Summary
Denne protokol beskriver en Aspergillus infektion model i zebrafisk larver. Aspergillus sporer er microinjected i baghjernen af larver, og kemisk behandling bruges til at fremkalde immunosuppression. Infektionsprogression overvåges via en daglig billeddannelsesopsætning for at overvåge svampevækst og immunrespons samt optælling af levende sporer ved kolonidannelsesenhed, der plating.
Abstract
Invasiv aspergillosis (IA) er en af de mest almindelige svampeinfektioner blandt immunkompromitterede individer. På trods af tilgængeligheden af svampemidler kan IA forårsage > 50% dødelighed hos inficerede immunkompromitterede patienter. Det er afgørende at bestemme både værts- og patogenfaktorer, der bidrager til infektionsfølsomhed og lave overlevelsesrater hos inficerede patienter for at udvikle nye behandlingsfaktorer. Medfødte immunrespons spiller en central rolle i anerkendelse og clearance af Aspergillus sporer, men lidt er kendt om den nøjagtige cellulære og molekylære mekanismer. Pålidelige modeller er nødvendige for at undersøge detaljerede mekanistiske interaktioner mellem værten og patogenet. Zebrafisklarvers optiske klarhed og genetiske tarmkanal gør dem til en spændende model til at studere værtspatogeninteraktioner af flere menneskelige bakterie- og svampeinfektioner i en levende og intakt vært. Denne protokol beskriver en larve zebrafisk Aspergillus infektion model. For det første isoleres Aspergillus sporer og injiceres i zebrafisk hindbrain ventrikel via mikroinjection. Derefter tilsættes kemiske hæmmere som immunosuppressive lægemidler direkte til larvevandet. To metoder til overvågning af infektionen i injicerede larver er beskrevet, herunder 1) homogenisering af larver til kolonidannelsesenhed (CFU) optælling og 2) en gentagen, daglig levende billeddannelsesopsætning. Samlet set kan disse teknikker bruges til mekanistisk at analysere udviklingen af Aspergillus-infektion in vivo og kan anvendes på forskellige værtsbaggrunde og Aspergillus-stammer for at afhøre værtspatogeninteraktioner.
Introduction
Aspergillus fumigatus er en allestedsnærværende saprofytisk svamp, og dens luftbårne sporer kan findes både indendørs og udendørs1. Disse sporer indåndes af alle , men bliver effektivt fjernet fra lungerne hos immun inkompetente individer1,2. Men, mennesker med ændrede lungesygdomme såsom cystisk fibrose kan udvikle bronchopulmonary aspergillosis på grund af svampespiring i lungerne3. Den mest alvorlige form for denne infektion, invasiv aspergillosis (IA), påvirker immunkompromitterede individer og involverer vækst af svampen i andre organer2,3. IA fører til >50% død af inficerede patienter på trods af tilgængeligheden af anti-svampe behandlinger4. Hos immunkompetente individer spiller medfødte immunresponser en stor rolle i rydningen af de inhalerede sporer1. De specifikke mekanismer, der bidrager til denne medfødte immunrydning, er imidlertid ikke godt forstået. Det er vigtigt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer i større medfødte immunceller (dvs. makrofager og neutrofiler) i clearance af Aspergillus for at finde nye terapeutiske strategier for IA.
Mens pattedyr modeller har været medvirkende til at identificere svampe virulens faktorer og vært immunrespons5,6, visuel tilgængelighed er begrænset til vært-patogen interaktioner på cellulært niveau. Vævskulturforsøg kan ikke fuldt ud opsummere det komplekse multicellulære miljø og interaktioner, der findes i hele dyr7. Derfor har zebrafisk vundet popularitet som en alternativ modelorganisme til at udfylde dette hul og lette undersøgelsen af værtspatogeninteraktioner i en levende, intakt vært på tværs af en flerdages infektion8,9. Zebrafisken medfødt immunsystem udvikler sig så tidligt som 24 timer efter befrugtning (hpf)10, og det adaptive system tager 4-6 uger at udvikle11, hvilket giver et vindue af tid, hvor medfødte immunresponser kan vurderes isoleret. Medfødte immunrespons er godt bevaret mellem mennesker og zebrafisk11. Zebrafisk har mange kvaliteter, der letter undersøgelsen af disse reaktioner, herunder optisk klarhed (som giver mulighed for høj opløsning levende billeddannelse af intakte værter) og genetiske tractability (som letter molekylære mekanistiske undersøgelser).
