Summary
Vi beskriver en enkelt-molekyle tilgang til antigen-antistof affinitet målinger ved hjælp af masse fotometri (MP). MP-baserede protokol er hurtig, præcis, bruger en meget lille mængde materiale, og kræver ikke protein modifikation.
Abstract
Målinger af specificiteten og affiniteten af antigenantistofinteraktioner er af afgørende betydning for medicinske og forskningsprogrammer. I denne protokol beskriver vi implementeringen af en ny enkeltmolekyleteknik, massefotometri (MP), til dette formål. MP er en etiket- og immobiliseringsfri teknik, der registrerer og kvantificerer molekylære masser og populationer af antistoffer og antigen-antistofkomplekser på et enkelt molekyleniveau. MP analyserer antigen-antistof prøven inden for få minutter, giver mulighed for præcis bestemmelse af den bindende affinitet og samtidig give oplysninger om støkiometri og oligomeric tilstand af proteiner. Dette er en enkel og ligetil teknik, der kræver kun picomole mængder af protein og ingen dyre forbrugsstoffer. Den samme procedure kan anvendes til at studere proteinproteinbinding for proteiner med en molekylmasse på over 50 kDa. For multivalente proteininteraktioner kan tilhørst af flere bindingssteder opnås i en enkelt måling. Men, enkelt-molekyle form for måling og den manglende mærkning pålægger nogle eksperimentelle begrænsninger. Denne metode giver de bedste resultater, når den anvendes til målinger af sub-mikromolar interaktion tilhørsforhold, antigener med en molekylær masse på 20 kDa eller større, og relativt rent protein prøver. Vi beskriver også proceduren for udførelse af de nødvendige tilpasnings- og beregningstrin ved hjælp af grundlæggende dataanalysesoftware.
Introduction
Antistoffer er blevet allestedsnærværende værktøjer molekylærbiologi og anvendes i udstrakt grad i både medicinske og forskning applikationer. Inden for medicin er de af afgørende betydning inden for diagnostik, men deres terapeutiske anvendelser udvides også, og der udvikles hele tiden nyeantistofbaserede behandlinger 1,2,3,4. De videnskabelige anvendelser af antistoffer omfatter mange uundværlige laboratorieteknikker såsom immunfluorescens5,immunoprecipation6,flow cytometri7, ELISA, og vestlige blotting. For hver af disse anvendelser er det af afgørende betydning at opnå nøjagtige målinger af antistoffets bindende egenskaber, herunder bindende affinitet og specificitet.
Siden den første kommercielle overflade plasmon resonans (SPR) instrument blev indført i 1990, optiske biosensorer er blevet "guld standard" af antistof karakterisering, men andre teknikker, herunder ELISA, er også rutinemæssigt anvendes til at måle antistof tilhørsforhold8,9. Disse metoder kræver normalt immobilisering eller mærkning af de analyserede molekyler, som potentielt kan påvirke samspillet mellem interesse. De er også relativt langsomme, involverer flere analysetrin, før resultaterne kan indsamles til dataanalyse. En nyligt udviklet enkelt-molekyle metode, masse fotometri (MP), registrerer molekyler direkte i opløsning, når de lander på overfladen af mikroskopet coverslip10,11. Den lyssprændebaserede optiske detektion, som MP anvender, kræver ikke mærkning eller modifikation af protein. Individuelle proteinmolekyler registreres af det interferometriske spredningsmikroskop som mørke pletter, der optræder i billedet (Figur 1D), og flere tusinde molekyler kan detekteres under den et minuts dataindsamling12. Signalet fra hver enkelt partikel kvantificeres, og kontrastværdien (relativt mørke) beregnes. De interferometriske kontrastværdier er proportionale med proteinernes molekylære masser, hvilket gør det muligt at identificere bundne og frie arter i antigen-antistofblandingen. Samtidig måler MP ved at tælle molekylære landingshændelser direkte arternes populationer. Dette giver MP-baserede metoder en unik evne til selvstændigt at kvantificere tilhørsforhold til flere bindende websteder.
