لها لتعميم لمدة 5 دقائق.
- تفعيل microbubbles عن طريق هز لهم بعنف مع مع شاكر فقاعة.
- إعداد 5x جرعة 30 ميكرولتر / كغ من microbubbles (conc. 1.2 ×10 10 /مل) في 0.2 مل من المالحة لحساب 2 FUS العلاجات والأنابيب في 18 G مجنحة مجموعة التسريب. على سبيل المثال، إذا كان الجرذ يزن 200 غرام، ثم ملء حقنة تحتوي على 18 G إبرة تلميح مع 30 ميكرولتر من microbubbles في 1 مل من المالحة.
ملاحظة: تأكد من استخدام نصائح إبرة 18 G لكل من أخذ وحقن مع مجموعة ضخ مجنحة. - عكس حقنة عدة مرات للحصول على توزيع موحد من microbubbles. ثم نعلق وملء مجموعة ضخ مجنحة. ضع الحقنة على مضخة التسريب واضبط مضخة التسريب لتقديم 0.2 مل بمعدل 6 مل/ساعة. وهذا سيوفر ضخ بطيء من microbubbles على مدى 2 دقيقة FUS التعرض.
- أدخل الإبرة المجنحة في قابس القسطرة.
- إعداد 5x جرعة 30 ميكرولتر / كغ من microbubbles (conc. 1.2 ×10 10 /مل) في 0.2 مل من المالحة لحساب 2 FUS العلاجات والأنابيب في 18 G مجنحة مجموعة التسريب. على سبيل المثال، إذا كان الجرذ يزن 200 غرام، ثم ملء حقنة تحتوي على 18 G إبرة تلميح مع 30 ميكرولتر من microbubbles في 1 مل من المالحة.
- أولا، تشغيل مضخة التسريب، والانتظار 3 ق وبدء العلاج FUS عن طريق الضغط على زر تمكين الإخراج على مولد وظيفة (المسمى "على" على مولد وظيفة في جدول المواد). كرر هذه مرتين في المنطقة الواحدة مع 5 دقائق في ما بين للسماح للmicrobubbles لمسح.
- اضغط على زر على مرة أخرى على مولد وظيفة لوقف العلاج FUS عندما تتوقف مضخة ضخ في 2 دقيقة.
- انتظر لمدة 5 دقائق لmicrobubbles لمسح. ثم ابدأ في التسريب والعلاج الثاني FUS.
- مباشرة بعد العلاج FUS الثاني, حقن gadobutrol التباين (إذا كان استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي) وعامل الفائدة, على سبيل المثال, جزيئات الفيروسية. يجب ألا يتجاوز إجمالي حجم الكميات المسلمة لجميع الوكلاء 5 مل/كغ.
ملاحظة: قد يختلف توقيت التسليم (على سبيل المثال، قبل أو بعد فتح FUS BBB) من وكيل الفائدة اعتمادا على الوكيل المستخدم.
- إيقاف أمبير الطاقة RF ونقل الحيوان فورا مرة أخرى إلى التصوير بالرنين المغناطيسي.
5. MRI تأكيد افتتاح BBB
- إذا لم يكن MRI متوفراً، انتقل إلى القسم 6 واستخدم تعبير EBD لتأكيد فتح BBB.
- ضع الحيوان مرة أخرى على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الموقع بالضبط كما هو الحال في الخطوة 3.7 وقم بتوصيل خط التخدير.
- جمع التصوير بالرنين المغناطيسي بعد بمسح مع نفس المعلمات التصوير المستخدمة في الخطوة 3.7 لتصور تحسين التصوير بالرنين المغناطيسي gadobutrol في منطقة BBB فتح(الشكل 3B،ه).
6. الضخ وجمع الأنسجة
- Perfuse الحيوان مع cold 4٪ formalin حتى الدم يعمل واضحة تماما.
- إزالة الدماغ ومكان في 4٪ formalin أو PFA في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، ضع الدماغ في محلول السكروز 30٪ حتى يغرق الدماغ (حوالي 2-3 أيام). وأخيرا، فلاش تجميد في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التبريد.
