Summary
Detta protokoll beskriver en Aspergillus infektion modell i zebrafisk larver. Aspergillus sporer mikroin injiceras i hindbrain av larver, och kemisk behandling används för att inducera immunsuppression. Infektionsprogression övervakas via en daglig bildbehandlingsinställning för att övervaka svamptillväxt och immunsvar samt uppräkning av levande sporer genom koloniformningsenhetsplätering.
Abstract
Invasiv aspergillos (IA) är en av de vanligaste svampinfektionerna bland immunkomprometterade individer. Trots tillgången på svampdödande läkemedel kan IA orsaka >50% dödlighet hos infekterade immunkomprometterade patienter. Det är viktigt att bestämma både värd- och patogenfaktorer som bidrar till infektionskänslighet och låg överlevnad hos infekterade patienter för att utveckla nya terapier. Medfödda immunsvar spelar en central roll i erkännande och clearance av Aspergillus sporer, även om lite är känt om de exakta cellulära och molekylära mekanismerna. Tillförlitliga modeller krävs för att undersöka detaljerade mekanistiska interaktioner mellan värden och patogenen. Zebrafisklarvernas optiska klarhet och genetiska dragbarhet gör dem till en spännande modell för att studera värdpatogena interaktioner av flera mänskliga bakterie- och svampinfektioner i en levande och intakt värd. Detta protokoll beskriver en larv zebrafish Aspergillus infektion modell. Först isoleras Aspergillus sporer och injiceras i zebrafisken bakbrain ventrikel via mikroinjektion. Sedan tillsätts kemiska hämmare som immunsuppressiva läkemedel direkt till larvvattnet. Två metoder för att övervaka infektionen injicerade larver beskrivs, inklusive 1) homogenisering av larver för koloniformningsenhet (CFU) uppräkning och 2) en upprepad, daglig live imaging setup. Sammantaget kan dessa tekniker användas för att mekanistiskt analysera utvecklingen av Aspergillus infektion in vivo och kan tillämpas på olika värd bakgrunder och Aspergillus stammar för att förhöra värd-patogen interaktioner.
Introduction
Aspergillus fumigatus är en allestädes närvarande saprofytisk svamp, och dess luftburna sporer finns både inomhus och utomhus1. Dessa sporer inandas av alla men blir effektivt rensade från lungorna hos immunkompetenta individer1,2. Personer med förändrade lungsjukdomar som cystisk fibros kan dock utveckla bronkopulmonell aspergillos på grund av svampspiration i lungorna3. Den allvarligaste formen av denna infektion, invasiv aspergillos (IA), påverkar immunkomprometterade individer och innebär tillväxt av svampen till andra organ2,3. IA leder > 50% död av smittade patienter trots tillgången på svampdödande behandlingar4. Hos immunkompetenta individer spelar medfödda immunsvar en viktig roll för att rensa de inhalerade sporerna1. De specifika mekanismer som bidrar till detta medfödda immuntillstånd är dock inte väl förstådda. Det är viktigt att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna hos stora medfödda immunceller (dvs. makrofager och neutrofiler) i clearance av Aspergillus för att hitta nya terapeutiska strategier för IA.
Medan däggdjursmodeller har varit avgörande för att identifiera svampvirulensfaktorer och vara värd förimmunsvar 5,6, är visuell tillgänglighet begränsad för värdpatogeninteraktioner på cellnivå. Vävnadskulturexperiment kan inte helt rekapitulera den komplexa multicellulära miljön och interaktioner som finns hos hela djur7. Därför har zebrafisk blivit populär som en alternativ modellorganism för att fylla detta gap och underlätta studien av värdpatogeninteraktioner i en levande, intakt värd över en flerdagarsinfektion8,9. Zebrafiskens medfödda immunsystem utvecklas så tidigt som 24 timmar efter befruktning (hpf)10, och det adaptiva systemet tar 4-6 veckor att utveckla11, vilket ger ett tidsfönster där medfödda immunsvar kan bedömas isolerat. Medfödda immunsvar är väl bevarade mellan människor och zebrafisk11. Zebrafisk har många egenskaper som underlättar undersökningen av dessa svar, inklusive optisk klarhet (vilket möjliggör högupplöst levande avbildning av intakta värdar) och genetisk dragbarhet (vilket underlättar molekylära mekanistiska studier).