Larve zebrafisk Aspergillus infektion model beskrevet her blev oprindeligt udviklet af Knox et al.12. Det er for nylig blevet udvidet af vores gruppe og andre til at undersøge vært immunmekanismer12,13, host-patogen interaktioner13,14,15, mekanismer immunosuppression13,16,17, svampe virulens18, og anti-svampe lægemiddel effekt19,20. Denne model opsummerer flere aspekter af menneskelig aspergillosis. Mens immunkompetente larver er resistente, kan immunkompromitterede larver bukke under for infektion12,13,16,17.
I denne model etableres en lokaliseret infektion ved at injicere sporer i larvenens hindbrain ventrikel, et område mindre befolket med fagocytter, og phagocyt rekruttering og adfærd kan evalueres12,13. Det antages, at makrofager fungerer som den første forsvarslinje mod Aspergillus sporer hos mennesker1 og pattedyrsmodeller6,21. Tilsvarende rekrutteres makrofager i zebrafiskmodellen til de injicerede Aspergillus sporer, mens neutrofiler rekrutteres sekundært som reaktion på hypnotisal vækst12,13,22. Fra denne model er det også blevet lært, at Aspergillus kan fortsætte i vilde type immunkompetente larver efter mere end 7 dages infektion. Desuden kan hele infektionsforløbet følges i de samme levende dyr ved daglig konfokal billeddannelse.
Denne protokol beskriver teknikken med mikroinjection til at injicere sporer i hindbrain ventrikel af 2 dage efter befrugtning (2 dpf) larver. Infektionen overvåges derefter i op til 7 dage, da zebrafisklarver kan leve op til 10 dpf uden fodring. Immunosuppression kan induceres ved lægemiddelbehandling, og anvendelsen af lægemidler til larverne beskrives også. Endelig beskrives to metoder til at følge infektionsprogression, herunder kvantificering af CFU'er fra individuelle larver og en daglig live imaging-opsætning.
Protocol
Forskerne bør indhente godkendelse til alle dyreforsøg fra de relevante dyrepleje- og brugsudvalg. Repræsentative data, der er vist i denne artikel, er fra forsøg udført under protokoller godkendt af Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Forberedelse af Aspergillus sporer til injektion
- Fra en Aspergillus spore suspension, beregne det volumen, der er nødvendige for at opnå 1 x 106 sporer. Volumenet skal være 20-100 μL. hvis ikke, producere en 10x fortynding i 0,01% (v/v) steril Tween-20 (Tween-vand; Tabel over materialer). Hvis det beregnede volumen f.eks.
BEMÆRK: To plader/stamme kan være forberedt på at indsamle flere sporer eller som reserve i tilfælde af kontaminering. - Spred 1 x 106Aspergillus sporer på en glukose minimal media (GMM) plade(Table of Materials)med en steril engangs L-formet spreder i en biosikkerhed kabinet. Undgå at sprede sig til pladens margen. Inkuber ved 37 °C i 3-4 dage, mens pladen vender på hovedet.
- På indsamlingsdagen bringes steril miracloth og 50 mL koniske rør (to pr. stamme), friske flasker sterilt Tween-vand (en pr. Stamme) og sterile engangs L-formede spredere til biosikkerhedsskabet.
BEMÆRK: Miracloth kan skæres i ~ 8 i x 6 i stykker, indpakket i folie, og autoklaveret til at sterilisere. - Placer et stykke miracloth i hver mærket 50 mL konisk rør og re-cap. Tag den resterende miracloth pakke ud af kølerhjelmen.
- Bring plader ind i biosikkerhedsskabet. Åbn en plade, og hæld derefter Tween-vand på toppen for at dække omkring tre fjerdedele af pladen.
- Ved hjælp af en engangs L-formet spreder skrabes forsigtigt svampekulturens overflade i en frem og tilbage-bevægelse, mens du bruger den anden hånd til at rotere pladen. Skrab indtil næsten alle sporer er homogeniseret i Tween-vandet.
BEMÆRK: På grund af høj hydrofobiskhed kan sporer skabe "pust", når Tween-vand tilsættes eller under skrabning. Der skal udvises stor forsigtighed for at undgå kontaminering af nærliggende rør eller plader. Det anbefales at skifte handsker og tørre overfladen af med 70% ethanol mellem ekstraktion af forskellige stammer. - Tag et 50 mL konisk rør og fjern stykke miracloth. Fold det i halve og gøre det til et filter indsat i toppen af 50 mL koniske rør.
- Hæld svampe homogenatet fra pladen over miracloth i røret.
BEMÆRK: Hvis der fremstilles to plader af en stamme, skrabes begge plader og hældes i samme koniske rør. - Hæld Tween-vand for at bringe det samlede volumen i koniske rør til 50 mL.