- تجميد الدماغ في أكتوبر وأخذ اكيات.
- إصلاح وأغطية المقاطع للمجهر الفلوريسنس. تبلغ ذروة الإثارة EBD عند 470 و 540 نانومتر والانبعاثات ذروتها عند 680 نانومتر. Coverlip مع DAPI المتوسطة التركيب من أجل تصور المورفولوجيا الخلوية الشاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، ونحن نبرهن على أن التركيز على الموجات فوق الصوتية مع microbubbles يمكن أن تحفز فتح BBB المترجمة باستخدام المعلمات المحددة أعلاه مع كل من محول الغمر المنخفض الطاقة(الشكل 3)وFUS محول (الشكل 4). أولاً، في التجارب المبكرة، تم استهداف محول الغمر منخفض الطاقة إلى نصف الكرة الدماغي واحد إما الأمامي(الشكل 3b)أو الوسيط(الشكل 3a). ثم تم التضحية الحيوانات 2 ساعات في وقت لاحق مع perfusion(الشكل 3a)أو دون التسريب(الشكل 3b)و 10 ميكرومتر أقسام الدماغ المجمدة تم جمعها. وكان افتتاح FUS BBB واضحا من قبل autofluorescence EBD (الإثارة: 470 و 540 نانومتر، والانبعاثات: 680 نانومتر) في نصف الكرة الأرضية المستهدف (السهام البيضاء الشكل 3أ و 3b).
لقد وجدنا أنه من الأفضل أن تضخ الحيوانات لتصور واضح لفتح BBB مع EBD autofluorescence. ومع ذلك، لا يزال يمكن تصور فتح BBB دون تطهير الأوعية الدموية (الشكل 3b). يبدأ الامتصاص الخلوي والتطهير من EBD بعد افتتاح BBB في أقرب وقت 30 دقيقة بعد فتح BBB ويزيد أكثر من 24 ساعة37. لتقييم افتتاح BBB مع EBD autofluorescence، فمن الأفضل للتضحية الحيوان بين 15 دقيقة و 3 ساعات من فتح BBB. على الرغم من أن في نهاية المطاف، فإن وقت التضحية تعتمد على الوكيل الذي تم تسليمه. على سبيل المثال، في دراسة AAV، 3 أسابيع بعد فتح BBB والتسليم AAV(الشكل 5c)قد يكون من المناسب.
في التجارب اللاحقة، تم استهداف محول FUS إما إلى قرن آمون(الشكل 4أ-ج)أو القشرة القشرية الأمامية (ACC)(الشكل 4 d-f)وبالإضافة إلى EBD، تم حقن عامل التباين MRI gadobutrol (0.1 مل/كغ) IV للتحقق من فتح BBB المستهدف في الجسم الحي. الشكل 4b,ه إظهار تعزيز MRI التباين حيث دخلت تباين gadobutrol الأنسجة 1 ساعة بعد فتح BBB وحقن وكيل التباين. هذا التغيير التباين واضح عند مقارنة إلى prescans التصوير بالرنين المغناطيسي التي اتخذت قبل الإجراء فوس(الشكل 4a, d). ثم تم التضحية بالحيوانات عن طريق التسريب بعد 1.5 ساعة من فتح BBB وتم جمع 10 ميكرومتر من الاقطات الوريوية. EBD autofluorescence واضح في المناطق المستهدفة FUS مزيد من الإشارة إلى موقع فتح BBB (الشكل 4ج ، و). ويبرز هذا الشكل كيف يمكن أحياناً أن يكون من الصعب رؤية التباين بالرنين المغناطيسي (كما هو الحال في الفرق بين الشكل 4b والشكل 4e)؛ ولذلك، فمن المفيد لتأكيد فتح BBB مع التصور من لصناعة السيارات EBD كما هو الحال في ميكروجراف الفلوريس في الشكل 4f.