Larv zebrafish Aspergillus infektion modell beskrivs här utvecklades ursprungligen av Knox et al.12. Det har nyligen utökats av vår grupp och andra för att undersöka värdimmunmekanismer 12,13,värdpatogena interaktioner13,14,15, mekanismer för immunsuppression13,16,17,svamp virulens18, och anti-svamp läkemedel effekt19,20. Denna modell rekapitulerar flera aspekter av mänskliga aspergillos. Medan immunkompetenta larver är resistenta, kan immunkomprometterade larver duka underför infektion 12,13,16,17.
I denna modell etableras en lokaliserad infektion genom att injicera sporer i hindbrain ventrikeln i larva, ett område mindre befolkat med fagocyter, och fagocyt rekrytering och beteende kan utvärderas12,13. Man tror att makrofager fungerar som den första försvarslinjen mot Aspergillus sporer hos människor1 och däggdjursmodeller6,21. På samma sätt rekryteras makrofager i zebrafiskmodellen till de injicerade Aspergillus-sporerna, medan neutrofiler rekryteras i andra hand som svar på hyphaltillväxt12,13,22. Från denna modell har man också lärt sig att Aspergillus kan kvarstå i vildtyp immunocompetent larver efter mer än 7 dagars infektion. Dessutom kan hela infektionsföringen följas i samma levande djur genom daglig konfokal avbildning.
Detta protokoll beskriver tekniken för microinjection att injicera sporer i hindbrain ventrikel av 2 dagar efter befruktning (2 dpf) larver. Infektionen övervakas sedan i upp till 7 dagar, eftersom zebrafisklarver kan leva upp till 10 dpf utan utfodring. Immunsuppression kan induceras genom läkemedelsbehandling, och applicering av läkemedel på larverna beskrivs också. Slutligen beskrivs två metoder för att följa infektionsprogression, inklusive kvantifiering av CFUs från enskilda larver och en daglig live imaging setup.
Protocol
Forskare bör få godkännande för alla djurförsök från lämpliga djurvårds- och användningskommittéer. Representativa uppgifter som visas i denna artikel kommer från experiment som utförts enligt protokoll som godkänts av Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Beredning av Aspergillus sporer för injektion
- Från en Aspergillus sporupphängning, beräkna den volym som behövs för att erhålla 1 x 106 sporer. Volymen ska vara 20–100 μL; Om inte, producera en 10x utspädning i 0,01% (v/v) steril Tween-20 (Tween-vatten; Materialförteckning). Om den beräknade volymen till exempel är 5 μL, producera en 10x utspädning och använd 50 μL av den utspädda lösningen.
OBS: Två plattor/stammar kan beredas för att samla in fler sporer eller som reserv vid kontaminering. - Sprid 1 x 106Aspergillus sporer på en glukos minimal media (GMM) platta(Table of Materials)med en steril engångs L-formad spridare i ett biosäkerhetsskåp. Undvik att sprida till plattans marginal. Inkubera vid 37 °C i 3–4 dagar, med plattan vänd upp och ner.
- På uppsamlingsdagen, ta med steril miracloth och 50 ml koniska rör (två per stam), färska flaskor sterilt Tween-vatten (en per stam) och sterila engångs L-formade spridare till biosäkerhetsskåpet.
OBS: Miracloth kan skäras i ~8 i x 6 i bitar, lindas in i folie och autoklaveras för att sterilisera. - Placera en bit mirak i varje märkt 50 ml koniskt rör och re-cap. Ta ut det återstående miraklotpaketet ur huven.
- Ta in plattor i biosäkerhetsskåpet. Öppna en tallrik och häll sedan interpoleringsvatten på toppen för att täcka ungefär tre fjärdedelar av plattan.
- Använd en engångs L-formad spridare och skrapa försiktigt svampkulturens yta i en fram och tillbaka-rörelse, samtidigt som du använder den andra handen för att rotera plattan. Skrapa tills nästan alla sporer homogeniseras i interpoleringsvattnet.
OBS: På grund av hög hydrofobi kan sporer skapa "puffar" när interpoleringsvatten tillsätts eller under skrapning. Stor försiktighet bör vidtas för att undvika förorening av närliggande rör eller plattor. Det rekommenderas att byta handskar och torka av ytan med 70% etanol mellan extraktion av olika stammar. - Ta ett 50 ml koniskt rör och ta bort miraklotbiten. Vik den i hälften och gör den till ett filter som sätts in i toppen av det koniska röret på 50 ml.
- Häll svamp homogenatet från plattan över miracloth i röret.
