Summary
Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.
Abstract
Mantener un proteomo saludable es esencial para la homeostasis celular y del organismo. La perturbación del equilibrio entre el control traslacional de proteínas y la degradación instiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad. La disminución de los mecanismos de control de calidad de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Los métodos bioquímicos para detectar la síntesis de proteínas de novo siguen siendo limitados, tienen varias desventajas y no se pueden realizar en células vivas o animales. Caenorhabditis elegans, siendo transparente y fácilmente modificado genéticamente, es un excelente modelo para monitorear las tasas de síntesis de proteínas mediante el uso de técnicas de imagen. Aquí, introducimos y describimos un método para medir la síntesis de proteínas de novo in vivo utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Los animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos específicos son irradiados por una poderosa fuente de luz que resulta en fotoblancarse de fluorescencia. A su vez, la evaluación de la recuperación de la fluorescencia significa una nueva síntesis de proteínas en células y/o tejidos de interés. Por lo tanto, la combinación de nematodos transgénicos, intervenciones genéticas y/o farmacológicas junto con imágenes vivas de las tasas de síntesis de proteínas puede arrojar luz sobre los mecanismos que median el colapso de la proteostasis dependiente de la edad.
Introduction
La síntesis y degradación de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Una multitud de enfermedades relacionadas con la edad son instigadas por la producción de proteínasdefectuosas 1,2. Con el fin de medir las tasas globales de traducción de proteínas, existen técnicas bioquímicas como el perfil ribosomal, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos contra ribosomas para monitorear la expresión, así como la nueva síntesis de proteínas3. Este método, además de ser una lectura indirecta de las tasas de traslación, ya que el aumento de la asociación de ARN a los ribosomas no significa necesariamente un aumento de la traducción, tiene desventajas técnicas, como un alto costo y un requisito de una gran cantidad de material de partida. Por otro lado, los métodos basados en proteómica permiten la cuantificación directa de proteínas mediante perfiles metabólicos de pulso seguidos de análisis de espectrometría de masas4,,5. Sin embargo, se trata de un enfoque semicuantitativo con resolución temporal limitada que no se puede utilizar fácilmente in vivo. Además, el etiquetado de la proteína puede distribuirse de manera desigual en el animal/tejido de interés. Es importante destacar que ambos métodos pueden ocultar variaciones específicas de los tejidos o de las células en las tasas de traducción de proteínas en animales o tejidos enteros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo fácil de usar que se puede cultivar en grandes cantidades6. Además, su sostenibilidad genética y transparencia permiten obtener imágenes en vivo in vivo. Este protocolo describe la metodología para detectar las tasas de síntesis de proteínas utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Aprovechamos la expresión transgénica de proteínas fluorescentes, ya sea en todo el organismo o en tejidos/células específicos. Los animales transgénicos pueden expresar la GFP utilizando el promotor de un gen, que se expresa ampliamente/globalmente o un promotor específico del tejido para atacar tipos celulares específicos. Esta técnica se puede extender a un promotor específico para examinar las tasas de síntesis de proteínas de una proteína específica.
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Protocol
NOTA: Tanto las fusiones transcripcionales como las traslacionales a fluoróforos se pueden utilizar para evaluar la traducción de proteínas de novo en varios tejidos. Las tasas de síntesis de proteínas se pueden evaluar para múltiples familias de proteínas que se localizan en diferentes compartimentos celulares, incluyendo citoplasma, mitocondrias y núcleo7. Las siguientes cepas se utilizan para monitorear las tasas de síntesis de proteínas globales y neuronales, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Mantenimiento, sincronización y preparación de nematodos transgénicos para el seguimiento de la síntesis de proteínas de novo
- Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de los nematodos transgénicos de tipo salvaje (wt) y mutantes.
- Día 1: Utilice una selección de gusano para seleccionar y transferir 10 larvas L4 de animales transgénicos wt y mutantes que llevan al reportero fluorescente deseado a placas de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli (OP50) (Tabla 1).
