Summary
Burada, de novo protein sentezini in vivo değerlendirmek için, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası nematod Caenorhabditis elegans ve floresan kurtarma kullanan radyoaktif olmayan ve noninvaziv bir yöntem sınıyoruz ve tanımlıyoruz. Bu yöntem, protein sentezinin yeni modülatörlerini belirlemek için genetik ve/veya farmakolojik ekranlar ile kombine edilebilir.
Abstract
Sağlıklı bir proteom bakımı hücre ve organizmahomestaz için gereklidir. Protein çevirikontrolü ile bozulma arasındaki dengenin bozulması yaşa bağlı çok sayıda hastalığı teşvik eder. Proteostaz kalite kontrol mekanizmalarının azalması yaşlanmanın bir özelliğidir. De novo protein sentezini saptamak için biyokimyasal yöntemler hala sınırlıdır, çeşitli dezavantajları vardır ve canlı hücrelerde veya hayvanlarda yapılamaz. Caenorhabditis elegans, şeffaf ve kolayca genetiği değiştirilmiş olmak, görüntüleme teknikleri kullanarak protein sentezoranlarını izlemek için mükemmel bir modeldir. Burada, fotobleaching (FRAP) sonrası floresan kurtarma kullanarak vivo de novo protein sentezini ölçmek için bir yöntem tanıtmak ve tanımlamak. Belirli hücre veya dokularda floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvanlar floresan fotobeyazrlama ile sonuçlanan güçlü bir ışık kaynağı tarafından ışınlanır. Buna karşılık, floresan kurtarma değerlendirilmesi hücre ve / veya ilgi dokularda yeni protein sentezi anlamına gelir. Bu nedenle, transgenik nematodların, genetik ve/veya farmakolojik müdahalelerin birleşimi ve protein sentezoranlarının canlı görüntülenmesi yaşa bağlı proteostazın çöküşüne aracılık eden mekanizmalara ışık tutabilir.
Introduction
Protein sentezi ve bozulma organizmahomestazis için gereklidir. Yaşa bağlı hastalıkların çok sayıda kusurlu protein üretimi 11tarafındanteşvik edilir ,2. Küresel protein çeviri oranlarını ölçmek için, ribozomal profilleme gibi biyokimyasal teknikler vardır, hangi ribozom korumalı mRNA parçalarıderin sıralama içeren ifade izlemek için yanı sıra yeni protein sentezi3. Bu yöntem, ribozomlara artan RNA ilişkisi mutlaka artan çeviri anlamına gelmez gibi, çeviri oranları dolaylı bir okuma olmanın yanı sıra, yüksek maliyet ve başlangıç malzeme büyük miktarda bir gereklilik gibi teknik dezavantajları vardır. Öte yandan, proteomik tabanlı yöntemler nabız metabolik profilleme ile doğrudan protein nicelliği için izin kitle spektrometresi analizi4,5. Ancak, bu kolayca in vivo kullanılamaz sınırlı zamansal çözünürlüğe sahip yarı-nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, proteinin etiketlenmesi ilgi hayvan /doku eşit olmayan dağıtılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntemlerin her ikisi de dokuya özgü veya hücreye özgü protein çeviri oranlarındaki değişimleri tüm hayvanlarda veya dokularda gizleyebilirsiniz.
Caenorhabditis elegans çok sayıda yetiştirilebilir kolay kullanımlı bir model organizmadır6. Ayrıca, genetik amenability ve şeffaflık vivo canlı görüntüleme için izin verir. Bu protokol, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası floresan geri kazanımını kullanarak protein sentezoranlarını saptamak için yapılan metodolojiyi açıklamaktadır. Floresan proteinlerin transgenik ekspresyonundan yararlanıyoruz, ya tüm organizmada ya da belirli dokularda/hücrelerde. Transgenik hayvanlar, yaygın olarak ifade edilen bir genin promoter'ı kullanarak GFP'yi ifade edebilir veya belirli hücre tiplerini hedeflemek için dokuya özgü bir organizatör olabilir. Bu teknik belirli bir proteinprotein sentez oranlarını incelemek için belirli bir organizatör genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Florofororlara hem transkripsiyonel hem de çevirifüzyonu çeşitli dokularda de novo protein çevirisini değerlendirmek için kullanılabilir. Protein sentezi oranları, sitoplazma, mitokondri ve nükleus7gibi farklı hücresel bölmelerde lokalize olan birden fazla protein ailesi için değerlendirilebilir. Aşağıdaki suşlar küresel ve nöronal protein sentezi oranlarını izlemek için kullanılır, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. De novo protein sentezinin izlenmesi için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
- Yabani tip (wt) ve mutant transgenik nematodların gelişim evrelerini ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
- 1. Gün: Escherichia coli (OP50)(Tablo 1)ile tohumlanmış Nematode Büyüme Medya (NGM) plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan wt ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvasını seçmek ve aktarmak için solucan toplama kullanın( Tablo 1).