OBS: Om två plattor av en stam är beredda, skrapa båda plattorna och häll dem i samma koniska rör. - Häll interpoleringsvatten för att få den totala volymen i det koniska röret till 50 ml.
- Snurra på 900 x g i 10 min. Se till att använda aerosoliseringsförebyggande lock i centrifugen.
- Häll av supernatanten i ~ 10% blekmedelslösning för att dekontaminera. Häll 50 ml steril 1x PBS i det koniska röret, virvel eller skaka för att återanvända pelleten.
- Snurra igen vid 900 x g i 10 min. Häll av supernaten och återanvänd pelleten i 5 ml steril 1x PBS. Filtrera genom en ny bit mirak till ett friskt 50 ml koniskt rör.
- Gör 10-faldiga seriella utspädningar (10x, 100x, 1000x) av svamphomogenatet i 1,7 mL centrifugerör (t.ex. för 10x-lösningen, blanda 100 μL av svamphomogenatet med 900 μL Tween-vatten).
- Välj den första utspädningen där sporerna inte är synliga när den släpps ut i interpoleringsvatten och använd denna utspädning för att räkna antalet sporer med hjälp av en hemocytometer.
- Beräkna sporkoncentrationen i det beredda svamphomogenatet (vattensuspension) med hjälp av följande formel:
Koncentration (sporer/ml) = Antal sporer i mitten 25 lådor x utspädningsfaktor x 104 - Förbered ett 1 ml lager på 1,5 x 108 sporer/ml i sterilt 1x PBS i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Denna sporpreparat kan förvaras vid 4 °C i ~4 veckor.
- Innan injektioner används, blanda 20 μL av sporpreparatet med 10 μL 1% steril fenolrött i ett 1,7 ml centrifugeringsrör för att uppnå en slutlig sporkoncentration på 1 x 108 sporer/ml. Vortex noggrant före injektionen.
OBS: 1% fenolröd lösning ska filtreras och lagras i alikvoter. - För en mock injektion, blanda 20 μL 1x PBS med 10 μL av 1% steril fenolröd.
2. Beredning av agarplattor för injektion
- Förbered 2% agarose i E3 medium och smält i en mikrovågsugn.
- Häll i en 100 mm x 15 mm Petriskål (~ 25 ml per tallrik), snurra för att täcka plattan jämnt och låt svalna.
- Linda plattan med paraffinfilm och förvara inverterad vid 4 °C.
- Före injektionen, ta plattan till rumstemperatur (RT).
- Häll ~1 ml filtersteriliserat 2% bovint serumalbumin (BSA) på plattan, luta plattan för att sprida och täcka hela botten och skölj med E3.
OBS: 2% BSA-lösning kan filtreras och lagras som 1 ml alikvoter vid -20 °C. 2% BSA förbehandling förhindrar larver från att fastna på agaroseytan. - Häll E3 med buffrad trikain på plattan och låt den sitta tills den injektion.
3. Zebrafisk larva hindbrain ventrikel microinjection
- Dekhorionate manuellt larver med tång vid 2 dpf i en petriskål.
OBS: Dechorionation kan utföras när som helst från 1,5 dpf till injektionstiden. - Ta bort så mycket E3 som möjligt från Petri-skålen och tillsätt buffrad 300 μg/mL trikain i E3 för att bedöva larver.
OBS: En stamlösning av buffrat 4 mg/ml trikain i E3 kan beredas och förvaras vid 4 °C. Arbetslösningen kan tillverkas genom att späda ut 4 ml av stamlösningen upp till 50 ml med E3. - Använd en mikroinjektionsinställning som medföljer tryckinjektorn, tryckenheten, fotbrytaren, mikropipettehållaren, mikromanipulatorn och ett magnetiskt stativ och en magnetisk platta, alla anslutna till en tryckluftskälla (Materialförteckning).
- Öppna tryckluftsventilen och slå på mikroinjektorn. Ställ in trycket på ~25 PSI, pulsvaraktigheten till 60 ms och tryckpressenheten på 1 PSI.
- Ladda en mikroinjektionsnål med en mikrolastarpipettspets (Table of Materials) med ca 3–5 μL förberedd PBS- eller sporfjädring med fenolrött. Montera nålen på mikromanipulatorn.
