Summary
Questo protocollo descrive un modello di infezione da Aspergillus nelle larve di zebrafish. Le spore di Aspergillus vengono microiniettate nel cervello posteriore delle larve e il trattamento chimico viene utilizzato per indurre l'immunosoppressione. La progressione dell'infezione viene monitorata tramite una configurazione giornaliera dell'imaging per monitorare la crescita fungina e le risposte immunitarie, nonché l'enumerazione delle spore vive mediante placcatura dell'unità di formazione della colonia.
Abstract
L'aspergillosi invasiva (IA) è una delle infezioni fungine più comuni tra gli individui immunocompro compromessi. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, L'IA può causare > 50% nei pazienti immunocomprotiti infetti. È fondamentale determinare sia i fattori ospiti che patogeni che contribuiscono alla suscettibilità alle infezioni e ai bassi tassi di sopravvivenza nei pazienti infetti al fine di sviluppare nuove terapie. Le risposte immunitarie innate giocano un ruolo fondamentale nel riconoscimento e nella clearance delle spore di Aspergillus, anche se poco si sa dei meccanismi cellulari e molecolari esatti. Sono necessari modelli affidabili per indagare le interazioni meccaniche dettagliate tra l'ospite e l'agente patogeno. La chiarezza ottica e la trattabilità genetica delle larve di zebrafish le rendono un modello intrigante per studiare le interazioni ospite-patogeno di infezioni batteriche e fungine umane multiple in un ospite vivo e intatto. Questo protocollo descrive un modello di infezione larvale del pesce zebra Aspergillus. In primo luogo, le spore di Aspergillus vengono isolate e iniettate nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore del pesce zebra tramite microiniezione. Quindi, gli inibitori chimici come i farmaci immunosoppressivi vengono aggiunti direttamente all'acqua larvale. Vengono descritti due metodi per monitorare l'infezione nelle larve iniettate, tra cui l'omogeneizzazione 1) delle larve per l'enumerazione dell'unità di formazione della colonia (CFU) e 2) una configurazione di imaging dal vivo ripetuta e giornaliera. Nel complesso, queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare meccanicamente la progressione dell'infezione da Aspergillus in vivo e possono essere applicate a diversi background ospiti e ceppi di Aspergillus per interrogare le interazioni ospite-patogeno.
Introduction
Aspergillus fumigatus è un onnipresente fungo saprofita e le sue spore trasportate dall'aria possono essere trovate sia all'interno che all'esterno1. Queste spore vengono inalato da tutti ma vengono efficacemente liberate dai polmoni degli individui immunocompetenti1,2. Tuttavia, le persone con condizioni polmonari alterate come la fibrosi cistica possono sviluppare aspergillosi broncopolmonare a causa della germinazione fungina nei polmoni3. La forma più grave di questa infezione, l'aspergillosi invasiva (IA), colpisce gli individui immunocompro compromessi e comporta la crescita del fungoin altri organi 2,3. L'IA > il 50% di morte di pazienti infetti nonostante la disponibilità di terapie antifungine4. Negli individui immunocompetenti, le risposte immunitarie innate svolgono un ruolo importante nello sgombero delle spore inalato1. Tuttavia, i meccanismi specifici che contribuiscono a questa innata clearance immunitaria non sono ben compresi. È importante comprendere i meccanismi cellulari e molecolari delle principali cellule immunitarie innate (cioè macrofagi e neutrofili) nella clearance di Aspergillus al fine di trovare nuove strategie terapeutiche per l'IA.
Mentre i modelli di mammiferi sono stati fondamentali per identificare i fattori di virulenza fungina e le risposte immunitarie dell'ospite5,6, l'accessibilità visiva è limitata per le interazioni ospite-patogeno a livello cellulare. Gli esperimenti di coltura tissutale non possono riassumere completamente il complesso ambiente multicellulare e le interazioni esistenti in interianimali 7. Pertanto, zebrafish ha guadagnato popolarità come organismo modello alternativo per colmare questa lacuna e facilitare lo studio delle interazioni ospite-patogeno in un ospite vivo e intatto attraverso un'infezione di piùgiorni 8,9. Il sistema immunitario innato zebrafish si sviluppa già 24 ore dopo la fecondazione (HPF)10e il sistema adattivo impiega 4-6 settimane per svilupparsi11, fornendo una finestra di tempo in cui le risposte immunitarie innate possono essere valutate isolatamente. Le risposte immunitarie innate sono ben conservate tra gli esseri umani e il pesce zebra11. Gli zebrafish hanno molte qualità che facilitano lo studio di queste risposte, tra cui la chiarezza ottica (che consente l'imaging dal vivo ad alta risoluzione di ospiti intatti) e la trattabilità genetica (che facilita gli studi meccanicistici molecolari).