- Bir Bunsen brülör üzerinde temas yerinde cam eriterek bir cam Pasteur pipet konik ucuna platin tel takarak bir solucan almak olun. Daha sonra, platin telin ucunu herhangi bir alet (örn. kıskaç veya hafif çekiç) kullanarak spatula şekline düzleştirmek.
- E. coli (OP50) bakterisinin tek bir kolonisini 50 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortam içeren bir şişeye dönüştürün ve sallayarak kuvözde 37 °C'de 10 saat büyüyün (200 rpm; Tablo 1). Daha sonra, bakteri kültürü 200 μL ile tohum NGM plakaları. Bakteri çim büyüme sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede tohumlu plakalar kuluçka.
- Kuluçka ve 20 °C standart sıcaklıkta nematodlar büyümek.
- 5. Gün: Plakalar karışık bir transgenik solucan popülasyonu içerir. Taze tohumlu OP50-NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın.
- 6. Gün: FraP tayini yapın ve yetişkinliğin birinci gününde protein sentezhızını izleyin.
- Ngm plakaları içeren siklohekmidi olumlu kontrol olarak hazırlayın ve kullanın:
NOT: Siklohekmidin stok çözeltisini suda 10 mg/mL konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Stok çözeltisi 4 °C'de tutun.- Uv ışığı (222 μW/cm2 yoğunluk) ile tohumlu NGM plakalarını 15 dakika teşhir ederek bakterileri yok edin.
- Agar hacminde 500 μg/mL son konsantrasyona bakteriyel tohumlu plakaların üstüne siklohekmid ekleyin.
- Tabakların oda sıcaklığında 30 dakika kurumasını bekleyin.
- Araç ve siklohekmid içeren plakalarda psod-3GFP ifade eden transgenik nematodların transferi.
- 20 °C standart sıcaklıkta 2 saat kuluçka hayvanları.
2. FRAP tsöjen somatik doku muhabirleri pife-2GFP ve psod-3GFP ifade transgenik hayvanlar kullanarak
NOT: Tüm hayvan vücudunda küresel protein sentezhızını izleyin. Bu transkripsiyonel muhabirler farklı ifade düzeyleri mevcut ve her yerde birden fazla somatik dokularda ifade edilir, bağırsak da dahil olmak üzere, farinks ve vücut duvarı kasları.
- 1 günlük yetişkin transgenik hayvanları, merkezde 20°L OP50 damlası ile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına toplayıp aktarın.
- Kapağı çıkarın ve her plakayı bir epifloresan mikroskobunun 20 x objektif lensin altına yerleştirin.
- Fotobeyaztlama (ön beyazlatma) yapmadan önce bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın.
- Photobleach her örnek için 10 dakika.
NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir. - Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
- Hayvanları tek tek NGM plakalarında tutun ve onları kurtarın.
- Her floresan muhabirin iyileşmesini en az 6 saat boyunca floresan stereomikroskopta görüntüleyin ve kaydedin.
- Alternatif olarak, bir epifloresan mikroskobu kullanarak floresan kurtarma değerlendirmesi yapın (örneğin, AksiyoImager Z2).
- Önümüzdeki 3 gün boyunca hayvan sağlığını hareket, dokunma hassasiyeti, üreme kapasitesi ve sağkalım larını izleyerek hayvan başına sağlık durumunu dikkatle değerlendirin. Fotobeyaztlama sonrası hasar belirtileri gösteren nematodlar ileri analizdışı bırakıldı.