OBS: Mikroinjektionsnålar kan beredas enligt beskrivningen tidigare23. Stereomikroskopet som används för mikroskop bör ha en ögonstyckes riktmedel för att kalibrera mikroinjektionsnålen. Riktmedlet ska kalibreras med en stegmikrometer, och längden på riktmedelsskalan (μm) bör bestämmas. Diametern på sporupphängningsdropp som skjuter ut från nålen mäts beroende på antalet hash (av riktmedlet) som överlappar droppen. - Placera mikromanipulatorn så att nålens ände är i sikte vid den lägsta förstoringen under stereomikroskopet. Zooma till 4x förstoring, håll nålen i sikte.
- Fäst nålens ände med hjälp av vassa tångar. Tryck på injektionspedalen för att visualisera storleken på droppen som kommer ut. Fortsätt att klippa tillbaka tills ~ 3 nL sporupphängning injiceras (här är det fem hash).
- Flytta mikromanipulatorn och nålen ur vägen för att undvika att oavsiktligt träffa nålen medan larverna är ordnade på injektionsplattan.
- Häll E3-Tricaine från injektionsplattan och överför sedan ~ 24 bedövade larver till injektionsplattan med så lite E3 som möjligt med hjälp av en överföringsrör.
- Använd ett litet verktyg för att manipulera zebrafisklarver (dvs. hårslingverktyg eller ögonfransverktyg), ordna larverna enligt i vilken riktning de är vända. Placera specifikt alla vända åt höger i en rad och alla vända åt vänster i rad nedan.
OBS: Detta arrangemang är svårt om det finns för mycket vätska på plattan, eftersom larverna kommer att "flyta" på plats. Men för lite vätska är också problematiskt om injektionerna tar lång tid, eftersom larverna kan torka ut eller anestesi avta. Således bör noggrann uppmärksamhet ägnas åt mängden vätska på plattan under hela mikroinjektionsprocessen. - Justera mikroskopzoomen till den lägsta förstoringen. Ta tillbaka mikromanipulatorn och ordna så att nålen är nära larverna, i en ~ 30 ° - 60 ° vinkel, i mitten av synfältet.
- Zooma in på högsta förstoring och använd finjusteringsknappar för att ytterligare justera nålens position. Kontrollera att ~ 30-70 sporer kommer ut ur nålen genom att injicera sporupphängningen i vätskan på plattan bredvid larverna. Justera vid behov tid och tryck på injektionsinställningen.
OBS: Detta test bör upprepas efter var femte till sjätte larver, eftersom antalet sporer som kommer ut ur nålen kan öka eller minska med tiden. - Börja med raden där larverna är vända mot nålen, flytta plattan så att nålen är direkt ovanför och placerad nära de första larverna.
- Flytta nålen med mikromanipulatorn, för in nålen genom vävnaden runt otic vesicle för att genomborra genom i bakbens ventrikeln. Flytta plattan med den andra handen om det behövs för att få rätt orientering av larven med nålens vinkel.
- Kontrollera visuellt att nålens ände är i mitten av bakbrain ventrikeln, tryck på fotpedalen för att injicera sporer och dra försiktigt tillbaka nålen.
OBS: Fenolröd färgämnet bör i första hand stanna inom bakbensöppningen. En liten mängd kan gå in i midbrain, men det bör inte nå framhjärnan eller utanför hjärnan. Om den gör det är volymen som injiceras för stor, och trycket och tiden bör minskas i enlighet därmed, eller en ny nål bör kalibreras. - Flytta ner plattan, injicera alla larver i den raden. Vänd sedan plattan och injicera alla larver i den andra raden.
OBS: Utan framgång injicerade eller oavsiktligt skadade larver kan märkas med 1) injicera i äggulan ett par gånger för att skapa ett rött märke eller 2) dra larven ut ur raden med nålen. - Flytta nålen upp och ut ur vägen igen. Zooma ut till en lägre förstoring på mikroskopet. Fenolrött färgämne ska fortfarande vara synligt i bakhjärnan på varje larva.
- Dra först bort med hårslingverktyg och pipett upp för att kassera eventuella larver med misslyckade injektioner. Överför de återstående larverna till en ny Petri-maträtt genom att tvätta dem från plattan med färsk steril E3 och en överföringsrör.
- Upprepa vid behov för önskat slutligt experimentellt provnummer.
- Skölj larverna minst 2x med E3 och se till att de återhämtar sig från anestesi.
- För att kvantifiera överlevnad utan ytterligare behandling, med hjälp av en överföringspipett, överför larver till en 96 brunnsplatta (1 larva per brunn) i E3.