Il modello di infezione larvale del pesce zebra Aspergillus descritto qui è stato originariamente sviluppato da Knox etal. Recentemente è stato ampliato dal nostro gruppo e da altri per indagare i meccanismi immunitari ospiti12,13,interazioni ospite-patogeno13,14,15,meccanismi di immunosoppressione13,16,17,virulenzafungina 18e efficacia del farmaco antifungino19,20. Questo modello riassume molteplici aspetti dell'aspergillosi umana. Mentre le larve immunocompetenti sono resistenti, le larve immunocomprotte possono soccombereall'infezione 12,13,16,17.
In questo modello, un'infezione localizzata viene stabilita iniettando spore nel ventricolo posteriore della larva, un'area meno popolata di fagociti e il reclutamento e il comportamento dei fagocitipossono essere valutati 12,13. Si ritiene che i macrofagi agiscano come la prima linea di difesa contro le spore di Aspergillus negliesseri umani 1 e i modelli di mammiferi6,21. Allo stesso modo, nel modello zebrafish, i macrofagi vengono reclutati nelle spore di Aspergillus iniettate, mentre i neutrofili vengono reclutati secondariamente in risposta alla crescita ifale12,13,22. Da questo modello, è stato anche appreso che Aspergillus può persistere nelle larve immunocompetenti di tipo selvatico dopo più di 7 giorni di infezione. Inoltre, l'intero decorso dell'infezione può essere seguito negli stessi animali vivi dall'imaging confocale quotidiano.
Questo protocollo descrive la tecnica della microiniezione per iniettare spore nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore di 2 giorni dopo la fecondazione (2 dpf) larve. L'infezione viene quindi monitorata per un massimo di 7 giorni, poiché le larve di zebrafish possono vivere fino a 10 dpf senza nutrirsi. L'immunosoppressione può essere indotta dal trattamento farmacologico e viene descritta anche l'applicazione di farmaci alle larve. Infine, vengono descritti due metodi per seguire la progressione dell'infezione, tra cui la quantificazione dei CFC da singole larve e una configurazione giornaliera di imaging dal vivo.
Protocol
I ricercatori dovrebbero ottenere l'approvazione per tutti gli esperimenti sugli animali dai comitati competenti per la cura e l'uso degli animali. I dati rappresentativi mostrati in questo articolo provengono da esperimenti eseguiti nell'ambito di protocolli approvati dal Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Preparazione di spore di Aspergillus per iniezione
- Da una sospensione della spora di Aspergillus, calcolare il volume necessario per ottenere 1 x 106 spore. Il volume dovrebbe essere di 20-100 μL; in caso di no, produrre una diluizione 10x nello 0,01% (v/v) sterile Tween-20 (Tween-water; Tabella dei materiali). Ad esempio, se il volume calcolato è di 5 μL, produrre una diluizione 10x e utilizzare 50 μL della soluzione diluita.
NOTA: Due piastre/ceppo possono essere preparati per raccogliere più spore o come ricambio in caso di contaminazione. - Stendere 1 x 106sporedi Aspergillus su una piastra di supporto minimo di glucosio (GMM)(Table of Materials)con uno spargitore sterile monouso a forma di L in un armadio di biosicurezza. Evitare di diffondersi a margine della piastra. Incubare a 37 °C per 3-4 giorni, con la piastra rivolta a testa in giù.
- Il giorno della raccolta, portare nell'armadio della biosicurezza guanti sterili e tubi conici da 50 ml (due per ceppo), bottiglie fresche di acqua tween sterile (una per ceppo) e diffusori sterili monouso a forma di L.
NOTA: Miracloth può essere tagliato in ~ 8 in x 6 in pezzi, avvolto in un foglio e autoclavato per sterilizzare. - Posizionare un pezzo di miracloth in ogni tubo conico e ri-cappuccio etichettati da 50 ml. Tosci il pacchetto miracloth rimanente dal cofano.
- Portare le lastre nell'armadio per la biosicurezza. Aprire una piastra, quindi versare l'acqua Tween sulla parte superiore per coprire circa tre quarti del piatto.
- Utilizzando uno spargitore monouso a forma di L, raschiare delicatamente la superficie della coltura fungina con un movimento avanti e indietro, mentre si utilizza l'altra mano per ruotare la piastra. Raschiare fino a quando quasi tutte le spore sono omogeneizzate nell'acqua di Interpolazione.
NOTA: A causa dell'elevata idrofobicità, le spore possono creare "sbuffi" quando viene aggiunta acqua Tween o durante la raschiatura. Si dovrebbe fare molta attenzione per evitare la contaminazione di tubi o piastre vicini. Si consiglia di cambiare i guanti e pulire la superficie con il 70% di etanolo tra l'estrazione di diversi ceppi. - Prendi un tubo conico da 50 ml e rimuovi il pezzo di miracloth. Piegarlo a metà e renderlo in un filtro inserito nella parte superiore del tubo conico da 50 ml.
- Versare l'omogeneato fungino dalla piastra sopra il miracloth nel tubo.