3. Örneklerin montajı ve pan-nöronal sitoplazmaik GFP, punc-119GFP ifade transgenik nematodlar kullanarak FRAP analizi gerçekleştirmek
NOT: Sinir halkasının bulunduğu baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama ile pan-nöronal protein sentezini izleyin.
- % 2 agarose pedleri hazırlayın.
- Agarose pedin ortasına 10 μL'lik bir M9 arabelleği ekleyin.
- Transfer 5 transgenik nematodlar m9 tampon bir damla içine pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade.
- Sıvı yaymak için bir kirpik kullanın.
NOT: Hayvanlar agar içine M9 emiciliği nedeniyle 2 dakika içinde azaltılmış hareketleri görüntüler. - Bir "kirpik" çekme kullanarak çakışma önlemek için nematod konumunu değiştirin.
- Örneği epifloresan mikroskobunun 40 x objektif lensin altına yerleştirin.
NOT: Kapak kayması kullanmayın. - Bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın (çamaşır suyu).
- Photobleach 90 saniye için ilgi hedeflenen alan.
NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir. - Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
- Fotobeyaztlı nematodlara 10 μL'lik m9 tamponu ekleyin.
- Hayvanlar 5 dakika lığına iyileşsin.
- Nematodları merkezde 20 μL OP50 damlaile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına aktarmak için "kirpik" pick veya pipet kullanın.
- Epifloresan stereomikroskop altında her 1 saatte bir her numunenin görüntüsünü yakalayın.
NOT: Fotobeyaztlama dan sonraki iyileşme süresi için t=0'ı sayın.
4. FRAP tahlil sırasında yakalanan görüntülerin veri analizi
- Edinilen görüntüleri yazılım (örneğin, Fiji) kullanarak analiz edin.
- Yazılımla görüntüleri açın.
- Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin.
NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın. - Floresan bölgeyi (örn. tüm vücut, baş, bağırsak) manuel olarak ayarlamak için Freehand Selection aracını kullanın.
- Her zaman noktası için ilgi alanının ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için Analyze açılır menüsünden Ölçüm komutunu seçin.
NOT: Floresan geri kazanım yüzdesi fotobeyazlama sonrası çekilen referans görüntüleri kullanılarak hesaplanır.
5. Rapor istatistiksel analiz
- Her bir suş ve/veya koşulda en az 20 - 25 nematod kullanın.
NOT: Üç biyolojik kopya yapılmalıdır. - P < 0.05 ile istatistiksel analiz için istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedür kullanılarak, protein sentez oranlarını ilgili protokollere göre değerlendirmek için aşağıdaki somatik muhabirleri ifade eden yabani tip ve mutant transgenik nematodlar, pife-2GFP, psod-3GFP ve punc-119GFP kullanılmıştır. Özellikle ife-2 promotörü kullanılarak somatik dokularında sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve ife-2 mutant solucanlar fotobeyaztlama dan hemen sonra ve 5 saat iyileşme sonrası karşılaştırıldı. Temsili görüntüler ve niceleme, yabani tip hayvanların tamamen iyileştiğini, ife-2 mutantlarının ise iyileşme kapasitesinin azaldığını göstermektedir(Şekil 1A). Böylece, yabani tip solucanlar fotobeyazlatma sonrası de novo protein biyosentezini başlatırken, mRNA çeviri başlatma faktörü IFE-2'den yoksun solucanlar bunu yapamıyorlar, floresan iyileşme oranının in vivo7'dekiprotein sentezoranını gösterdiğini belirten. Ayrıca, mRNA çevirisinin spesifik bir inhibitörü olan siklohekmid, protein çeviri inhibisyonu için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Gerçekten de, siklohekamid ile tedavi transgenik hayvanlar sod-3 organizatörü altında sitoplazmik GFP ifade, fotobeyazrlama üzerine floresan kurtarmak yok (Şekil 1B).