لتقييم ما إذا كان يمكن استخدام هذه التقنية لتسليم الجينات المستهدفة AAV9-hsyn-GFP وGadobutrol التباين تم حقن الرابع (تيتر: 1.32 × 1014 GC / مل, 0.05 مل / كجم) مباشرة بعد فتح BBB في الحصين. ثم تم تصوير الحيوان MR 30 دقيقة بعد افتتاح BBB وضحى بعد 3 أسابيع عن طريق التسريب. تم جمع 10 ميكرومترات اشعاعات اشعاعية للتصوير الفلوري للتعبير GFP. وكان افتتاح BBB واضحا من قبل تباين gadobutrol في الحصين الهدف (الشكل 5أ، ب). وبالإضافة إلى ذلك، تم تأكيد تسليم الجينات من قبل تعبير GFP في الحصين الهدف واضح من قبل الفلورسنس الأخضر(الشكل 5c). لاحظ أنه في هذه المرحلة EBD قد مسح بها ويتضح فقط في البطينين (الشكل 5c).
الشكل 1: FUS benchtop الإعداد. (a) FUS الإعداد بما في ذلك مهاي XYZ، أنبوب PVC قطرها 30 ملم لمرفق محول، والإطار ستيريو 3D المطبوعة، ومضخة التسريب. (ب)يتم وضع حد لنهاية الأنابيب البلاستيكية، ويتم إرفاق مغناطيس بها مع الإيبوكسي. (ج)يتم إرفاق آخر المغناطيس مطابقة إلى مركز أعلى من محول الطاقة العالية مع الايبوكسي. (د)بالإضافة إلى ذلك، يتم إرفاق مغناطيس آخر مطابق للمؤشر لإبطال المُوضع في أعلى ووسط التصوير بالرنين المغناطيسي. (ه) يتم استبدال المؤشر في نهاية المطاف مع محول الطاقة العالية وحمام مائي مقترن برأس الحيوان مع هلام الموجات فوق الصوتية. (و)يمكن إرفاق محول الغمر منخفض الطاقة إلى الأنابيب البلاستيكية مع مقطع محول 3D المطبوعة. (ز)لتحديد المواقع، يتم استبدال محول مع مؤشر 3D المطبوعة وموضع هو باطل في أعلى ووسط التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial. (ح) حامل الإطار المطبوع ثلاثي الأبعاد الثابت يسمح بإعادة الحيوان إلى نفس الوضع بعد التصوير بالرنين المغناطيسي إذا كانت هناك حاجة إلى علاجات متعددة FUS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إطار مجسم مع التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial لإحداثيات ارشاد التصوير بالرنين المغناطيسي. (أ)يتم وضع الحيوانات لأول مرة في إطار مجسم ثلاثي الأبعاد مطبوع مجهز بجهاز التصوير بالرنين المغناطيسي. (ب)ثم يتم وضع الإطار داخل سرير التصوير بالرنين المغناطيسي ويتم قياس المسافة من fiducial (دائرة منقط) إلى منطقة الدماغ المستهدفة باستخدام كل من الصور التاجية لقياسات الظهر /البطن (D/V) والصور المحورية لقياسات (R/C) ، يمكن جمعها من كلا المحورين. يتم الاحتفاظ بالحيوانات في الإطار ونقلها إلى محطة FUS حيث يتم استخدام مؤشر لإبطال موضع XYZ في موقع fiducial. ثم يتم استبدال المؤشر مع محول والتي يمكن نقلها بعد ذلك استناداً إلى الإحداثيات التي تم جمعها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صبغة زرقاء ايفانز (EBD) يؤكد FUS BBB فتح مع وبدون perfusion. (أ) ميكروجراف من 10 ميكرومتر قسم الدماغ 2 ساعة بعد فتح FUS BBB مع محول الغمر منخفضة الطاقة المستهدفة إلى نصف الكرة الأيسر الوسط. هذه هي صورة تمثيلية لحيوان تم ذبذبته بنسبة 4٪ من الـ فورمين قبل جمع الأنسجة. BBB افتتاح واضح من قبل EBD autofluorescence الحمراء (السهم). (ب)ميكروجراف من 10 ميكرومتر قسم الدماغ 2 ساعة بعد فتح FUS BBB المستهدفة إلى نصف الكرة الأيسر الأمامي. هذه هي صورة