NOTA: Se vengono preparate due piastre di un ceppo, raschiare entrambe le piastre e versarle nello stesso tubo conico. - Versare l'acqua tween per portare il volume totale nel tubo conico a 50 mL.
- Girare a 900 x g per 10 minuti. Assicurarsi di utilizzare tappi anti aerosolizzazione nella centrifuga.
- Versare il supernatante in una soluzione di candeggina al ~10% per decontaminare. Versare 50 ml di PBS sterile 1x nel tubo conico, quindi vortice o shake per rimorsi il pellet.
- Girare di nuovo a 900 x g per 10 minuti. Versare il supernatante e rimescolare il pellet in 5 mL di PBS sterile 1x. Filtrare attraverso un nuovo pezzo di miracloth in un tubo conico fresco da 50 ml.
- Effettuare diluizioni seriali 10 volte (10x, 100x, 1000x) dell'omogeneato fungino in tubi di centrifuga da 1,7 ml (ad esempio, per la soluzione 10x, mescolare 100 μL dell'omogeneato fungino con 900 μL di Interpol-acqua).
- Scegliete la prima diluizione in cui le spore non sono visibili quando vengono scaricate in Tween-water e usate questa diluizione per contare il numero di spore usando un emocitometro.
- Calcolare la concentrazione di spore nell'omogeneato fungino preparato (sospensione dell'acqua) utilizzando la seguente formula:
Concentrazione (spore/mL) = Numero di spore nel mezzo 25 scatole x fattore di diluizione x 104 - Preparare uno stock di 1 ml di 1,5 x 108 spore/ml in 1x PBS sterile in un tubo di microcentrifugo da 1,7 ml. Questa preparazione di spore può essere conservata a 4 °C per ~ 4 settimane.
- Prima dell'uso in iniezioni, mescolare 20 μL della preparazione delle spore con 10 μL di 1% di rosso fenolo sterile in un tubo di centrifuga da 1,7 ml per ottenere una concentrazione finale di spore di 1 x 108 spore/ml. Vortice accuratamente prima dell'iniezione.
NOTA: La soluzione rosso fenolo all'1% deve essere sterilizzata con filtro e conservata in aliquote. - Per una finta iniezione, mescolare 20 μL di 1x PBS con 10 μL di 1% di rosso fenolo sterile.
2. Preparazione di piastre di agar per iniezione
- Preparare il 2% di agarosio in mezzo E3 e sciogliere in un forno a microonde.
- Versare in una piastra di Petri da 100 mm x 15 mm (~ 25 mL per piastra), ruotare per coprire la piastra in modo uniforme e lasciare raffreddare.
- Avvolgere il piatto con pellicola di paraffina e conservare invertito a 4 °C.
- Prima dell'iniezione, portare la piastra a temperatura ambiente (RT).
- Versare ~1 mL di filtro sterilizzato al 2% di albumina di siero bovino (BSA) sulla piastra, inclinare la piastra per stendere e coprire l'intero fondo e risciacquare con E3.
NOTA: La soluzione di BSA al 2% può essere sterilizzata con filtro e conservata come aliquote da 1 mL a -20 °C. Il pretrattamento BSA al 2% impedisce alle larve di attaccarsi alla superficie dell'agarosio. - Versare E3 con tricaina tamponata sulla piastra e lasciarla riposare fino all'iniezione.
3. Larva di zebrafish retrobrain ventricolo microiniezione
- Dechorionare manualmente le larve con forcep a 2 dpf in una piastra di Petri.
NOTA: La dechorionation può essere eseguita in qualsiasi momento da 1,5 dpf fino al momento dell'iniezione. - Rimuovere il più E3 possibile dalla piastra di Petri e aggiungere 300 μg/mL di tricaina tamponata in E3 per anestetizzare le larve.
NOTA: Una soluzione stock di tricaina tamponata da 4 mg/mL in E3 può essere preparata e conservata a 4 °C. La soluzione di lavoro può essere effettuata diluire 4 mL della soluzione di magazzino fino a 50 mL con E3. - Utilizzare una configurazione di microiniezione fornita con l'iniettore di pressione, l'unità di controtezione, il interruttore a pedale, il supporto in micropipetta, il micromanipolatore e un supporto magnetico e una piastra, il tutto collegato a una fonte diaria compressa (Tabella dei materiali).
- Aprire la valvola ad aria compressa e accendere il microiniettore. Impostare la pressione su ~25 PSI, durata dell'impulso su 60 ms e unità di contropressione su 1 PSI.
- Caricare un ago di microiniezione utilizzando una punta di pipetta microloader(Table of Materials)con circa 3-5 μL di PBS preparato o sospensione di spore con rosso fenolo. Montare l'ago sul micromanipolatore.