- Haga una elección de gusano colocando un alambre de platino en el extremo cónico de una pipeta Pasteur de vidrio fundiendo el vidrio en el sitio de contacto en un quemador Bunsen. A continuación, aplanar el extremo del alambre de platino en forma de espátula utilizando cualquier herramienta (por ejemplo, pinza o martillo ligero).
- Inocular una sola colonia de bacterias E. coli (OP50) en un matraz que contenga 50 ml de medio líquido luria-Bertani (LB) y crecer durante 10 horas a 37 oC en una incubadora de temblores (200 rpm; Tabla 1). A continuación, sembrar placas NGM con 200 l de cultivo bacteriano. Incubar las placas de semillas a temperatura ambiente durante la noche para permitir el crecimiento del césped bacteriano.
- Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 oC.
- Día 5: Las placas contienen una población mixta de gusanos transgénicos. Seleccione y transfiera 15 larvas L4 de cada cepa en placas OP50-NGM recién sembradas.
- Día 6: Realice el ensayo FRAP y monitoree la tasa de síntesis de proteínas el día 1 de la edad adulta.
- Preparar y utilizar cicloheximida que contenga placas NGM como control positivo:
NOTA: Preparar una solución en stock de cicloheximida diluyendo en agua a una concentración de 10 mg/ml. Mantener la solución de stock a 4oC.- Matar las bacterias exponiendo las placas NGM descongeladas durante 15 minutos con luz UV (222 s/cm de intensidad2).
- Añadir cicloheximida encima de placas de semillas bacterianas a 500 g/ml de concentración final en el volumen de agar.
- Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Transfiera los nematodos transgénicos que expresen psod-3GFP en el vehículo y las placas que contienen cicloheximida.
- Incubar animales durante 2 h a una temperatura estándar de 20oC.
2. Ensayo FRAP utilizando animales transgénicos que expresan reporteros de tejido somático pife-2GFP y psod-3GFP
NOTA: Monitoree la tasa global de síntesis de proteínas en todo el cuerpo animal. Estos reporteros transcripcionales presentan diferentes niveles de expresión y se expresan omnipresentemente en múltiples tejidos somáticos, incluyendo los músculos del intestino, la faringe y la pared corporal.
- Escoja y transfiera animales transgénicos adultos de 1 día a placas NGM individuales sembradas con una caída de 20 l de OP50 en el centro.
- Retire la tapa y coloque cada placa debajo de una lente objetivo 20x de un microscopio de epifluorescencia.
- Enfoque y capture una imagen de referencia antes de fotoblanchar (pre-blanqueo).
- Fotoblecir cada muestra durante 10 minutos.
NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente. - Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).
- Mantenga a los animales en placas NGM individuales y déjelos recuperarse.
- Imagen y registro de la recuperación de cada reportero fluorescente cada 1 hora durante al menos 6 horas a un estereomicroscopio de fluorescencia.
- Alternativamente, realice una evaluación de recuperación fluorescente utilizando un microscopio de epifluorescencia (por ejemplo, AxioImager Z2).
- Evaluar cuidadosamente la salud animal por animal mediante el seguimiento de su locomoción, sensibilidad al tacto, capacidad reproductiva y supervivencia durante los próximos 3 días. Los nematodos que mostraban signos de daño después de la fotoblancada fueron excluidos de un análisis posterior.
3. Montaje de las muestras y realizar el ensayo FRAP utilizando nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan neuronal, punc-119GFP
NOTA: Monitoree la síntesis de proteínas pan-neuronales mediante fotoblancarido dirigido en la región de la cabeza, donde se encuentra el anillo nervioso.
- Prepare almohadillas de agarosa del 2%.
- Agregue una gota de 10 l de tampón M9 al centro de la almohadilla de agarosa.
- Transfiera 5 nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan-neuronalmente en una gota de tampón M9.