تمثيلية لحيوان لم يكن قد تم غرسه قبل جمع الأنسجة لذلك ، يبقى EBD في الأوعية الدموية. BBB افتتاح واضح حيث EBD قد تسربت من الأوعية الدموية (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: FUS BBB فتح أكد مع Gadobutrol MRI التباين والتعبير EBD. MR الصور قبل (أ و د) وبعد (ب و ه )BBB فتح. تحسين التباين gadobutrol يؤكد موقع BBB فتح في vivo(ب وه ،الأسهم). (ج) 10 ميكرومتر قسم الدماغ تظهر المزيد من تأكيد افتتاح BBB مع EBD autofluorescence (الأحمر) في قرن آمون (بلو DAPI وصمة عار النووية). شريط المقياس؛ 500 ميكرومتر (f) Micrograph من قسم الدماغ 10 ميكرومتر بعد افتتاح BBB في قشرة القشرة الأمامية الواضحة من قبل EBD red autofluorescence (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التسليم المترجم من AAV9-hsyn-GFP إلى قرن آمون عبر فتحة FUS BBB. MRI تأكيد فتح BBB مع عامل التباين MRI، تباين التصوير بالرنين المغناطيسي (الأسهم) في كل من الإكليلة (أ) ومحورية (ب) T1-الصور المرجحة. (ج)تأكيد الفسطولوجي للتعبير GFP في الحصين المستهدفة FUS (الأخضر) 3 أسابيع بعد فتح FUS BBB و AAV9-hsyn-GFP الحقن الرابع. الأزرق يشير إلى وصمة عار النووية DAPI لmorphology الخلوية الشاملة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وصفنا نهج benchtop لmicrobubble ساعد FUS BBB فتح مع نهج بديلة بما في ذلك، اثنين من محولات مختلفة وأساليب لاستهداف داخل الجمجمة مع وبدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي. حاليا، من أجل إنشاء التصوير بالرنين المغناطيسي الموجهة FUS BBB فتح في المختبر، وهناك خيار لشراء ممتازة جاهزة للاستخدام الأجهزة التي توفر نتائج موحدة للغاية وقابلة للتكرار مع واجهات سهلة الاستخدام. ومع ذلك، العديد من المختبرات غير مستعدة لتكلفة هذه الأدوات. ولذلك، فإن الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو توفير نقطة انطلاق يمكن لأي مختبر أن ينشئها من أجل بناء خبرتها في هذه التقنية.
FUS BBB فتح الآن تقنية تستخدم على نطاق واسع، وغالبا ما يكون الحال أن مجموعات مختلفة تستخدم مجموعة متنوعة من العوامل والتخدير، كل منها يمكن أن تؤثر على درجة من فتح BBB والبذخ. الأهم من ذلك، يمكن أن تؤثر على مخدر معين يستخدم على حجم فتح BBB لذلك من المهم أن تنظر في هذا عند تنفيذ هذا البروتوكول38. هنا ، يتم استخدام ايزوفلوران مخدر لأنه يمكن الحفاظ على الحيوانات تحت ايزوفلوران لطول البروتوكول ومستويات غاز ايزوفلوران يمكن تعديلها بسهولة على أساس معدل التنفس الحيواني ومعدل ضربات القلب. وبالإضافة إلى ذلك، قدمنا isoflurane مع الأكسجين لأنه كان أكثر سهولة من الهواء الطبي. ومع ذلك، قد الهواء الطبي تسمح أكثر شمولا BBB فتح39. بعض عوامل التباين MRI أكثر ملاءمة لهذا البروتوكول من الآخرين. على سبيل المثال، في أيدينا، لم ينتج gadoteridol أي تعزيز التباين حتى عندما كان تسرب EBD موجودًا بوضوح في الأنسجة بعد الوفاة. صياغة microbubble مهم أيضا. هنا نستخدم الميكروسفيرات الدهنية البيرفلورترين. تركيبات أخرى microbubble مثل بروتين perflutren نوع microbubbles متاحة بسهولة ، ولكن نوع من microbubble المستخدمة سوف تؤثر على النتائج15.