Ayrıca bu yöntemi, mRNA işleme cisimlerinin (P cisimlerinin) protein çevirisi oranını nasıl etkilediğini tespit etmek içinuyguladık 8. GFP pan-nöronsal olarak ifade eden yabani tip ve edc-3 (ok1427) mutant nematodlar, baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama sırasında iyileşme kapasiteleri incelendi. Floresan geri kazanımı, EDC-3 eksikliği olan hayvanlarda yabani tipe göre çok daha yavaştır(Şekil 1C). Bu, EDC-3 aracılı mRNA cirosunun yeni protein sentezini engellediğini ve sonuçta protein çevirisi başlatmayı bastırdığını gösterir9.
Şekil 1: C. elegansde novo protein sentezinin in vivo değerlendirilmesi . (A) FRAP analizi hem vahşi tip hem de IFE-2 eksik nematodlarda ife-2'ninorganizatörü altında sitoplazmik GFP'yi ifade eder. Transgenik hayvanlar tüm hayvan fotobeyazlasyonuna maruz kalınır. GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun %30-50'sine düşürülür. Floresan fotobeyazrlama (ön beyazlatma), fotobeyazrlama süresi (10 dakika; çamaşır suyu) ve 5 saat sonrası kurtarma sonundan önce kaydedilir. (B) Siklohekamid tedavisi, sod-3'ünorganizatörü altında sitoplazmik GFP ifade eden transgenik hayvanların floresan iyileşmesini inhibe eder. Transgenik hayvanlar tüm hayvan fotobeyazlasyonuna maruz kalınır. GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun %30-50'sine düşürülür. Floresan fotobeyazrlama (ön ağartıcı) önce kaydedilir, fotobeyazrlama süresi nin bitiminden sonra (10 dk; ağartıcı) ve 5 saat sonrası kurtarma (A, B: AxioImager Z2 mikroskop; objektif lens: 20x, sayısal diyafram 0.8; yüksek güçlü ışık kaynağı, HBO 100; 100 Watt cıva lambası; excitation / e filtermission setleri, Zeis Sets 38 Shift serbest GFP) sonra. Ölçek çubukları, 500μm. (C) EDC-3 eksik nematodlar nöronal hücrelerde azalmış de novo protein sentez oranlarını gösterir. Pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve edc-3 (ok1427) hayvanların floresan sinyali fotobeyazrlama (ön beyazlatma) önce yanı sıra fotobeyazrlama dönemi (90sec; çamaşır suyu) aşağıdaki ölçülür. Transgenik hayvanlar baş bölgesinde fotobeyaznmaya maruz (sinir halkası). GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun %30-50'sine (AksiyoImager Z2; objektif lens: 40x, sayısal diyafram 0.75; floresan aydınlatma kaynağının %30 parlak gücüne (FI aydınlatma Sistemi X-Cite 120 XL FL PC, 120W metal halogenide lamba) ve tamamen açılmış iris'e indirgenir. Floresan kurtarmanın ortalama piksel yoğunluğu bir saatlik zaman aralıklarında ölçülür. Üç bağımsız deneyin her birinde 20 hayvan her bir zorlanma başına ölçüldü. Veriler, S.E.M., ***P < 0.05, eşleşmemiş t-testi anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Tarifi | |
| %2 Agarose pedleri | 1. Tartmak 0.5 g o fagarose silindirik cam bir kabın içinde | |
| 2. 25 mL M9 arabellek ekleyin | ||
| 3. Kaynamaya yakın kadar bir mikrodalga Da ısıtın. Alın, bir pipet ucu ile karıştırın ve tekrar kaynatın. Agarose eriyene kadar tekrarlayın. | ||
| 4. Tezgahüzerine boş bir mikroskop slayt yerleştirin. | ||
| 5. Slaytın ortasına %2'lik taze agarose çözeltisi damlatın (~ 50 μL). | ||
| 6. İkinci bir mikroskop slayt alın ve agarose damla üstüne yerleştirin. Yavaşça damla düzleştirmek için aşağı basın. | ||
| 7. Agarose 30 saniye sertleşsin ve yavaşça üst mikroskop slayt kaldırın. | ||
| 8. Agarose pedleri yaklaşık 5 dakika içinde kurumaya başlayacağından, numune hazırlamaya hemen devam edin. | ||