- Use una pestaña para esparcir el líquido.
NOTA: Los animales muestran movimientos reducidos en 2 minutos debido a la absorción de M9 en el agar. - Cambie la posición del nematodo para evitar la superposición mediante el uso de un pico de "pestaña".
- Coloque la muestra bajo una lente objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia.
NOTA: No utilice un cubreobjetos. - Enfoque y capture una imagen de referencia (pre-blanqueo).
- Fotoblecar el área de interés objetivo durante 90 segundos.
NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente. - Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).
- Agregue una gota de 10 l de tampón M9 en nematodos fotoblanes.
- Dejar que los animales se recuperen durante 5 minutos.
- Utilice el pico "eyelash" o una pipeta para transferir los nematodos a placas NGM individuales sembradas con 20 l de OP50 en el centro.
- Capture una imagen de cada muestra cada 1 hora bajo un estereofonoscopio de epifluorescencia.
NOTA: Cuente t-0 para el tiempo de recuperación después de la fotoblancada.
4. Análisis de datos de la captura de imágenes durante el ensayo FRAP
- Analizar las imágenes adquiridas utilizando software (por ejemplo, Fiji).
- Abra imágenes con el software.
- Seleccione el comando Dividir canales a través del menú desplegable Imagen y color.
NOTA: Mantenga la imagen del canal verde. - Utilice la herramienta Selección a mano alzada para establecer manualmente la región fluorescente de interés (por ejemplo, todo el cuerpo, cabeza, intestino).
- Seleccione el comando Medición a través del menú desplegable Analizar para medir la intensidad media de píxeles del área de interés para cada punto de tiempo.
NOTA: El porcentaje de recuperación de fluorescencia se calcula utilizando las imágenes de referencia capturadas después de la fotoblancada.
5. Informe de análisis estadístico
- Utilice al menos 20 – 25 nematodos de cada cepa y/o condición.
NOTA: Se deben realizar tres réplicas biológicas. - Realice la prueba t delestudiante (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con P < 0.05 como significativo utilizando software de análisis estadístico.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento presentado aquí, se utilizaron nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutante que expresan los siguientes reporteros somáticos, pife-2GFP, psod-3GFP y punc-119GFP, para evaluar las tasas de síntesis de proteínas de acuerdo con los protocolos respectivos. Particularmente, los gusanos mutantes de tipo salvaje y ife-2 que expresan la GFP citoplasmática a través de sus tejidos somáticos mediante el uso del promotor ife-2 fueron comparados antes, inmediatamente después de la fotoblanqueo y 5 horas después de la recuperación. Las imágenes representativas y la cuantificación muestran que los animales de tipo salvaje se recuperan completamente, mientras que los mutantes ife-2 han disminuido la capacidad de recuperación (Figura 1A). Por lo tanto, los gusanos de tipo salvaje inician la biosíntesis de proteínas de novo después de la fotoblanqueo, mientras que los gusanos que carecen del factor de iniciación de la traducción de ARNm IFE-2 no pueden hacerlo, lo que indica que la tasa de recuperación de fluorescencia ilustra la tasa de síntesis de proteínas in vivo7. Además, la cicloheximida, un inhibidor específico de la traducción del ARNm, se puede utilizar como un control positivo para la inhibición de la traducción de proteínas. De hecho, los animales transgénicos tratados con cicloheximida que expresan la GFP citoplasmático bajo el promotor sod-3, no recuperan su fluorescencia al fotoblancarse(Figura 1B).
También aplicamos este método para detectar cómo los cuerpos de procesamiento de ARNm (cuerpos P) afectan a la tasa de traducción de proteínas8. Los nematodos mutantes de tipo salvaje y edc-3(ok1427) que expresaban GFP pan-neuronalmente fueron examinados para detectar su capacidad de recuperación tras la fotoblanqueo dirigida en la región principal. La recuperación de la fluorescencia es mucho más lenta en animales deficientes de la EDC-3 en comparación con el tipo salvaje(Figura 1C). Esto indica que la rotación de ARNm mediada por la EDC-3 dificulta la síntesis de proteínas novedosas y, en última instancia, suprime la iniciación de la traducción de proteínas9.