يمكن أن تختلف عناصر التحكم في مولدات الوظائف قليلاً جداً، لذا راجع الدليل للحصول على تعليمات حول كيفية إدخال الإعدادات المدرجة في الخطوة 1. الجهد المناسب الأمر (V الذروة إلى الذروة على مولد وظيفة) يعتمد بقوة على خصائص محول، مكاسب مكبر للصوت RF، مكبر للصوت RF لتطابق محول، وعمر وحجم الحيوان، ونوع microbubble والتركيز، وتأثير العلاج المطلوب. وسوف تحتاج ذروة إلى ذروة الخامس إلى أن تحدد عن طريق التجربة والخطأ. ابدأ بالإعدادات المقترحة في الخطوة 1 وحدد التأثير من الناحية النسيجية. إذا كان هناك تلف الأنسجة، وانخفاض الذروة إلى الذروة الخامس بنسبة 10٪ وحاول مرة أخرى. وبالمثل، إذا لم يكن هناك BBBO ثم رفع الذروة إلى ذروة الخامس بنسبة 10٪ وحاول مرة أخرى. وضع عالية جدا من V يمكن أن تلحق الضرر محول الغمر الطاقة المنخفضة. وهذا سيكون واضحا كتكسير أو تشويه للوجه محول. يمكن أن تكون المهلة التصنيعية على محولات ال الاتصالات طويلة ، لذلك عند البدء ، نقترح شراء أكثر من محول واحد كاحتياطي. يمكن أن تؤدي محولات الموجات فوق الصوتية أيضًا إلى تلف مكبرات الصوت إذا تمت مطابقته بشكل غير صحيح. للبساطة والموثوقية، نقترح استخدام مكبر طاقة قوي يمكنه دفع الأحمال المعقدة (مثل مكبر طاقة التردد اللاسلكي في جدول المواد). لاحظ أنه في حين أن محول الطاقة العالية يأتي مع دائرة مطابقة ، فإن محول الغمر المنخفض الطاقة لا. يمكن لمكبر الترددات اللاسلكية المقترح التعامل مع الطاقة المنعكة من محول الصوت غير المطابق، ولكن قد تتلف بعض مكبرات الصوت في هذا التكوين. أيضاً، إذا كان يثبت الخطوة 2.7 مشكوك بعد تثبيت برنامج التشغيل والبرامج، تحقق من أن المنفذ التسلسلي الصحيح المحدد في البرنامج. بعد ذلك حاول كابل تسلسلي مختلف. إذا فشل ذلك، ثم طلب دعم تكنولوجيا المعلومات المحلية.
من التجربة، وسوف يستغرق ممارسة وتعديلات متعددة لتحقيق دقة ضيقة في استهداف منطقة الدماغ. ويمكن ملاحظة ذلك في الاختلافات بين التجارب المبكرة(الشكل 3)والتجارب الأخيرة (الشكل 5). بدأنا التجارب باستخدام إطار استريو كلاسيكي وندرجه كخيار هنا إذا لم يكن هناك إمكانية الوصول إلى طابعة ثلاثية الأبعاد أو إذا لم يكن هناك إمكانية الوصول إلى التصوير بالرنين المغناطيسي القوارض. ومع ذلك، فإن توجيه MRI مع الـ MRI fiducials والإطار القابل للطباعة ثلاثي الأبعاد المقدم (أو التصميم المخصص) هو الطريقة المثالية. أولاً، إنها تمثل الاختلافات الفردية بين الحيوانات من خلال جمع الإحداثيات داخل الحيوان بدلاً من الاعتماد على أطلس متوسط لدماغ الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بتأكيد استهداف موقع FUS في الجسم الحي بدلاً من الاعتماد على تعبير EBD بعد الوفاة. وهذا أمر مهم عند تسليم وكلاء التي قد تتطلب أكثر من 24 ساعة نافذة المفعول مثل AAVs (الشكل 5). وأخيراً، فإن حامل الإطار المقدم يسمح بإعادة الحيوان إلى نفس الوضع بعد التصوير بالرنين المغناطيسي لإصلاح أي أخطاء استهداف أو لتكرار FUS بعد فتح BBB غير كاف دون الحاجة إلى إعادة الإحداثيات. يمكن استخدام الإطار المُستَرِمَي ثلاثي الأبعاد المحمول المطبوع في أي تصوير بالرنين المغناطيسي مع حمولة واضحة من 200 مم أو أوسع.