- Spin på 900 x g i 10 min. Sørg for at bruge aerosoliseringsforebespørgelseshætter i centrifuge.
- Hæld supernatanten i ~ 10% blegemiddelopløsning for at dekontaminere. Hæld 50 mL steril 1x PBS i koniske rør, derefter vortex eller ryst for at genbruge pellet.
- Spin igen ved 900 x g i 10 min. Aflys supernatanten og ophæld pelleten i 5 mL steril 1x PBS. Filtrer gennem et frisk stykke miracloth i et frisk 50 mL konisk rør.
- Der fremstilles 10 gange serielle fortyndinger (10x, 100x, 1000x) af svampe homogenatet i 1,7 ml centrifugerør (f.eks. blandes 100 μL af svampe homogenatet med 900 μL tween-vand) for 10x opløsningen).
- Vælg den første fortynding, hvor sporerne ikke er synlige, når de udledes i Tween-vand, og brug denne fortynding til at tælle antallet af sporer ved hjælp af et hæmocytometer.
- Sporkoncentrationen i det forberedte svampe homogenat (vandaffjedring) beregnes ved hjælp af følgende formel:
Koncentration (sporer/mL) = Antal sporer i midten 25 kasser x fortyndingsfaktor x 104 - Der fremstilles et 1 mL lager på 1,5 x 108 sporer/mL i steril 1x PBS i et 1,7 mL mikrocentrifugerør. Dette sporepræparat kan opbevares ved 4 °C i ~4 uger.
- Før der anvendes i injektioner, blandes 20 μL af sporpræparatet med 10 μL 1% steril phenolrød i et 1,7 mL centrifugerør for at opnå en endelig sporekoncentration på 1 x 108 sporer/mL. Vortex grundigt før injektion.
BEMÆRK: 1% phenolrød opløsning skal filtreres steriliseres og opbevares i aliquots. - For en mock injektion blandes 20 μL 1x PBS med 10 μL 1% steril phenolrød.
2. Fremstilling af agarplader til injektion
- Forbered 2% agarose i E3 medium og smelte i en mikrobølgeovn.
- Hæld i en 100 mm x 15 mm Petri parabol (~ 25 mL per plade), hvirvel til at dække pladen jævnt, og lad afkøle.
- Pladen ombrydes med paraffinfilm, og der opbevares omvendt ved 4 °C.
- Før injektionen bringes pladen til stuetemperatur (RT).
- Hæld ~ 1 mL filter steriliseret 2% kvæg serum albumin (BSA) på pladen, vippe pladen til at sprede og dække hele bunden, og skyl med E3.
BEMÆRK: 2% BSA-opløsning kan filtreres steriliseres og opbevares som 1 ml aliquots ved -20 °C. 2% BSA-forbehandling forhindrer larver i at klæbe til overfladen af agarose. - Hæld E3 med buffer tricain på pladen og lad den sidde indtil injektion.
3. Zebrafisk larve hindbrain ventrikel mikroinjection
- Dechorionate larver manuelt med pincet ved 2 dpf i en petriskål.
BEMÆRK: Dechorionation kan udføres når som helst fra 1,5 dpf til injektionstidspunktet. - Fjern så meget E3 som muligt fra petriskålen og tilsæt buffered 300 μg/mL tricaine i E3 for at bedøve larver.
BEMÆRK: En stamopløsning med buffer 4 mg/mL tricain i E3 kan tilberedes og opbevares ved 4 °C. Arbejdsopløsningen kan laves ved at fortynde 4 ml af stamopløsningen op til 50 ml med E3. - Brug en mikroinjektionsopsætning, der følger med trykinjektoren, modtryksenheden, footswitch, micropipetteholder, mikromanipulator og et magnetisk stativ og en plade, der alle er forbundet med en trykluftkilde (Tabel over materialer).
- Åbn trykluftventilen, og tænd for mikroinjektoren. Indstil trykket til ~ 25 PSI, puls varighed til 60 ms, og backpressure enhed til 1 PSI.
- En mikroinjektionsnål indlæses med en mikrolæsserpipettespids(Materialetabel)med ca. 3-5 μL forberedt PBS eller sporeaffjedring med phenolrød. Monter nålen på mikromanipulatoren.
BEMÆRK: Mikroinjection nåle kan tilberedes som beskrevet tidligere23. Stereomikroskopet, der bruges til mikroinjections, skal have en reticle med øjestykket for at kalibrere mikroinjection nålen. Reticleen skal kalibreres med et fasemikrometer, og længden af reticleskalaen (μm) bestemmes. Diameteren af spore suspension dråbe, der skubbes ud af nålen måles afhængigt af antallet af hashes (af reticle), der overlapper med dråben. - Placer mikromanipulatoren, så nålens ende ses ved den laveste forstørrelse under stereomikroskopet. Zoom til 4x forstørrelse, holde nålen i betragtning.