NOTA: Gli aghi di microiniezione possono essere preparati come descritto inprecedenza 23. Il microscopio stereo utilizzato per le microiniezioni dovrebbe avere un reticolo per oculare per calibrare l'ago di microiniezione. Il reticolo deve essere calibrato con un micrometro a stadio e deve essere determinata la lunghezza della scala del reticolo (μm). Il diametro della caduta della sospensione della spora che espelle dall'ago viene misurato a seconda del numero di hascisc (del reticolo) che si sovrappongono alla caduta. - Posizionare il micromanipolatore in modo che l'estremità dell'ago sia in vista all'ingrandimento più basso al microscopio stereo. Ingrandisci fino a 4 volte l'ingrandimento, tenendo l'ago in vista.
- Utilizzando pini affilati, ritagliare l'estremità dell'ago. Premere il pedale di iniezione per visualizzare le dimensioni della goccia che esce. Continuare a ritagliare fino a quando ~3 nL di sospensione spore viene iniettato (qui, questo è cinque hascisc).
- Spostare il micromanipolatore e l'ago fuori strada per evitare di colpire accidentalmente l'ago mentre le larve sono disposte sulla piastra di iniezione.
- Versare E3-Tricaine dalla piastra di iniezione, quindi trasferire ~24 larve anestetizzate sulla piastra di iniezione con il meno E3 possibile utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Utilizzando un piccolo strumento per manipolare le larve di zebrafish (ad esempio, strumento ad anello per capelli o strumento ciglia), disporre le larve in base alla direzione in cui si trovano di fronte. In particolare, posiziona tutto rivolto a destra in una riga e tutto rivolto a sinistra in una riga sottostante.
NOTA: Questa disposizione è difficile se c'è troppo liquido sul piatto, poiché le larve "galleggiano" fuori posto. Tuttavia, troppo poco liquido è anche problematico se le iniezioni durano molto tempo, poiché le larve possono asciugarsi o l'anestesia svanisce. Pertanto, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla quantità di liquido sulla piastra durante l'intero processo di microiniezione. - Regolare lo zoom del microscopio all'ingrandimento più basso. Riportare il micromanipolatore indietro e disporre in modo che l'ago sia vicino alle larve, con un angolo di ~ 30 ° -60 °, nel mezzo del campo visivo.
- Ingrandire fino all'ingrandimento più alto e utilizzare manopole di regolazione fine per regolare ulteriormente la posizione dell'ago. Verificare che ~30-70 spore escono dall'ago iniettando la sospensione di spore nel liquido sul piatto accanto alle larve. Regolare il tempo e la pressione sulla configurazione dell'iniezione, se necessario.
NOTA: Questo test deve essere ripetuto dopo ogni cinque o sei larve, poiché il numero di spore che escono dall'ago può aumentare o diminuire nel tempo. - A partire dalla fila in cui le larve sono rivolte verso l'ago, spostare il piatto in modo che l'ago sia direttamente sopra e posizionato vicino alle prime larve.
- Spostando l'ago con il micromanipolatore, inserire l'ago attraverso il tessuto intorno alla vescicola otica per perforare nel ventricolo del cervello posteriore. Spostare il piatto con l'altra mano se necessario per ottenere il giusto orientamento della larva con l'angolo dell'ago.
- Verificare visivamente che l'estremità dell'ago si trova al centro del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore, premere il pedale per iniettare spore e ritrarre delicatamente l'ago.
NOTA: Il colorante rosso fenolo deve rimanere principalmente all'interno del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore. Una piccola quantità può andare nel cervello medio, ma non dovrebbe raggiungere il forebrain o al di fuori del cervello. In tal caso, il volume iniettato è troppo grande e la pressione e il tempo dovrebbero essere diminuiti di conseguenza o un nuovo ago dovrebbe essere calibrato. - Spostandosi lungo il piatto, iniettare tutte le larve in quella fila. Quindi, gira il piatto e inietta tutte le larve nell'altra fila.
NOTA: Le larve iniettate o danneggiate accidentalmente possono essere contrassegnate da 1) iniettando nel tuorlo un paio di volte per creare un segno rosso o 2) trascinando la larva fuori dalla fila con l'ago. - Sposta di nuovo l'ago su e fuori strada. Eseguire lo zoom indietro a un ingrandimento inferiore al microscopio. Il colorante rosso fenolo dovrebbe essere ancora visibile nel cervello posteriore di ogni larva.
- In primo luogo, tirare via con lo strumento ad anello per capelli e pipetta fino a smaltire eventuali larve con iniezioni non riusciti. Trasferire le larve rimanenti in una nuova piastra di Petri lavandole dal piatto con E3 sterile fresco e una pipetta di trasferimento.
- Ripetere se necessario per il numero di campione sperimentale finale desiderato.
- Risciacquare le larve almeno 2 volte con E3 e garantire il recupero dall'anestesia.
- Per quantificare la sopravvivenza senza ulteriori trattamenti, utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire le larve in una piastra di 96 po '(1 larva per pozzo) in E3.