Figura 1: Evaluación in vivo de la síntesis de proteínas de novo en C. elegans. (A) Análisis FRAP tanto en tipo salvaje como en nematodos deficientes del IFE-2 que expresen la GFP citoplasma bajo el promotor de ife-2. Los animales transgénicos son sometidos a fotoblanchas de animales enteros. La señal GFP se reduce al 30-50% de la intensidad inicial. La fluorescencia se registra antes de la fotoblancada (pre-lejía), después del final del período de fotoblancaring (10 min; lejía) y 5 horas después de la recuperación. (B) El tratamiento con cicloheximida inhibe la recuperación de fluorescencia de animales transgénicos que expresan la GFP citoplasmático bajo el promotor de sod-3. Los animales transgénicos son sometidos a fotoblanchas de animales enteros. La señal GFP se reduce al 30-50% de la intensidad inicial. La fluorescencia se registra antes de la fotoblancada (pre-lejía), después del final del período de fotoblancar (10 min; lejía) y 5 horas después de la recuperación (A, B: microscopio AxioImager Z2; lente objetivo: 20x, apertura numérica 0.8; fuente de luz de alta potencia, HBO 100; lámpara de arco de mercurio de 100 vatios; conjuntos de filtros de excitación / emisión, Zeiss Set 38 Endow GFP shift free). Barras de escala, 500om. (C) Los nematodos deficientes EDC-3 muestran tasas de síntesis de proteínas de novo disminuidas en las células neuronales. La señal de fluorescencia de tipo salvaje y edc-3(ok1427) animales que expresan GFP citoplasmático pan-neuronal se mide antes del fotoblanqueo (pre-bleach), así como después del período de fotoblanqueo (90sec; lejía). Los animales transgénicos son sometidos a fotoblancar en la región de la cabeza (anillo nervioso). La señal GFP se reduce al 30-50% de la intensidad inicial (AxioImager Z2; lente objetivo: 40x, apertura numérica 0,75; 30% de potencia luminiscente de la fuente de iluminación fluorescente (Sistema de iluminación FI X-Cite 120 XL FL PC, lámpara de halogenuro de metal de 120W) e iris completamente abierto). La intensidad media de píxeles de la recuperación de fluorescencia se mide a intervalos de tiempo de una hora. 20 animales fueron cuantificados por cepa en cada uno de los tres experimentos independientes. Los datos representan la media S.E.M., ***P < 0.05, prueba tno parificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Receta | |
| 2% Almohadillas de Agaria | 1. Pesar 0,5 g o fagarosa en un vaso de precipitados de vidrio cilíndrico | |
| 2. Añadir 25 mL de tampón M9 | ||
| 3. Caliente en un microondas hasta que esté cerca de hervir. Sacar, remover con una punta de pipeta y hervir de nuevo. Repita hasta que la agarosa se disuelva. | ||
| 4. Coloque una corredera de microscopio vacía en el banco. | ||
| 5. Coloque una gota (50 l) de solución fresca de agarosa al 2% en el centro de la diapositiva. | ||
| 6. Tome una segunda diapositiva del microscopio y colóquela encima de la gota de agarosa. Presione suavemente hacia abajo para aplanar la gota. | ||
| 7. Deje que la agarosa se endurezca durante 30 segundos y retire suavemente la corredera del microscopio superior. | ||
| 8. Proceder inmediatamente con la preparación de la muestra, ya que las almohadillas de agarosa comenzarán a secarse en aproximadamente 5 minutos. | ||
| Consejo: Deje el portaobjetos superior como una cubierta para preservar la humedad durante más tiempo (1 hora). Por lo tanto, varias almohadillas de agarosa se pueden preparar y utilizar rápidamente durante los experimentos. | ||
| Medio líquido LB | 1. Disolver 10 g de Bactotryptone, 5 g de extracto de levadura de Bacto, 5 g de NaCl en agua destilada de 1 L y autoclave. | |