- Brug skarpe pincet, klip enden af nålen. Tryk på injektionspedalen for at visualisere størrelsen på den dråbe, der kommer ud. Hold klipning tilbage, indtil ~ 3 nL spore suspension er injiceret (her, det er fem hashes).
- Flyt mikromanipulator og nål ud af vejen for at undgå ved et uheld at ramme nålen, mens larverne er arrangeret på injektionspladen.
- Hæld E3-Tricaine af injektionspladen, og overfør derefter ~ 24 bedøvede larver til injektionspladen med så lidt E3 muligt ved hjælp af en overførselspipet.
- Ved hjælp af et lille værktøj til at manipulere zebrafisklarver (dvs. hårsløjfeværktøj eller øjenvipperværktøj) arrangeres larverne i henhold til den retning, de vender i. Specifikt skal du placere alle mod højre i en række, og alle vender mod venstre i en række nedenfor.
BEMÆRK: Dette arrangement er svært, hvis der er for meget væske på pladen, da larverne vil "flyde" ud af sted. Men for lidt væske er også problematisk, hvis injektionerne tager lang tid, da larverne kan tørre ud eller anæstesi aftager. Således skal der lægges stor vægt på mængden af væske på pladen gennem hele mikroinjectionprocessen. - Juster mikroskopzoomet til den laveste forstørrelse. Bring mikromanipulatoren tilbage og arranger, så nålen er tæt på larverne, i en ~ 30 ° - 60 ° vinkel, midt i synsfeltet.
- Zoom ind på den højeste forstørrelse, og brug finjusteringsknapper til yderligere at justere nålens position. Kontroller, at der kommer ~30-70 sporer ud af nålen ved at injicere sporeaffjedringen i væsken på pladen ved siden af larverne. Juster om nødvendigt tiden og trykket på injektionsopsætningen.
BEMÆRK: Denne test skal gentages efter hver fem til seks larver, da antallet af sporer, der kommer ud af nålen, kan stige eller falde over tid. - Start med den række, hvor larverne vender mod nålen, flyt pladen, så nålen er direkte over og placeret nær de første larver.
- Flyt nålen med mikromanipulatoren, indsæt nålen gennem vævet omkring otic vesikel for at gennembore gennem i hindbrain ventrikel. Flyt pladen med den anden hånd efter behov for at få larvens rigtige retning med nålens vinkel.
- Kontroller visuelt, at enden af nålen er i midten af baghjernens ventrikel, tryk på fodpedalen for at injicere sporer og forsigtigt trække nålen tilbage.
BEMÆRK: Phenolrødt farvestof bør primært holde sig inden for baghjernens ventrikel. En lille mængde kan gå ind i mellemhjernen, men det bør ikke nå forhjernen eller uden for hjernen. Hvis det gør det, er det volumen, der injiceres, for stort, og trykket og tiden skal reduceres i overensstemmelse hermed, eller en ny nål skal kalibreres. - Bevæger sig ned pladen, injicere alle larverne i denne række. Drej derefter pladen rundt og injicere alle larver i den anden række.
BEMÆRK: Uden held injiceres eller ved et uheld beskadigede larver kan markeres med 1) injicere i æggeblommen et par gange for at skabe et rødt mærke eller 2) trække larven ud af rækken med nålen. - Flyt nålen op og ud af vejen igen. Zoom ud til en lavere forstørrelse på mikroskopet. Phenolrødt farvestof skal stadig være synligt i baghjernen i hver larve.
- Træk først væk med hårsløjfeværktøj og pipette op for at bortskaffe larver med mislykkede injektioner. Overfør de resterende larver til en ny petriskål ved at vaske dem af pladen med frisk steril E3 og en overførselspipet.
- Gentag efter behov for det ønskede endelige forsøgsprøvenummer.
- Skyl larver mindst 2x med E3 og sørg for genopretning fra anæstesi.
- For at kvantificere overlevelse uden yderligere behandling ved hjælp af en overførselspipette overføres larver til en 96 brøndplade (1 larve pr. brønd) i E3.
4. Etablering af injicerede og levedygtige sporenumre
- Umiddelbart efter injektionen vælger du ved hjælp af en overførselspipette tilfældigt omkring otte af de injicerede larver og overfører dem til 1,7 mL centrifugerør (en larve pr. Rør).