4. Determinazione del numero di spore iniettato e vitale
- Immediatamente dopo l'iniezione, utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere casualmente circa otto delle larve iniettate e trasferirle in tubi di centrifuga da 1,7 ml (una larva per tubo).
- Eutanasia le larve con tricaina o posizionandole a 4 °C per 0,5-2,0 h.
- Preparare 1 mL di 1 mg/mL di ampicillina e 0,5 mg/mL di soluzioni antibiotiche di kanamicina in 1x PBS sterile. La soluzione avanzi può essere conservata a 4 °C e utilizzata in seguito.
NOTA: Le soluzioni stock di ampicillina a 100 mg/mL e kanamicina 50 mg/mL possono essere prefabbrezzate, sterilizzate con filtri e conservate in aliquote a -20 °C. Diluire questi 100x in 1x PBS per ottenere la soluzione di lavoro. - Utilizzando una pipetta, rimuovere il più liquido possibile dal tubo di centrifuga, lasciando la larva alle spalle e aggiungere 90 μL del PBS 1x con antibiotici.
NOTA: Gli antibiotici sono usati per prevenire la crescita batterica nelle piastre GMM che possono interferire con il conteggio delle colonie di Aspergillus. - Omogeneizzare le larve in un litoro tissutale a 1.800 oscillazioni/min (30 Hz) per 6 min. Spin down a 17.000 x g per 30 s.
- Etichetta le piastre GMM (una piastra per larve omogeneizzate). Utilizzando un bruciatore Bunsen per creare un ambiente sterile, pipettare la sospensione omogeneizzata da un tubo al centro della piastra GMM, quindi diffondersi utilizzando uno spargitore monouso a forma di L. Evitare di stepolare l'omogeneato contro il bordo.
- Incubare le piastre capovolte a 37 °C per 2-3 giorni e contare il numero di colonie formate (CFU).
- Per misurare il numero di spore vive durante il periodo di infezione, raccogliere le larve dalla piastra del pozzo 96 a 1-7 giorni dopo l'iniezione (dpi) e trasferirle in tubi di centrifuga. Eutanasia e omogeneizzazione delle larve da diffondere sulle placche GMM come descritto nei passaggi 4.1-4.5.
5. Trattamento farmacologico delle larve iniettate
- Dopo la sezione 4, dividere le larve iniettate rimanenti in due piatti da 3,5 mm: uno per il trattamento farmacologico e uno per il controllo. Utilizzare circa 24 larve infette per condizione.
NOTA: I piatti da 3,5 mm possono essere trattati con latte secco non grasso al 2% in acqua, risciacquato, asciugato all'aria e conservato in anticipo a RT. Il rivestimento con latte impedirà alle larve di attaccarsi alla plastica. - Preparare la soluzione di farmaco desiderata e il veicolo in E3 senza blu di metilene in tubi conici in base alla concentrazione finale richiesta, quindi mescolare bene. Ad esempio, per monitorare la sopravvivenza delle larve esposte al desametasone, utilizzare 24 larve (repliche) per il desametasone e 24 per il controllo del veicolo, come DMSO. Preparare 5 mL della soluzione farmacologica alla concentrazione richiesta. Qui sono stati utilizzati 5 mL dello 0,1% DMSO e 10 μM di desametasone e 24 larve / condizioni sono state trasferite a ~ 200 μL della soluzione veicolo / farmaco / larve.
- Rimuovere il più liquido possibile da un piatto con una pipetta di trasferimento e aggiungere E3 premiscelato contenente il controllo del veicolo. Ripetere con premiscele E3 contenente il trattamento di interesse per l'altro piatto.
- Usando una pipetta, trasferire le larve in 96 piastra del pozzo (una larva per pozzo). Monitorare la sopravvivenza delle larve iniettate esposte al veicolo o al farmaco per 7 giorni.
NOTA: Il farmaco può essere applicato esclusivamente il giorno dell'infezione e tenuto sulle larve per l'intero esperimento o può essere rinfrescato ogni giorno.
6. Imaging giornaliero di larve infette utilizzando il dispositivo di wounding e intrappolamento zebrafish per la crescita e l'imaging (zWEDGI)
- Assicurarsi che le larve siano trattate con 100 μM N-fenilthiourea (PTU) a 24 hpf per prevenire la pigmentazione e che la PTU sia mantenuta sulle larve per l'intero esperimento.
NOTA: PTU a 75-100 μM previene la pigmentazione delle larve senza difetti di sviluppo lordo24. Tuttavia, la PTU può interferire con alcuni processi biologici25e i ricercatori dovrebbero determinare in anticipo se il farmaco può influenzare eventuali processi in esame. - Infettare le larve transgeniche con popolazioni cellulari etichettate di interesse a 2 dpf con spore di Aspergillus progettate per esprimere una proteina fluorescente, come descritto nella sezione 3. Quindi, trasferire larve infette in pozzi di una piastra di 48 po 'in circa 500 μL / pozzo di E3 senza blu metilene.