4. Fastställande av injicerade och livskraftiga spornummer
- Omedelbart efter injektionen, med hjälp av en överföringspipett, välj slumpmässigt cirka åtta av de injicerade larverna och överför dem till 1,7 mL centrifugerör (en larva per rör).
- Avliva larver med trikain eller genom att placera dem vid 4 °C i 0,5–2,0 timmar.
- Bered 1 ml 1 mg/ml ampicillin och 0,5 mg/ml kanamycinantibiotiska lösningar i steril 1x PBS. Den överblivna lösningen kan förvaras vid 4 °C och användas senare.
OBS: Stamlösningar av ampicillin vid 100 mg/ml och kanamycin 50 mg/ml kan förtillverkas, filtersteriliseras och förvaras i alikvoter vid -20 °C. Späd dessa 100x i 1x PBS för att få arbetslösningen. - Använd en pipett, ta bort så mycket vätska som möjligt från centrifugröret, lämna larven bakom och tillsätt 90 μL av 1x PBS med antibiotika.
OBS: Antibiotika används för att förhindra bakterietillväxt i GMM-plattor som kan störa räkningen av Aspergillus kolonier. - Homogenisera larver i en vävnadslyst vid 1 800 svängningar/min (30 Hz) i 6 minuter. Snurra ner på 17 000 x g för 30 s.
- Etikett GMM-plattor (en platta per homogeniserade larver). Med hjälp av en Bunsenbrännare för att skapa en steril miljö, pipett den homogeniserade suspensionen från ett rör till mitten av GMM-plattan och sprid sedan med en engångs L-formad spridare. Undvik att sprida homogenatet mot fälgen.
- Inkubera plattorna upp och ner vid 37 °C i 2–3 dagar och räkna antalet kolonier som bildats (CFU).
- För att mäta antalet sporer levande under infektionsperioden, välj larver från 96-brunnsplattan vid 1-7 dagar efter injektion (dpi) och överför dem till centrifugrör. Avliva och homogenisera larver för att spridas på GMM-plattor enligt beskrivningen i steg 4.1–4.5.
5. Läkemedelsbehandling av injicerade larver
- Efter avsnitt 4, dela de återstående injicerade larverna i två 3,5 mm rätter: en för läkemedelsbehandlingen och en för kontrollen. Använd cirka 24 infekterade larver per tillstånd.
OBS: Disken på 3,5 mm kan behandlas med 2% fettfri torr mjölk i vatten, sköljas, lufttorkas och förvaras på RT i förväg. Beläggning med mjölk förhindrar att larver fastnar på plasten. - Förbered önskad läkemedelslösning och fordonet i E3 utan metylenblått i koniska rör enligt den slutliga koncentration som krävs och blanda sedan väl. Till exempel, för att övervaka överlevnaden av larver som utsätts för dexametason, använd 24 larver (replikat) för dexametason och 24 för fordonskontrollen, såsom DMSO. Förbered 5 ml av läkemedelslösningen vid önskad koncentration. Här användes 5 ml 0,1% DMSO och 10 μM dexametason, och 24 larver/tillstånd överfördes till ~200 μL av fordonet/läkemedelslösningen/larverna.
- Ta bort så mycket vätska som möjligt från en maträtt med en överföringspipett och tillsätt förblandad E3 som innehåller fordonsstyrning. Upprepa med förblandad E3 som innehåller behandling av intresse för den andra rätten.
- Använd en pipett, överför larver till 96 brunnsplatta (en larva per brunn). Övervaka överlevnaden av injicerade larver som exponerats för fordonet eller läkemedlet i 7 dagar.
OBS: Läkemedlet kan appliceras endast på infektionsdagen och hållas på larverna under hela experimentet eller kan uppdateras dagligen.
6. Daglig avbildning av infekterade larver med zebrafisken Sårning och entrapmentanordning för tillväxt och avbildning (zWEDGI)
- Se till att larverna behandlas med 100 μM N-fenylthiourea (PTU) vid 24 hkf för att förhindra pigmentering och att PTU hålls på larverna under hela experimentet.
OBS: PTU vid 75–100 μM förhindrar pigmentering av larver utan några grova utvecklingsdefekter24. PTU kan dock störa vissa biologiska processer25, och forskare bör i förväg avgöra om läkemedlet kan påverka några processer som är under utredning. - Infektera transgena larver med märkta cellpopulationer av intresse vid 2 dpf med Aspergillus sporer konstruerade för att uttrycka ett fluorescerande protein, som beskrivs i avsnitt 3. Överför sedan infekterade larver till brunnar av en 48 brunnsplatta i ca 500 μL / brunn av E3 utan metylenblått.