| Búfer M9 | 1. Disolver 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4y 5 g de NaCl en 1 L de agua destilada y autoclave. | |
| 2. Deje enfriar y agregue 1 mL de 1 M MgSO4 (estéril). | ||
| 3. Almacene el tampón M9 a 4 oC. | ||
| Placas de agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) | 1. Mezclar 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopeptona, 0,2 g de estreptomicina, 17 g de agar y añadir 900 ml de agua destilada. Autoclave. | |
| 2. Deje enfriar a 55-60 oC. | ||
| 3. Añadir 1 ml de solución de caldo de colesterol, 1 ml de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 ml de solución en stock de nistatina, 25 ml de tampón estéril de 1 M de fosfato, pH 6.0 y agua estéril destilada de hasta 1 L. | ||
| 4. Pipetear 10 mL de medio por plato de Petri y dejar solidificar. | ||
| 5. Almacene las placas a 4 oC hasta que se utilicen. | ||
Tabla 1: Recetas recomendadas para reactivos utilizados. Aquí se describen todas las recetas de reactivos utilizadas en el protocolo presentado.
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Discussion
La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. Estudios recientes revelan el hecho de que el equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento no es simplemente un subproducto del proceso de envejecimiento. En particular, los componentes básicos de la maquinaria de traducción, como el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E), que facilita el taponamiento del ARNm durante la iniciación a la traslación, y por lo tanto la tasa de traducción de proteínas dependiente de la tapa, induce el estrés oxidativo y acelera el proceso de envejecimiento1. Además, la EDC-3 específica de la neurona, que interactúa con los cuerpos de procesamiento de ARNm, los cuerpos P y aumenta la tasa de descatamiento del ARNm, también acelera el proceso de envejecimiento8. Específicamente, la supresión EDC-3 permite el secuestro de IFE-2 en cuerpos P, reduciendo en última instancia los niveles de traducción de proteínas, retrasando el envejecimiento neuronal9.
FRAP es una técnica desarrollada inicialmente para investigar la dinámica de proteínas, localización, interacciones y actividad con el etiquetado fluorescente no invasivo utilizando imágenes en vivo in vivo, por lo que es una poderosa herramienta para estudiar las tasas de síntesis de proteínas en tiempo real8,,10. Sin embargo, hay ciertos pasos críticos que requieren atención y solución de problemas. Proporcionamos soluciones alternativas a estos posibles obstáculos o limitaciones encontradas durante el procedimiento experimental.
Un problema se refiere al movimiento del gusano, ya que el gusano puede escapar de la fuente de luz durante el fotoblancado. Este problema se puede superar parcialmente mediante el uso de animales transgénicos que expresan el alelo rol-6(su1006), lo que hace que los animales se muevan de una manera sinusoidal. De esta manera, el fotoblanchado animal se puede realizar continuamente. Además, el experimentador puede seguir el movimiento del gusano que se mueve fuera del plano de visión mucho más lento. Sin embargo, las almohadillas de agar también se pueden utilizar como alternativa para inmovilizar completamente a los animales.
La duración óptima del fotoblancada es un factor crítico adicional que debe determinarse y mantenerse estable durante los experimentos. Se puede encontrar un fotoblanquido insuficiente debido a la fotoblancada no segmentada o a la corta duración. Esto se puede superar aumentando (a) el objetivo de aumento y la apertura numérica, (b) la intensidad de la luz y/o (c) la duración del fotoblanqueo.