NOTA: Qui viene utilizzata una piastra di 48 pozza, perché è più facile trasferire le larve dentro e fuori durante l'imaging quotidiano ripetuto. - Il giorno dell'imaging, preparare due piastre di Petri da 3,5 mm: una con PTU da 100 μM e una con E3-tricaina.
- Aggiungere E3-tricaine nelle camere di un dispositivo zWEDGI26,27. Al microscopio stereo, rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di contenimento utilizzando una micropipetta P100. Rimuovere tutta l'E3-tricaina in eccesso, in modo che sia solo nelle camere.
- Pipettare una larva dalla piastra usando una pipetta di trasferimento. Se viene utilizzato molto liquido per rimuoverlo, pipettare in un piatto da 3,5 mm contenente E3-PTU. Quindi, pipettare di nuovo, usando il meno liquido possibile, e trasferire in E3-tricaina.
- Attendere ~30 s per l'anestesia, quindi trasferire nella camera di carico del dispositivo di mento e intrappolamento (ad esempio, zWEDGI).
- Al microscopio stereo, posizionare la larva. Utilizzare la micropipetta P100 per rimuovere l'E3-tricaina dalla camera di wounding e rilasciarlo nella camera di carico per spostare la coda della larva nel canale di restrizione. Assicurarsi che la larva sia posizionata sul lato laterale, dorsale o dorso-laterale, in modo che il cervello posteriore possa essere immaginato con una lente obiettiva invertita.
- Larva dell'immagine con un microscopio confocale.
- Dopo l'imaging, con la pipetta P100, rilasciare E3-tricaina nella camera di uscita per spingere la larva dal canale di contenimento nella camera di carico.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere la larva e trasferirla di nuovo nella piastra di Petri con E3-Tricaine. Utilizzando il meno liquido possibile, trasferirlo nella piastra di Petri con E3-PTU. Risciacquare in PTU e ritrasferimento nella piastra del pozzo 48.
Representative Results
Dopo la microiniezione delle spore di Aspergillus nel cervello posteriore delle larve di zebrafish, il risultato dell'infezione può essere seguito da molteplici test, tra cui sopravvivenza, CFC e imaging dal vivo. In un test di sopravvivenza, il numero di larve infette sopravvissute a 1-7 dpi è stato monitorato. Quando le larve di tipo selvatico non sono state trattate, è stata osservata pochissima morte, con ~80%-100% delle larve sopravvissute all'intero esperimento (Figura 1). Se le larve sono state immunosoppresse, ad esempio per esposizione al farmaco corticosteroideo desametasone (10 μM), è stata osservata una significativa diminuzione dellasopravvivenza (figura 1).
Quando i CFC sono stati quantificati durante l'esperimento di 7 giorni da larve di tipo selvatico infettate da spore di A. fumigatus, è stata osservata la persistenza delle spore, con lenta clearance nel tempo(Figura 2A). Il numero di spore sopravvissute a 1, 2, 3, 5 e 7 dpi è stato normalizzato in base al numero di spore iniettate a 0 dpi per confrontare la persistenza e la clearance tra repliche (Figura 2B).
Linee di pesci transgeniche che esprimono proteine fluorescenti nei leucociti insieme a spore aspergillus che esprimono proteine fluorescenti possono essere utilizzate per visualizzare sia il reclutamento e il comportamento dei leucociti, sia la germinazione fungina e lacrescita 13. Quando i macrofagi sono stati etichettati (ad esempio, Tg(mpeg1:H2B-GFP)), il clustering di macrofagi in ~ 50% delle larve è stato tipicamente osservato, a partire da 2-3 dpi (Figura 3A). Il reclutamento di neutrofili (Tg,lyz:BFP)è stato in genere ritardato, verificandosi principalmente dopo che si è verificata la germinazione fungina (Figura 3A). Mentre il carico fungino persisteva per l'intero esperimento nella maggior parte delle larve (figura 3A), è stata osservata la clearance(figura 3B). In alcune larve, il peso fungino al di fuori del cervello posteriore è stato osservato anche più tardi nell'infezione, a causa della diffusione fungina, probabilmente nei macrofagi.
L'area intorno alla vescicola otica è un luogo possibile in cui è possibile trovare questa diffusione(figura 3C). Queste osservazioni sono state quantificate in più singole larve nel corso dell'intero esperimento(figura 4). Tipicamente, la germinazione è stata osservata in ~ 60% delle larve di 5 dpi(Figura 4A). L'area del cluster di fagociti, il reclutamento di macrofagi e il reclutamento di neutrofili variano sia nel tempo che tra le larve, con alcune tendenze in aumento durante l'esperimento e alcune che si risoluno nel tempo(Figura 4B,C,D).