- Aflive larver med tricain eller ved at placere dem ved 4 °C i 0,5-2,0 timer.
- Der forberedes 1 ml 1 mg/mL ampicillin og 0,5 mg/mL kanamycin antibiotiske opløsninger i steril 1x PBS. Restopløsningen kan opbevares ved 4 °C og anvendes senere.
BEMÆRK: Stamopløsninger af ampicillin ved 100 mg/mL og kanamycin 50 mg/mL kan præstilles, filtreresiliseres og opbevares i aliquots ved -20 °C. Fortynd disse 100x i 1x PBS for at opnå arbejdsopløsningen. - Ved hjælp af en pipette fjernes så meget væske som muligt fra centrifugerøret, larven efterlades og tilsæt 90 μL af 1x PBS med antibiotika.
BEMÆRK: Antibiotika bruges til at forhindre bakterievækst i GMM plader, der kan forstyrre optællingen af Aspergillus kolonier. - Homogeniser larver i en vævslyser ved 1.800 svingninger/min. (30 Hz) i 6 min. Spin ned på 17.000 x g for 30 s.
- Label GMM plader (en plade pr homogeniserede larver). Ved hjælp af en Bunsen brænder til at skabe et sterilt miljø, pipette homogeniseret suspension fra et rør til midten af GMM plade, derefter spredes ved hjælp af en engangs L-formet spreder. Undgå at sprede homogenatet mod fælgen.
- Pladerne inkuberes på hovedet ved 37 °C i 2-3 dage, og antallet af dannede kolonier (CFU) tælles.
- For at måle antallet af sporer i live i infektionsperioden skal du plukke larver fra 96-brøndpladen ved 1-7 dage efter injektion (dpi) og overføre dem til centrifugerør. Aflive og homogenisere larver til at sprede sig på GMM plader som beskrevet i trin 4.1-4.5.
5. Lægemiddelbehandling af injicerede larver
- Efter afsnit 4 opdeles de resterende injicerede larver i to 3,5 mm retter: en til lægemiddelbehandlingen og en til kontrollen. Brug omkring 24 inficerede larver pr. Tilstand.
BEMÆRK: De 3,5 mm retter kan behandles med 2% fedtfri tør mælk i vand, skylles, lufttørres og opbevares på RT på forhånd. Belægning med mælk forhindrer larver i at klæbe til plasten. - Forbered den ønskede lægemiddelopløsning og køretøjet i E3 uden methylenblåt i koniske rør i henhold til den endelige koncentration, der kræves, og bland derefter godt. For eksempel at overvåge overlevelsen af larver, der udsættes for dexamethasone, skal du bruge 24 larver (replikater) til dexamethasone og 24 til køretøjskontrollen, såsom DMSO. Forbered 5 ml af lægemiddelopløsningen ved den krævede koncentration. Her blev der anvendt 5 ml 0,1% DMSO og 10 μM dexamethasone, og 24 larver/tilstand blev overført til ~200 μL af køretøjet/lægemiddelopløsningen/larverne.
- Fjern så meget væske som muligt fra en skål med en overførselspipette, og tilsæt forblandet E3, der indeholder køretøjskontrol. Gentag med forblandet E3, der indeholder behandling af interesse for den anden skål.
- Ved hjælp af en pipette overføres larver til 96 brøndplade (en larve pr. Brønd). Overvåg overlevelsen af injicerede larver, der udsættes for køretøjet eller lægemidlet i 7 dage.
BEMÆRK: Lægemidlet kan kun påføres på infektionsdagen og opbevares på larverne for hele eksperimentet eller kan opdateres dagligt.
6. Daglig billeddannelse af inficerede larver ved hjælp af zebrafisk Sårende og entrapment Enhed for vækst og imaging (zWEDGI)
- Sørg for, at larver behandles med 100 μM N-phenylthiourea (PTU) ved 24 hkf for at forhindre pigmentering, og at PTU holdes på larverne for hele forsøget.
BEMÆRK: PTU ved 75-100 μM forhindrer pigmentering af larver uden grove udviklingsdefekter24. PTU kan dog forstyrre nogle biologiske processer25, og forskere bør på forhånd afgøre, om stoffet kan påvirke eventuelle processer, der undersøges. - Inficere transgene larver med mærkede cellepopulationer af interesse ved 2 dpf med Aspergillus sporer konstrueret til at udtrykke et fluorescerende protein, som beskrevet i afsnit 3. Derefter overføres inficerede larver til brønde af en 48 brøndplade i ca. 500 μL/brønd af E3 uden methylenblåt.