Si no se detecta una recuperación significativa de la fluorescencia, hay parámetros potenciales que pueden ser alterados. Si el fotoblanquido es excesivo, reduzca la duración del fotoblancada a medida que se ha producido daño a la muestra. El daño al gusano se puede evaluar observando rasgos de la vida como la sensibilidad al tacto, la locomoción, la puesta de óvulos, el bombeo faríngeo y la capacidad reproductiva. Si la cinética de la recuperación de la traducción de proteínas es lenta, permita un período de recuperación más largo. La recuperación de la síntesis de proteínas varía entre diferentes familias de proteínas y depende de la longitud de las fusiones del reportero7.
La actividad del promotor podría influir en la cinética de la síntesis de proteínas. Si el promotor está inactivo durante la recuperación, cambie el promotor utilizado. La actividad del promotor puede verse alterada en condiciones de estrés, como fotodancia. Utilice promotores de actividad estables para monitorear globales (por ejemplo, let-858, ife-2, sod-3)o específicos del tejido (por ejemplo, músculos de la pared del cuerpo; myo-3, unc-54; faringe: myo-2; pan-neuronal: unc-119, rab-3; neuronas mecanosensoriales: mec-4; intestino: vha-6, ges-1) tasas de traducción de proteínas.
Si se produce una inhibición inadecuada de la traducción de proteínas por cicloheximida, aumentar el tiempo de pre-incubación de los nematodos superaría este problema. Una advertencia que debe tenerse en cuenta es el uso de gusanos transgénicos que sobreexpresan proteínas. El uso de nematodos transgénicos generados por CRISPR/Cas9 que expresen las proteínas modificadas fluorescentes de interés a nivel fisiológico proporcionará una imagen más precisa de la cinética proteica y la rotación.
Los niveles totales de proteínas detectados son el resultado de sus tasas de degradación y síntesis de proteínas. La degradación de las proteínas ocurre invariablemente a niveles basales en todas las células eucariotas. Por lo tanto, las tasas de recuperación de fluorescencia de proteínas, que se miden en este protocolo, no son absolutas sino relativas a las condiciones que se comparan. En esencia, se mide la recuperación de la fluorescencia en presencia de degradación de proteínas. Por lo tanto, se supone que todas las condiciones tienen tasas de degradación de proteínas iguales después de la fotoblancada. Con el fin de medir las tasas absolutas de traducción de proteínas, se deben utilizar cepas de gusanos mutantes deficientes en degradación de proteínas. Específicamente, las mutaciones en genes como el rpn-10 del proteosoma o el lgg-2 para la autofagia se pueden utilizar como control11. Alternativamente, se puede realizar un derribo de ARNi de proteínas proteasomales y autofágicas. Además, los sustratos autofágicos como SQST-1::GFP se pueden utilizar para detectar la contribución de la degradación autofágica en las condiciones experimentales seleccionadas12.
En ambos entornos experimentales, esta técnica FRAP es no radiactiva, no invasiva, que detecta las tasas de síntesis de proteínas de novo in vivo en diferentes tejidos de C. elegans. Permite la toma de imágenes en vivo antes y durante la fotoblancada en un entorno in vivo y el posterior monitoreo de los animales durante toda su vida útil. La perturbación de la iniciación a la traducción desacelera el envejecimiento, por lo tanto, la medición de las tasas globales de síntesis de proteínas por FRAP podría utilizarse como una lectura directa del proceso de envejecimiento. Este protocolo se puede optimizar y utilizar a mayor escala para detectar genes y/o productos químicos relacionados con el proceso de envejecimiento o la enfermedad relacionada con la edad. Alternativamente, las tasas de degradación de proteínas totales o específicas se pueden medir mediante fotoblancadas bajo diferentes orígenes genéticos utilizando el mismo protocolo en combinación con cicloheximida. Como la traducción de proteínas es inhibida por cicloheximida, se detectará la tasa de degradación de proteínas. Este protocolo ayudará a comprender mejor las vías de degradación de proteínas en los modelos genéticos de enfermedades de agregación de proteínas13.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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