Figura 1: Analisi rappresentativa della sopravvivenza delle larve infette. Le larve infettate da Aspergillussono state esposte al controllo del veicolo (DMSO) o al desametasone (Dex), e la sopravvivenza è stata monitorata. I dati rappresentano tre repliche in pool. CFU a iniezione media: DMSO = 30, Dex = 29 (il rapporto p-valore e rischio sono stati calcolati dall'analisi di regressione proporzionale del rischio cox, ****p < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conteggi rappresentativi della CFU da singole larve infette immediatamente dopo l'iniezione (0 dpi) e durante il corso di infezione (2, 3, 5 e 7 dpi). Otto larve infette sono state omogeneizzate e placcate per contare la CFU per ogni punto di tempo e replicarsi. (A) Dati di esempio da una replica. Ogni punto rappresenta una larva, le barre rappresentano i mezzi per ogni punto di tempo. (B) I conteggi CFU sono stati normalizzati al conteggio CFU a 0 dpi per ogni replica e sono state raggruppate tre repliche. I dati sono stati confrontati tra le condizioni sperimentali utilizzando l'analisi della varianza e riassunti in termini di mezzi marginali stimati ed errori standard. Gli Asterix rappresentano una significatività statistica rispetto alla CFU a 0 dpi (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative degli esperimenti di infezione. Le larve trattate con PTU con macrofagi fluorescenti (mpeg1:H2B-GFP) e neutrofili (lyz:BFP) sono state iniettate con A. fumigatus che esprimeRFP. Le larve vive e infette sono state immagini ripetutamente a 2, 3 e 5 dpi su un microscopio confocale. Vengono visualizzate le immagini di proiezione Z di massima intensità. Gli schemi delle larve indicano la posizione dell'imaging per ogni pannello. Tutte le barre di scala rappresentano 100 μm, ad eccezione delle barre di scala inserte, che sono 25 μm. (A) Le immagini mostrate provengono da una singola larva presa a 2, 3 e 5 dpi, che rappresenta una tipica progressione dell'infezione. Gli inserti mostrano germinazione fungina ai giorni 3 e 5. (B) Immagine rappresentativa del sottoinsieme di larve in grado di cancellare l'infezione, con basso carico fungino e non molta infiammazione a 5 dpi. (C) Immagine rappresentativa del sottoinsieme di larve in cui l'infezione si diffonde dal cervello posteriore in punti di tempo successivi. In questa immagine, funghi, macrofagi e neutrofili possono essere trovati intorno e sotto la vescicola otica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione rappresentativa degli esperimenti di imaging. Le immagini della configurazione sperimentale nella figura 3 sono state analizzate per la germinazione fungina e il reclutamento di leucociti. (A) Le larve sono state valutate per la presenza di spore germinate ogni giorno e la percentuale di larve con germinazione è stata calcolata. (B,C,D) Ogni singola larva è rappresentata come una linea di colore diversa. L'aspetto e le dimensioni dell'ammasso fagocita (B), il reclutamento di macrofagi (C) e il reclutamento di neutrofili (D) sono stati seguiti nel corso dell'esperimento di 5 giorni per ogni larva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il modello di infezione descritto qui è utile per analizzare le risposte immunitarie dell'ospite, le interazioni ospite-patogeno e la patogenesifungina 12,13,14,15. Queste informazioni possono essere derivate dall'imaging ad alta risoluzione di agenti patogeni con etichetta fluorescente e cellule ospiti13,sopravvivenza larvale e persistenza CFU nel tempo.
La tecnica di microiniezione è fondamentale per il successo di questo protocollo e potrebbe dover essere regolata quando si utilizzano diverse apparecchiature e configurazioni di microiniezione. In particolare, la pressione e il tempo di iniezione sono due variabili principali e possono essere regolati per garantire che il volume espulso dall'ago sia ~3 nL. La dimensione dell'ago determinata tagliandolo con pini regola anche il numero di spore iniettate; anche se, un'apertura più grande può causare danni ai tessuti alla larva. D'altra parte, troppo piccolo di un'apertura non consentirà alle spore relativamente grandi (>2 μm) di uscire e può portare all'intasamento dell'ago. In questo caso, l'ago può essere rifilato per avere un'apertura leggermente più grande.
Altri protocolli per la microiniezione di batteri utilizzano PVP-40 per aiutare a mantenere una miscela di iniezione omogenea, ma non abbiamo trovato alcun vantaggio nell'utilizzare questo vettore con spore aspergillus. L'intasamento dell'ago può essere mitigato vorticiando accuratamente la preparazione fungina per rompere eventuali grumi prima di caricare l'ago. A volte, un intasamento nell'ago può anche essere rimosso aumentando temporaneamente la pressione o il tempo di iniezione e innescando il microiniettore mentre l'ago si trova nel liquido che circonda le larve. La pressione e il tempo di iniezione devono quindi essere nuovamente ridotti ai livelli precedenti. In altri casi, un intasamento non può essere rimosso e un nuovo ago deve essere caricato e ricalibrato.