BEMÆRK: En 48 brøndplade bruges her, fordi det er lettere at overføre larver ind og ud af under gentagen daglig billeddannelse. - På billeddannelsesdagen tilberedes to 3,5 mm petriskåle: en med 100 μM PTU og en med E3-tricain.
- Tilføj E3-tricain i kamrene på en zWEDGI-enhed26,27. Fjern luftbobler fra kamrene og fastholdelseskanalen ved hjælp af en P100-mikropipette under stereomikroskopet. Fjern alle overskydende E3-tricain, så det er det kun i kamrene.
- Pipetter en larve op fra pladen ved hjælp af en overførselspipette. Hvis der bruges meget væske til at fjerne det, pipettes i en 3,5 mm skål, der indeholder E3-PTU. Derefter pipette op igen, ved hjælp af så lidt væske som muligt, og overføre til E3-tricain.
- Vent ~ 30 s for bedøvelse, og overfør derefter til læssekammeret på sår- og fastklemningsenheden (f.eks. zWEDGI).
- Placer larven under stereomikroskopet. Brug P100 micropipette til at fjerne E3-tricain fra det sårende kammer og slip ind i læssekammeret for at flytte larvens hale ind i begrænsningskanalen. Sørg for, at larven er placeret på sin laterale, dorsale eller dorso-laterale side, så baghjernen kan afbildes med en omvendt objektiv linse.
- Billede larve med en konfokal mikroskop.
- Efter billeddannelse, med P100 pipetten, slip E3-tricaine ind i det sårende kammer for at skubbe larven fra fastholdende kanal ind i læssekammeret.
- Brug en overførsel pipette, afhente larven og overføre den tilbage til Petri parabol med E3-Tricaine. Brug så lidt væske som muligt, overfør den til petriskålen med E3-PTU. Skyl i PTU og overfør tilbage til 48 brøndpladen.
Representative Results
Efter mikroinjection af Aspergillus sporer ind i baghjernen af zebrafisk larver, infektion resultat kan efterfølges af flere assays, herunder overlevelse, CFUs, og levende billeddannelse. I en overlevelsesanalyse blev antallet af inficerede larver, der overlevede 1-7 dpi, overvåget. Da vilde larver blev efterladt ubehandlede, blev der observeret meget lidt død, hvor ~80%-100% af larverne overlevede hele eksperimentet (Figur 1). Hvis larverne var immunosuppressede, såsom ved udsættelse for kortikosteroide lægemidler dexamethasone (10 μM), blev der observeret signifikant nedsat overlevelse (Figur 1).
Da CFU'er blev kvantificeret gennem hele 7-dages eksperimentet fra vilde larver inficeret med A. fumigatussporer, blev der observeret vedvarende sporer med langsom clearance over tid (Figur 2A). Antallet af sporer, der overlevede ved 1, 2, 3, 5 og 7 dpi, blev normaliseret til antallet af sporer, der blev injiceret ved 0 dpi for at sammenligne persistens og frihøjde på tværs af replikater (Figur 2B).
Transgene fiskelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i leukocytter sammen med fluorescerende proteinudfoldende Aspergillus sporer, kan bruges til at visualisere både leukocyt rekruttering og adfærd samt svampespiring og vækst13. Da makrofager blev mærket (f.eks. Rekrutteringen af neutrofiler (Tg(lyz:BFP))blev typisk forsinket, primært efter svampespiring (figur 3A). Mens svampebyrden varede ved under hele forsøget i de fleste larver (figur 3A), blev rydningen observeret (Figur 3B). I nogle larver blev svampebyrden uden for baghjernen også observeret senere i infektion på grund af svampeformidling, sandsynligvis i makrofager.
Området omkring otic vesikel er et muligt sted, hvor denne udbredelse kan findes (Figur 3C). Disse observationer blev kvantificeret i flere individuelle larver i løbet af hele eksperimentet (Figur 4). Typisk blev spiring set i ~ 60% af larverne med 5 dpi (Figur 4A). Fagocytklyngeområdet, rekruttering af makrofag og rekruttering af neutrofiler varierer både over tid og på tværs af larver, hvor nogle trender op gennem hele eksperimentet, og nogle løser over tid (figur 4B, C, D).