اعتمادا على توزيع الأوعية الدموية في الموقع المستهدف، سمك الجمجمة40،وجود البطينين، وغيرها من العوامل درجة فتح BBB يمكن أن تختلف. لهذا السبب، نحن نقدم طريقة لاستهداف المتكررة مع الإطار وحامل الإطار. تعتمد دقة الاستهداف بشكل حاسم على الحفاظ على تركيز محولات في موقع متناسق فيما يتعلق بمؤشر الاستهداف. يجب أن يشير طرف هذا المؤشر إلى الموقع في مساحة مركز تركيز محول عند إرفاق محول إلى موضع XYZ. المغناطيس يسمح المؤشر و محول أن يكون بسهولة مبادلة مع الحفاظ على هذا الكولوكية. يجب أن تتطابق الفتحة والنتوء في المغناطيس بأكبر قدر ممكن من الدقة. يقلل أي تغير في هذا الصدد تكرار استهداف التركيز FUS. ومع ذلك، سيكون هناك إزاحة مكانية بين رأس المؤشر والتركيز الموجات فوق الصوتية. بمجرد التأكد من أن الإزاحة متناسقة، يمكن تصحيحه باستخدام صور MR لحساب الفرق في مم من موقع افتتاح BBB الناتجة (موقع تباين التصوير بالرنين المغناطيسي) والموقع المستهدف المقصود. يمكن بعد ذلك أن يتم وضع هذا الاختلاف في الاعتبار في الموقع الخالي. كما تستفيد الدقة والتكرار بشكل كبير من استخدام نفس تردد الموجات فوق الصوتية واستخدام فئران ذات حجم وعمر متشابهين في مجموعة معينة من التجارب. الموجات فوق الصوتية التوهين من قبل الدماغ الفئران وجمجمة الفئران يختلف مع التردد وحجم الجمجمة وسمك الجمجمة يختلف مع التقدم في السن. الجمجمة هي أيضا تجويف صغير فيما يتعلق بنبض الموجات فوق الصوتية ويتفاعل التصوير بالموجات فوق الصوتية الحادث مع انعكاسات داخل الجمجمة لإنتاج حقل الصوت المعقد الذي يعتمد على الأنسجة والجمجمة والتردد وموقف محول40.
وكما ذكر في مواضع أخرى، فإن الغرض من هذا البروتوكول هو توفير بديل استثماري منخفض للحلول التجارية الممتازة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي والمتاحة بالفعل للشراء. هناك قيود هامة تنتج عن الحفاظ على انخفاض التكلفة. هناك أيضا قيود متأصلة في تقنية نظرا الفيزياء والدولة الراهنة للفن. ومن اللافت للنظر، على الرغم من هذه القيود، وكما هو مبين في النتائج التمثيلية، يمكننا تحقيق تسليم متسق من الأصباغ والجسيمات والفيروسات إلى قرن آمون من الفئران مع دقة دون الذرية. أهم القيود هي أن (1) شكل التركيز FUS يعتمد على الأنسجة المتدخلة وخاصة شكل وسمك الجمجمة{...}. إن الحاجة إلى إزالة الحيوان من التصوير بالرنين المغناطيسي لإجراء علاج FUS تمنع الملاحظات في الوقت الفعلي على تعريب وكثافة تركيز FUS. بدون هذه الملاحظات في الوقت الحقيقي هناك العديد من التجارب التي يجب القيام بها لتأكيد الإعداد لكل مجموعة من مواقع الاستهداف. مرة واحدة يتم "طلب الإعدادات في"، وجدنا تكرار جيدة. (2) وXYZ تحديد المواقع ونظام fiducial كما شيدت ، في حين أن دقيقة ، لا توفر الدقة في إطار الإحداثيات من وضعية من تجربة إلى تجربة. يمكن أن تنتقل المواقع النسبية لمنزل XYZ وجمجمة القوارض والإطار مع بعضها البعض من تجربة إلى