OBS: En 48 brunnsplatta används här, eftersom det är lättare att överföra larver till och från under upprepad daglig avbildning. - På avbildningsdagen, förbered två 3,5 mm Petri-rätter: en med 100 μM PTU och en med E3-trikain.
- Tillsätt E3-tricaine i kamrarna på en zWEDGI-enhet26,27. Ta bort luftbubblor från kamrarna och fasthållningskanalen under stereomikroskopet med hjälp av en P100-mikropipett. Ta bort all överskott E3-tricaine, så det är det bara i kamrarna.
- Pipett upp en larva från plattan med hjälp av en överföringspipett. Om mycket vätska används för att ta bort den, pipett i en 3,5 mm skål som innehåller E3-PTU. Sedan pipett upp igen, med så lite vätska som möjligt, och överför till E3-tricaine.
- Vänta ~30 s för bedövning och överför sedan till lastkammaren på sår- och infällningsanordningen (t.ex. zWEDGI).
- Placera larven under stereomikroskopet. Använd P100-mikropipetten för att ta bort E3-trikain från sårkammaren och släpp ut i lastkammaren för att flytta larvens svans in i begränsningskanalen. Se till att larven är placerad på dess laterala, dorsala eller dorso-laterala sida, så att bakhjärnan kan avbildas med en inverterad objektiv.
- Bild larva med ett konfokalt mikroskop.
- Efter avbildning, med P100-pipetten, släpp ut E3-trikain i sårkammaren för att trycka larven från fasthållningskanalen in i lastkammaren.
- Använd en överföringspipett, plocka upp larven och överför den tillbaka till Petri-skålen med E3-Tricaine. Använd så lite vätska som möjligt, överför den till Petri-skålen med E3-PTU. Skölj i PTU och överför tillbaka till 48 brunnsplattan.
Representative Results
Efter mikroinjektion av Aspergillus sporer i bakhjärnan av zebrafisk larver, infektion resultatet kan följas av flera analyser, inklusive överlevnad, CFUs och levande imaging. I en överlevnadsanalys övervakades antalet infekterade larver som överlevde 1-7 dpi. När vildtyp larver lämnades obehandlade observerades mycket lite död, med ~ 80%-100% av larverna som överlevde hela experimentet (Figur 1). Om larverna var immunsupprimerade,t.ex.genom exponering för kortikosteroidläkemedlet dexametason (10 μM), observerades signifikant minskad överlevnad ( figur 1 ).
När CFUs kvantifierades under hela 7 dagars experimentet från vildtyp larver infekterade med A. fumigatus sporer observerades persistens av sporer, med långsam clearance över tiden (Figur 2A). Antalet sporer som överlevde vid 1, 2, 3, 5 och 7 dpi normaliserades till antalet sporer som injicerades vid 0 dpi för att jämföra persistens och clearance över replikat (figur 2B).
Transgena fisklinjer som uttrycker fluorescerande proteiner i leukocyter tillsammans med fluorescerande protein-uttrycka Aspergillus sporer kan användas för att visualisera både leukocyt rekrytering och beteende samt svamp spiring och tillväxt13. När makrofager var märkta (t.ex. Tg(mpeg1:H2B-GFP))observerades vanligtvis makrofagkluster i ~ 50% av larverna, från 2-3 dpi (figur 3A). Rekryteringen av neutrofil(Tg( lyz:BFP)försenades vanligtvis, främst efter det att svampspirering har inträffat (figur 3A). Medan svampbördan kvarstod under hela försöket i de flesta larver(figur 3A),observerades clearance (figur 3B). I vissa larver observerades svampbörda utanför bakhjärnan också senare i infektion, på grund av svampspridning, sannolikt i makrofager.
Området runt blåskrämen är en möjlig plats där denna spridning kan hittas (figur 3C). Dessa observationer kvantifierades i flera enskilda larver under hela experimentet (figur 4). Vanligtvis sågs spiring i ~ 60% av larverna med 5 dpi (Figur 4A). Fagocytklusterområdet, rekryteringen av makrofager och neutrofilrekryteringen varierar både över tid och mellan larver, med viss trend uppåt under hela experimentet och en del lösning över tid (figur 4B,C,D).