Figur 1: Repræsentativ overlevelsesanalyse af inficerede larver. Aspergillus-inficeredelarver blev udsat for køretøjskontrol (DMSO) eller dexamethasone (Dex), og overlevelsen blev overvåget. Data repræsenterer tre grupperede replikater. Gennemsnitlige indsprøjtnings-CFU'er: DMSO = 30, Dex = 29 (p-værdi og fareforhold blev beregnet ved Cox proportional risikoregressionsanalyse, ****p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative CFU-optællinger fra individuelle inficerede larver umiddelbart efter injektion (0 dpi) og under infektionsforløb (2, 3, 5 og 7 dpi). Otte inficerede larver blev homogeniseret og belagt til at tælle CFU for hvert tidspunkt og replikere. (a)Eksempeldata fra én replikat. Hvert punkt repræsenterer en larve, søjler repræsenterer midler for hvert tidspunkt. (B) CFU-optællingerne blev normaliseret til CFU-antallet ved 0 dpi for hver replikat, og tre replikater blev samlet. Data blev sammenlignet mellem forsøgsbetingelser ved hjælp af variansanalyse og opsummeret i form af anslåede marginale midler og standardfejl. Asterix repræsenterer statistisk signifikans sammenlignet med CFU ved 0 dpi (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder fra infektionseksperimenter. PTU-behandlede larver med fluorescerende makrofager (mpeg1:H2B-GFP) og neutrofiler (lyz:BFP) blev injiceret med RFP-udtrykkende A. fumigatus. Levende, inficerede larver blev afbildet gentagne gange ved 2, 3 og 5 dpi på et konfokalt mikroskop. Maksimal intensitet Z-projektionsbilleder vises. Skemaer af larver angiver placeringen af billeddannelse for hvert panel. Alle skalastænger repræsenterer 100 μm, bortset fra de indsat skalastænger, som er 25 μm. (A) Billeder er fra en enkelt larve taget ved 2, 3 og 5 dpi, hvilket repræsenterer en typisk infektionsprogression. Insets viser svampespiring i dag 3 og 5. (B) Repræsentativt billede af delmængde af larver, der kan rydde infektionen, med lav svampebyrde og ikke meget betændelse ved 5 dpi. (C) Repræsentativt billede af delmængde af larver, hvor infektionen spredes ud af baghjernen på et senere tidspunkt. I dette billede kan svamp, makrofager og neutrofiler findes omkring og under otic vesikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ kvantificering af billeddiagnostiske eksperimenter. Billeder fra eksperimentel opsætning i figur 3 blev analyseret for svampespiring og leukocyt rekruttering. (A) Der blev scoret larver for tilstedeværelsen af spirede sporer hver dag, og procentdelen af larver med spiring blev beregnet. (B,C,D) Hver enkelt larve er repræsenteret som en anden farvelinje. Phagocyt klynge udseende og størrelse (B), makrofag rekruttering (C), og neutrofil rekruttering (D) blev fulgt i løbet af de 5 dages eksperiment for hver larve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Infektionsmodellen, der er beskrevet her, er gavnlig til analyse af værtens immunrespons, værtspatogeninteraktioner og svampepatogenese12,13,14,15. Disse oplysninger kan udledes af høj opløsning billeddannelse af fluorescerende-mærkede patogener og værtsceller13, larve overlevelse, og CFU persistens over tid.
Mikroinjection teknikken er afgørende for succes i denne protokol og kan være nødvendigt at justere, når du bruger forskellige mikroinjection udstyr og opsætninger. Især er trykket og tidspunktet for injektionen to store variabler og kan justeres for at sikre, at det volumen, der skubbes ud af nålen, er ~ 3 nL. Nålens størrelse som bestemt ved at klippe den med pincet regulerer også antallet af sporer, der injiceres; selv om en større åbning kan forårsage vævsskader på larven. På den anden side vil for lille en åbning ikke tillade de relativt store sporer (>2 μm) ud og kan føre til nålestop. Hvis dette sker, kan nålen reclipped at have en lidt større åbning.
Andre protokoller for mikroinjection af bakterier bruger PVP-40 til at hjælpe med at opretholde en homogen injektionsblanding, men vi har ikke fundet nogen fordel ved at bruge denne bærer med Aspergillus sporer. Tilstopning af nålen kan afbødes ved at hvirvle svampeforberedelsen grundigt for at bryde eventuelle klumper, før du lægger nålen. Nogle gange kan en tilstopning i nålen også løsnes ved midlertidigt at øge trykket eller injektionstiden og udløse mikroinjektoren, mens nålen er i væsken omkring larverne. Tryk- og injektionstiden skal derefter reduceres igen til tidligere niveauer. I andre tilfælde kan en træsko ikke fjernes, og en ny nål skal indlæses og kalibreres igen.