تجربة. وهذا منتهى باستخدام صورة التصوير بالرنين المغناطيسي لاستهداف، ومؤشر استهداف وfiducial مع موقع معروف في الفضاء بالنسبة للتركيز FUS، وضمان نظام إحداثيات التصوير بالرنين المغناطيسي موازية لنظام وضعية XYZ، عن طريق القيام بعلاجات الاختبار قبل مجموعة من العلاجات الحقيقية وعن طريق القيام الإجراء بأكمله في جلسة واحدة بحيث لا تحتاج إلى إعادة وضع الحيوان في الإطار. لاحظ أنه، لأنه يتم استخدام fiducial واحد فقط، تناوب الإطار غير قابلة للتصحيح، لذلك فمن الأهمية بمكان لضمان أن الإطار هو مستوى فيما يتعلق السرير التصوير بالرنين المغناطيسي وتحمل. باختصار، موقع المؤشر لا يشير إلى التركيز FUS الحقيقي، ولكن وجدنا أن الإزاحة متسقة لموقع معين في الدماغ شريطة عدم تدوير الجمجمة نسبة إلى محول الموجات فوق الصوتية. لاحظ أيضا أن توقيت ثابت من التسليم gadobutrol نسبة إلى افتتاح BBB والتصوير أمر بالغ الأهمية لنتائج متسقة خاصة إذا تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي على النقيض من تغيير وكيل لكمية فتح BBB (انظر 36).
بدأنا أولا FUS BBB فتح في المختبر مع محول الغمر منخفضة الطاقة المذكورة أعلاه. وجدنا أنه خيار بأسعار معقولة للبدء مع هذه التقنية. الأهم من ذلك، يمكن أن التكيف من هذا البروتوكول توفير بديل غير الباضع لجراحة استريو تكسينية داخل الجمجمة والبحوث قبل الإكلينيكية التي أجريت مع هذه التقنية يمكن أن تعتبر ترجمة للغاية نظرا للاستخدام الحالي لFUS عبر الجمجمة في البشر30،32،41. بمجرد تأسيسها في المختبر، يمكن استخدام هذه التقنية كبديل غير جراحي لجراحة الإكساكسي. وبالتالي، تحويل أداة التحقيق بدقة إلى أداة ترجمة عالية. سوف يستخدم مختبرنا هذه التقنية للتصوير بالرنين المغناطيسي الموجه، والتسليم المترجم للفيروسات والجسيمات النانوية لتطوير تقنيات تعديل عصبي جديدة وغير غازية يمكن استخدامها في التصرف بحرية القوارض اليقظة والرئيسيات غير البشرية. يركز العمل الحالي على مصمم المخدرات المصممة حصرا لمستقبلات مصمم (DREADDs) وتوعية الخلايا العصبية لجرعات منخفضة من الجسيمات عالية الطاقة مثل الأشعة السينية. كما يعمل المختبر على إصدار جديد من هذا البروتوكول يمكن إجراؤه في ماسح ضوئي بشري 3 T للقضاء على الحاجة إلى نقل الحيوان أثناء العلاج والسماح لردود الفعل في الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل منحة البنية التحتية للبحوث EPSCoR NSF لجامعة كليمسون (1632881). بالإضافة إلى ذلك، تم دعم هذا البحث جزئيًا من قبل مركز سيفيتان الدولي للأبحاث، برمنغهام، AL. الكتاب الاعتراف بامتنان استخدام الخدمات والمرافق من جامعة ألاباما في برمنغهام الصغيرة الحيوانات تصوير مرفق منحة المشتركة [المعاهد الوطنية للصحة P30 CA013148]. ويعترف أصحاب البلاغ راجيف شوبرا بدعمه وتوجيهه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
- Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