| İpucu: Nemi daha uzun süre korumak için üst mikroskop kaydıraktan daha uzun süre (~ 1 saat) bir kapak olarak bırakın. Böylece, çeşitli agarose pedleri hazırlanabilir ve deneyler sırasında hızla kullanılabilir. | ||
| LB sıvı orta | 1. Çözün10 g Bactotryptone, Bacto Maya Ekstresi 5 g, NaCl 5 g 1 L distile su ve otoklav. | |
| M9 arabellek | 1. Çözün3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, ve 5 g NaCl 1 L distile su ve otoklav. | |
| 2. Soğumaya bırakın ve 1 M MgSO4 (steril) 1 mL ekleyin. | ||
| 3. M9 tamponu 4 °C'de saklayın. | ||
| Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları | 1. Mix 3 g NaCl, 2.5 g bactopeptone g, 0.2 g streptomisin, 17 g agar ve distile su 900 mL ekleyin. Otoklav. | |
| 2. 55-60 °C'ye soğumaya bırakın. | ||
| 3. 1 mL kolesterol stok çözeltisi, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4,1 mL nystatin stok çözeltisi, 25 mL steril 1 M fosfat tampon, pH 6.0 ve 1 L'ye kadar distile steril su ekleyin. | ||
| 4. Pipet Petri çanak başına orta 10 mL ve katılaşmak için bırakın. | ||
| 5. Plakaları kullanılana kadar 4 °C'de saklayın. | ||
Tablo 1: Kullanılan reaktifler için önerilen tarifler. Sunulan protokolde kullanılan tüm reaktif tarifleri burada özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein sentezi modülasyonu organizmahomeostaziçin gereklidir. Yaşlanma sırasında, küresel yanı sıra spesifik protein sentezi tedirgin. Son çalışmalar protein çeviri dengesinin yaşlanmayı doğrudan kontrol ettiğini ve yaşlanmanın sadece yaşlanma sürecinin bir yan ürünü olmadığını ortaya koymaktadır. Özellikle, ökaryotik inisiyasyon faktörü 4E (eIF4E) gibi çeviri makinelerinin temel bileşenleri, çeviri başlatma sırasında mRNA kapamasını kolaylaştırır ve böylece kap-bağımlı protein çevirisi oranı oksidatif strese neden olur ve yaşlanma sürecini hızlandırır1. Ayrıca, nöron özgü EDC-3, mRNA işleme organları ile etkileşime giren, P organları ve mRNA decapping oranını artırır, ayrıca yaşlanma sürecini hızlandırır8. Özellikle, EDC-3 bastırma P organları içine IFE-2 sekestrasyon sağlar, sonuçta protein çeviri düzeylerini azaltarak, nöronal yaşlanma geciktirme9.
FRAP başlangıçta protein dinamikleri araştırmak için geliştirilen bir tekniktir, lokalizasyon, etkileşimler ve non-invaziv floresan etiketleme ile aktivitesi vivo canlı görüntüleme kullanarak, gerçek zamanlı protein sentezi oranlarını incelemek için güçlü bir araç yapma8,10. Ancak, dikkat ve sorun giderme gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Deneysel prosedür sırasında karşılaşılan bu olası engellere veya sınırlamalara alternatif çözümler sunuyoruz.
Bir konu solucan fotobeyaztma sırasında ışık kaynağı kaçabilirsiniz gibi solucan hareketi ile ilgilidir. Bu sorun, hayvanların sinüzoidal bir şekilde hareket etmesini sağlayan rol-6(su1006) alelini ifade eden transgenik hayvan kullanılarak kısmen aşılabilir. Bu şekilde hayvan fotobeyazlatma sürekli olarak yapılabilir. Ayrıca, deneyci görüş düzleminin dışında hareket eden solucanın hareketini çok daha yavaş takip edebilir. Yine de, agar pedleri de tam hayvanları hareketsiz hale getirmek için bir alternatif olarak kullanılabilir.
Fotobeyaztma en uygun süre, deneyler boyunca belirlenip sabit tutulması gereken ek bir kritik faktördür. Hedeflenmemiş fotobeyazrlama veya kısa süreli nedeniyle yetersiz fotobeyazrlama ile karşılaşılabilir. Bu, (a) büyütme amacı ve sayısal diyafram açıklığı, (b) ışık yoğunluğu ve/veya (c) fotobeyaztlama süresini artırarak aşılabilir.