Denne protokol er designet til at injicere ~30-70 sporer pr. larve. Det er kendt, at baseret på koncentrationen af sporepræparatet og det injicerede volumen er dette tal ret lavt. Det er imidlertid empirisk konstateret, at dette er antallet af sporer, der injiceres under disse forhold. Hvorfor denne forskel opstår, er ukendt, men det kan skyldes spore klumper i nålen. Vores egne forsøg på at injicere et større antal sporer har stort set været forgæves.
For at sikre, at omkring 30-70 sporer injiceres og opretholder konsistensen af injektionerne i alle larverne, skal du kontrollere antallet af sporer ved at injicere på E3 omkring larverne. Gentag dette hver fem til seks larver gennem alle injektioner. Hvis sporantal synes at ændre sig, kan tryk- og/eller injektionstiden justeres for at injicere et ensartet antal sporer på tværs af flere larver. Det skal dog sørges for, at injektionsdosis forbliver primært i baghjernen og ikke fylder mellem- og forhjernen.
For at sikre en lokaliseret infektion skal sporeaffjedringen være indeholdt i baghjernens ventrikel. Dette kan visualiseres ved phenol rød farvning lige efter injektionen, selv om den røde farve diffunderer med tiden. Til injektioner anvendes regionen omkring otic vesikel til at gennembore og nå hjertekammeret i en vinkel på 45°-65°. Dette område har ingen vigtigste blodkar, forårsager mindre vævsskader, og heler øjeblikkeligt. Hvis huden over hjertekammer er gennemboret, spore suspension kan lækkes ud, fordi nålen, der skal bruges til Aspergillus spore injektioner er større end den, der bruges til bakterielle suspensioner. Forgæves injicerede eller utilsigtet beskadigede larver kan markeres ved at injicere i æggeblommen et par gange for at skabe et rødt mærke eller ved at trække larven ud af rækken med nålen. Når et sæt injektioner er afsluttet, skal disse larver fjernes og bortskaffes, før resten vaskes af pladen. E3 uden methylenblåt bruges til at bedøve larver før injektion og også holde larven efter injektionerne, fordi methylenblåt er anti-svampe.
På injektionstidspunktet repræsenterer CFU-tællinger antallet af levedygtige sporer i den inficerede vært. Men hvis sporerne spirer til hyphae, kan disse opdeles i separate levedygtige "svampeenheder" under homogenisering og kan give anledning til flere kolonier. Eller en ubrudt flercellet hypha kan give anledning til en enkelt koloni, hvilket resulterer i en gennemsnitlig, men upræcis, repræsentation af svampebyrden. Dette kan afbødes ved at kombinere CFU-tællingerne med langsgående mikroskopi af individuelle larver, som giver visuelle data om skæbnen for injicerede sporer.
Sammenlignet med pattedyrssystemet er zebrafisk larveinfektionsmodellen særlig vigtig på grund af dens optiske tilgængelighed. Rekruttering og reaktion af medfødte immunceller kan visualiseres i en levende intakt vært. Dette kan indarbejdes med genetisk eller kemisk hæmning af molekylære mål for at analysere, hvordan hvert mål påvirker makrofaget eller neutrofil reaktion mod Aspergillus sporer i et levende dyr.
Mens zebrafisk larve Aspergillus infektion model fortsætter med at være medvirkende til at beskrive forskellige aspekter af IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, der er andre områder af ekspansion. Fra værtssiden bruges det til at beskrive immunrespons på cellulært niveau, men dette kan udvides til at analysere immunmekanismer på molekylært niveau ved at kombinere det med målrettet morfolino, CRISPR, stabile mutantlinjer eller kemisk eksponering. En advarsel er, at homologer for alle kendte pattedyr medfødte immunvej komponenter ikke er blevet identificeret i zebrafisk.
Fra patogensiden er virulens af forskellige arter og stammer blevet beskrevet. En lovende vej for fremtidig forskning er brugen af mutante Aspergillus-stammer til at teste, hvordan specifikke gener eller proteiner bidrager som virulensfaktorer. Derved kan nye svampemedicin udvikles til at målrette disse proteiner. Nuværende anti-svampe medicin har lav effekt hos menneskelige patienter, og der er stigende resistens over for disse lægemidler hos svampe28. Denne in vivo model kan bruges til at undersøge, hvorfor disse lægemidler mislykkes, og som en mellemliggende model til at teste effekten af nye anti-svampe medicin. Samlet set kan resultaterne opdaget ved hjælp af denne model lette den fremtidige udvikling af effektive behandlinger for Aspergillus-inficeredepatienter.
Disclosures
Ingen konflikter eller økonomiske interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy and Infectious Diseases fra National Institutes of Health under Award Number K22AI134677. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P.
- Denning, D. W.
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