Figur 1: Representativ överlevnadsanalys av infekterade larver. Aspergillus-infekteradelarver utsattes för fordonskontroll (DMSO) eller dexametason (Dex), och överlevnad övervakades. Data representerar tre poolade replikat. Genomsnittliga injektions-CFUs: DMSO = 30, Dex = 29 (p-värde och faroförhållande beräknades genom Cox proportionella risk regressionsanalys, ****p < 0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ cfu räknas från enskilda infekterade larver omedelbart efter injektion (0 dpi) och under infektionskursen (2, 3, 5 och 7 dpi). Åtta infekterade larver homogeniserades och pläterades för att räkna CFU för varje tidpunkt och replikat. (A) Exempeldata från en replik. Varje punkt representerar en larva, staplar representerar medel för varje tidspunkt. (B) CFU-räkningar normaliserades till CFU-räkningen vid 0 dpi för varje replikat, och tre replikat poolades. Data jämfördes mellan experimentella tillstånd med hjälp av variansanalys och sammanfattades i termer av uppskattade marginalmedel och standardfel. Asterix representerar statistisk signifikans jämfört med CFU vid 0 dpi (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa bilder från infektionsexperiment. PTU-behandlade larver med fluorescerande makrofager (mpeg1:H2B-GFP) och neutrofiler (lyz:BFP) injicerades med RFP-uttrycker A. fumigatus. Levande, infekterade larver avbildades upprepade gånger vid 2, 3 och 5 dpi på ett konfokalt mikroskop. Bilder med maximal intensitet Z-projektion visas. Ritningar av larver indikerar platsen för avbildning för varje panel. Alla skalstänger representerar 100 μm, med undantag för inset-skalstängerna, som är 25 μm. (A) Bilderna som visas är från en enda larva tagen vid 2, 3 och 5 dpi, vilket representerar en typisk infektionsprogression. Insets visar svamp spiring vid dag 3 och 5. (B) Representativ bild av delmängd av larver som kan rensa infektionen, med låg svampbörda och inte mycket inflammation vid 5 dpi. C)Representativ bild av delmängd av larver där infektion sprids ut ur bakhjärnan vid senare tidpunkter. I den här bilden kan svamp, makrofager och neutrofiler hittas runt och under otic vesikeln. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativ kvantifiering av bildexperiment. Bilder från experimentell installation i figur 3 analyserades för svampspirering och leukocytrekrytering. (A) Larver gjordes för förekomst av grodda sporer varje dag, och andelen larver med spiring beräknades. (B,C,D) Varje enskild larva representeras som en annan färglinje. Phagocyte kluster utseende och storlek (B), makrofag rekrytering (C) och neutrophil rekrytering (D) följdes under loppet av 5 dagars experiment för varje larva. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Infektionsmodellen som beskrivs här är fördelaktig för att analysera värdens immunsvar, värdpatogeninteraktioner och svamppatogenes12,13,14,15. Denna information kan härledas från högupplösta avbildningar av fluorescerande märkta patogener och värdceller13,larv överlevnad och CFU persistens över tiden.
Mikroinjektionstekniken är avgörande för protokollets framgång och kan behöva justeras vid användning av olika mikroinjektionsutrustning och inställningar. I synnerhet är trycket och injektionstiden två huvudvariabler och kan justeras för att säkerställa att volymen som matas ut av nålen är ~ 3 nL. Nålens storlek som bestäms genom att klippa den med tång reglerar också antalet sporer som injiceras; även om en större öppning kan orsaka vävnadsskador på larven. Å andra sidan kommer för liten öppning inte att tillåta de relativt stora sporerna (>2 μm) ut och kan leda till nålpropp. Om detta inträffar kan nålen relipped för att ha en något större öppning.
Andra protokoll för mikroinjektion av bakterier använder PVP-40 för att upprätthålla en homogen injektionsblandning, men vi har inte funnit någon fördel med att använda denna bärare med Aspergillus sporer. Igensättning av nålen kan mildras genom att vifta med svampberedningen noggrant för att bryta eventuella klumpar innan nålen laddas. Ibland kan en täppa i nålen också lossnas genom att tillfälligt öka trycket eller injektionstiden och utlösa mikroinjektorn medan nålen är i vätskan som omger larverna. Tryck- och injektionstiden bör sedan minskas igen till tidigare nivåer. I andra fall kan en täppa inte tas bort, och en ny nål måste laddas och omkalibreras.