Önemli bir floresan kurtarma algılanmazsa, değiştirilebilen potansiyel parametreler vardır. Fotobeyaztma aşırı ysa, numune hasarı meydana geldikçe fotobeyazrlama süresini azaltın. Solucanın hasarı dokunma hassasiyeti, hareket, yumurtlama, faringal pompalama ve üreme kapasitesi gibi yaşam özellikleri gözlemlenerek değerlendirilebilir. Protein çevirisi kurtarma kinetiği yavaş ise, daha uzun iyileşme süresi sağlar. Protein sentezi kurtarma farklı protein aileleri arasında değişir ve muhabir füzyonuzunluğu7 bağlıdır.
Organizatör aktivitesi protein sentezinin kinetik etkileyebilir. Organizatör kurtarma sırasında etkin değilse, kullanılan organizatörü değiştirin. Organizatör aktivitesi, fotohasar gibi stres koşullarında değiştirilebilir. Küresel (örneğin let-858, ife-2, sod-3)veya dokuya özgü (örn. vücut duvarı kasları; myo-3, unc-54; yutak: myo-2; pan-nöronal: unc-119, rab-3; mechanosensory nöronlar: mec-4; bağırsak: vha-6, ges-1) protein çeviri oranları.
Siklohekdim ile yetersiz protein çevirisi inhibisyonu oluşursa, nematodların kuluçka öncesi süresini artırmak bu sorunun üstesinden gelecektir. Dikkate alınması gereken bir uyarı, proteinleri aşırı ifade eden transgenik solucanların kullanımıdır. CRISPR/Cas9 tarafından üretilen transgenik nematodların fizyolojik seviyelerde floresan etiketli proteinleri ifade etmesi protein kinetik ve cirosunun daha doğru bir resmini sağlayacaktır.
Saptanan toplam protein düzeyleri protein yıkımı ve sentez oranlarının bir sonucudür. Protein yıkımı her zaman tüm ökaryotik hücrelerde bazal seviyelerde meydana gelir. Bu nedenle, bu protokolde ölçülen protein floresan geri kazanım oranları mutlak değil, karşılaştırılan koşullara göredir. Özünde, protein yıkımı varlığında floresan kurtarma ölçülür. Bu nedenle, tüm koşulların fotobeyazlasyon sonrası eşit protein yıkım oranlarına sahip olduğu varsayılır. Mutlak protein çeviri oranlarını ölçmek için protein bozunması-eksik mutant solucan suşları kullanılmalıdır. Özellikle, proteozom veya lgg-2'nin rpn-10 gibi genlerdeki mutasyonlar kontrol11olarak kullanılabilir. Alternatif olarak proteazomal ve otophagic proteinlerin RNAi nakavtı yapılabilir. Ayrıca, SQST-1:::GFP gibi otophagic substratlar12seçilen deneysel koşullar altında otophagic bozulmanın katkısını tespit etmek için kullanılabilir.
Her iki deneysel ortamda da frap tekniği radyoaktif olmayan, invaziv olmayan, C. elegans farklı dokularda in vivo de novo protein sentez oranlarını algılar. Bu önce ve bir in vivo ortamda fotobeyazrlama sırasında canlı görüntüleme ve tüm yaşam ları boyunca hayvanların sonraki izleme sağlar. Çeviri başlatma nın pertürbasyonu yaşlanmayı azaltır, dolayısıyla FRAP ile küresel protein sentezi oranlarının ölçülmesi yaşlanma sürecinin doğrudan okunması olarak kullanılabilir. Bu protokol, yaşlanma süreci veya yaşla ilgili hastalıklarla ilgili genleri ve/veya kimyasalları taramak için optimize edilebilir ve daha büyük ölçekte kullanılabilir. Alternatif olarak, toplam veya spesifik protein yıkım oranları siklohekamid ile birlikte aynı protokol kullanılarak farklı genetik arka planlar altında fotobeyazrlama ile ölçülebilir. Protein çevirisi siklohekamid tarafından inhibe edildiği için protein yıkım ı saptanacaktır. Bu protokol protein toplama hastalıklarının genetik modellerinde protein yıkım yollarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Acknowledgments
Chaniotakis M. ve Kounakis K.'ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği'nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı'nın bağışları ile finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N.
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