Questo protocollo è progettato per iniettare ~30-70 spore per larva. È noto che in base alla concentrazione della preparazione delle spore e al volume iniettato, questo numero è piuttosto basso. Tuttavia, è stato empiricamente scoperto che questo è il numero di spore iniettate in queste condizioni. Perché questa differenza si verifica è sconosciuta, ma potrebbe essere dovuta a spore che si raggruppano nell'ago. I nostri tentativi di iniettare un maggior numero di spore non hanno avuto successo.
Per garantire che vengano iniettate circa 30-70 spore e mantenere la consistenza delle iniezioni in tutte le larve, controllare il numero di spore iniettando sull'E3 che circonda le larve. Ripeti questo ogni cinque o sei larve durante tutte le iniezioni. Se il conteggio delle spore sembra cambiare, la pressione e / o il tempo di iniezione possono essere regolati per iniettare un numero coerente di spore su più larve. Tuttavia, si deve fare attenzione che la dose di iniezione rimanga principalmente nel cervello posteriore e non riempia il cervello medio e il forebrain.
Per garantire un'infezione localizzata, la sospensione della spora deve essere contenuta all'interno del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore. Questo può essere visualizzato dalla colorazione rosso fenolo subito dopo l'iniezione, anche se il colore rosso si diffonde con il tempo. Per le iniezioni, la regione intorno alla vescicola otica viene utilizzata per perforare e raggiungere il ventricolo con un angolo di 45°-65°. Quest'area non ha vasi sanguigni principali, causa meno danni ai tessuti e guarisce all'istante. Se la pelle sopra il ventricolo viene perforata, la sospensione della spora può essere fuoriuscita, perché l'ago che deve essere utilizzato per le iniezioni di spore di Aspergillus è più grande di quello utilizzato per le sospensioni batteriche. Le larve iniettate o danneggiate accidentalmente senza successo possono essere contrassegnate iniettando nel tuorlo un paio di volte per creare un segno rosso o trascinando la larva fuori dalla fila con l'ago. Dopo che una serie di iniezioni è stata completata, queste larve devono essere rimosse e smaltite prima che il resto venga lavato via dal piatto. E3 senza blu di metilene viene utilizzato per anestetizzare le larve prima dell'iniezione e anche mantenere la larva dopo le iniezioni, perché il blu di metilene è anti-fungino.
Al momento dell'iniezione, i conteggi cfu rappresentano il numero di spore vitali all'interno dell'ospite infetto. Tuttavia, se le spore germinano in ife, queste possono essere suddivise in "unità fungine" vitali separate durante l'omogeneizzazione e possono dare origine a più colonie. Oppure, un'ifa multicellulare ininterrotta può dare origine a una singola colonia, risultando in una rappresentazione media, ma imprecisa, del fardello fungino. Questo può essere mitigato combinando i conteggi CFU con la microscopia longitudinale delle singole larve, che fornisce dati visivi sul destino delle spore iniettate.
Rispetto al sistema dei mammiferi, il modello di infezione della larva di zebrafish è particolarmente significativo grazie alla sua accessibilità ottica. Il reclutamento e la risposta delle cellule immunitarie innate possono essere visualizzati all'interno di un ospite intatto dal vivo. Questo può essere incorporato con l'inibizione genetica o chimica di obiettivi molecolari per analizzare come ogni bersaglio influisce sul macrofago o sulla reazione neutrofila contro le spore di Aspergillus in un animale vivo.
Mentre il modello di infezione della larva di zebrafish Aspergillus continua a essere strumentale nel descrivere diversi aspetti di IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,ci sono altre aree di espansione. Dal lato ospite, viene utilizzato per descrivere le risposte immunitarie a livello cellulare, ma questo può essere espanso per analizzare i meccanismi immunitari a livello molecolare combinandolo con morfolino mirato, CRISPR, linee mutanti stabili o esposizione chimica. Un avvertimento è che gli omologhi per tutti i componenti noti della via immunitaria innata dei mammiferi non sono stati identificati nei pesci zebra.
Dal lato patogeno, è stata descritta la virulenza di diverse specie e ceppi. Una via promettente della ricerca futura è l'uso di ceppi mutanti di Aspergillus per testare come specifici geni o proteine contribuiscono come fattori di virulenza. In questo modo, nuovi farmaci anti-fungini possono essere sviluppati per colpire queste proteine. Gli attuali farmaci antifungini hanno una bassa efficacia nei pazienti umani e c'è una crescente resistenza a questi farmaci nei funghi28. Questo modello in vivo può essere utilizzato per indagare perché questi farmaci falliscono e come modello intermedio per testare l'efficacia di nuovi farmaci antifungini. Nel complesso, i risultati scoperti utilizzando questo modello possono facilitare lo sviluppo futuro di trattamenti efficaci per i pazienti infetti da Aspergillus.
Disclosures
Nessun conflitto o interesse finanziario da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy And Infectious Diseases del National Institutes of Health con il premio K22AI134677. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
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