Detta protokoll är utformat för att injicera ~ 30-70 sporer per larva. Det är känt att baserat på koncentrationen av sporberedningen och volymen injicerad är detta antal ganska lågt. Det har dock empiriskt visat sig att detta är antalet sporer som injiceras under dessa förhållanden. Varför denna skillnad uppstår är okänd, men det kan bero på sporklumpning i nålen. Våra egna försök att injicera ett större antal sporer har till stor del misslyckats.
För att säkerställa att cirka 30-70 sporer injiceras och bibehålla konsistensen av injektionerna i alla larver, kontrollera antalet sporer genom att injicera på E3 som omger larverna. Upprepa detta var femte till sjätte larver under alla injektioner. Om sporräkningen verkar förändras kan trycket och/ eller injektionstiden justeras för att injicera ett konsekvent antal sporer över flera larver. Man bör dock vara försiktig så att injektionsdosen i första hand förblir i bakhjärnan och inte fyller midbrain och förhjärna.
För att säkerställa en lokaliserad infektion bör sporupphängningen hållas i bakbrain ventrikeln. Detta kan visualiseras av fenolröd färgning strax efter injektionen, även om den röda färgen doftar med tiden. För injektioner används regionen runt otic vesicle för att genomborra genom och nå ventrikeln i en 45°-65° vinkel. Detta område har inga huvudsakliga blodkärl, orsakar mindre vävnadsskador och läker omedelbart. Om huden över ventrikeln genomborras kan sporupphängningen läcka ut, eftersom nålen som måste användas för Aspergillus sporinjektioner är större än den som används för bakteriella suspensioner. Utan framgång injiceras eller oavsiktligt skadade larver kan markeras genom att injicera i äggulan ett par gånger för att skapa ett rött märke eller genom att dra larven ut ur raden med nålen. När en uppsättning injektioner är klar bör dessa larver avlägsnas och kasseras innan resten tvättas bort från plattan. E3 utan metylenblått används för att bedöva larver före injektion och även hålla larven efter injektionerna, eftersom metylenblått är antisvamp.
Vid injektions tidpunkten för injektionen representerar CFU-räkningar antalet livskraftiga sporer i den infekterade värden. Men om sporerna gror till hyphae, kan dessa delas upp i separata livskraftiga "svampenheter" under homogenisering och kan ge upphov till flera kolonier. Eller, en obruten multicellulär hypha kan ge upphov till en enda koloni, vilket resulterar i en genomsnittlig, men oprecis, representation av svampbördan. Detta kan mildras genom att kombinera CFU-räkningarna med längsgående mikroskopi av enskilda larver, vilket ger visuella data om ödet för injicerade sporer.
Jämfört med däggdjurssystemet är zebrafisk larva infektionsmodellen särskilt signifikant på grund av dess optiska tillgänglighet. Rekrytering och svar av medfödda immunceller kan visualiseras inom en levande intakt värd. Detta kan införlivas med genetisk eller kemisk hämning av molekylära mål för att analysera hur varje mål påverkar makrofag- eller neutrofilreaktionen mot Aspergillus sporer hos ett levande djur.
Medan zebrafisk larva Aspergillus infektion modell fortsätter att vara avgörande för att beskriva olika aspekter av IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, det finns andra expansionsområden. Från värdsidan används det för att beskriva immunsvar på cellnivå, men detta kan utökas för att analysera immunmekanismer på molekylär nivå genom att kombinera det med riktad morpholino, CRISPR, stabila mutantlinjer eller kemisk exponering. En varning är att homologer för alla kända däggdjur medfödda immunväg komponenter inte har identifierats i zebrafisk.
Från patogensidan har virulens av olika arter och stammar beskrivits. En lovande väg för framtida forskning är användningen av mutanta Aspergillus-stammar för att testa hur specifika gener eller proteiner bidrar som virulensfaktorer. Därmed kan nya svampläkemedel utvecklas för att rikta in sig på dessa proteiner. Nuvarande svampläkemedel har låg effekt hos mänskliga patienter och det finns växande resistens mot dessa läkemedel isvampar 28. Denna in vivo-modell kan användas för att undersöka varför dessa läkemedel misslyckas och som en mellanmodell för att testa effekten av nya svampläkemedel. Sammantaget kan de fynd som upptäcks med hjälp av denna modell underlätta framtida utveckling av effektiva behandlingar för Aspergillus-infekteradepatienter.
Disclosures
Inga konflikter eller ekonomiska intressen att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Allergy And Infectious Diseases vid National Institutes of Health under Award Number K22AI134677. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Denning, D. W. Invasive aspergillosis. Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