Binding af antigenet (Ag)molekyler til de to bindingssteder for det intakte antistof (Ab) kan beskrives som:
med ligevægtsfræsekonstanterne Ka1 og Ka2 defineret som:
hvor ci og fi repræsenterer henholdsvis koncentration og brøkdel af komponenten i. Den samlede antigenkoncentration (cAg)kan udtrykkes som:
Da de samlede koncentrationer af antistoffet (cAb)tot og antigen (cAg)tot er kendt, kan denne ligning anvendes til direkte at montere de eksperimentelle komponentfraktioner, der er fremkommet ved mp-målingerne, og beregne ligevægtskonstanterne Ka1 og Ka2 (se supplerende oplysninger).
MP-dataene kan også bruges til at anslå samarbejdet mellem de to antistofbindingssteder11. For to antistof paratoper med identiske mikroskopiske bindings konstanter, de statistiske faktorer, der beskriver processen med befolkningen i Ab· Ag og Ab· Ag2 komplekser dikterer, at den tilsyneladende makroskopiske ligevægt konstanter Ka1 og Ka2 vil ikke være numerisk lige, og Ka1 = 4Ka2. Forsøgsværdierne for Ka1 < 4Ka2 indikerer derfor positiv samarbejdsvillighed mellem de to antistofbindingssteder. På samme måde angiver Ka1 > 4Ka2 negativ samarbejdsvillighed.
MP målinger af antigen-antistof bindende affinitet er hurtige og kræver en lille mængde materiale. De MP-massefordelinger, der anvendes til beregninger af ligevægtskonstant, giver yderligere oplysninger om prøveegenskaberne og gør det muligt at vurdere prøvens renhed, oligomerisering og aggregering i et enkelt eksperiment. Den samme metode kan bruges til at måle høj affinitet protein-protein bindende, og MP er især nyttig til undersøgelser af multi-valent protein interaktioner. Multi-protein komplekser har normalt store molekylære masser, optimal for MP detektion, og enkelt-molekyle data kan bruges til at måle støkiometri og beregne tilhørsforhold af flere bindende steder samtidigt. Disse oplysninger er normalt vanskelige at opnå ved hjælp af bulk-baserede metoder.
Uden ændringer er den nuværende protokol velegnet til målinger af relativt høj affinitet, submikromolære interaktioner med antigener af en molekylmasse på 20 kDa eller større. For at opnå optimale resultater bør proteinlagrene være af høj renhed, men der er ingen specifikke bufferkrav. Ved hjælp af MP kan antigenantistofbindingen vurderes på mindre end fem minutter. Den dataindsamling og analyse, der kræves til nøjagtige Kd beregninger kan udføres inden for 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered strømningskamrene
- Rengør glasdækslerne
- Vaskflasker med destilleret vand, ethanol og isopropanol skylles de 24 mm x 50 mm dækslæd i følgende rækkefølge: vand, ethanol, vand, isopropanol, vand. Tør dækslerne med en strøm af rent kvælstof. Det er vigtigt at skylle dækslerne fra top til bund og holde det nederste hjørne med soft-tippede fakmenter. Dækslingen tørres i samme retning for at undgå at overføre forurening fra snævlerne (figur 2A).
- På samme måde skylles dækslerne på 24 mm x 24 mm med destilleret vand, ethanol og destilleret vand. Tør dækslerne med en strøm af rent kvælstof.
- Identificer dækslæbets arbejdsside, anbring en dråbe destilleret vand på overfladen af den rene dækslæb, og følg trin 3.1-3.2 i protokollen. Normalt er det kun den ene side af dækslerne på 24 mm x 50 mm, der har den optiske kvalitet, der er egnet til MP-målinger.
BEMÆRK: Efter at have fokuseret, bør ingen væsentlige overflade mangler kan påvises, og "signal" værdi vist i dataindsamlingen software bør være mindre end 0,05% (Figur 1A-C). Arbejdssiderne af alle dækslæber i kassen er orienteret i samme retning. Den samme procedure bør anvendes til at teste effektiviteten af dækslæbet rengøring.
- Saml strømningskammeret
- Placer dækslingen på 24 mm x 24 mm på et stykke aluminiumsfolie. Anbring strimler af dobbeltsidet tape oven på dækslæbet på 24 mm x 24 mm som vist i figur 2B, og skær tapen langs glassets kant. Adskå dækslrækket fra aluminiumsfolien og fastgør den til arbejdssiden af dæksækslip'en på 24 mm x 50 mm (Figur 2C).
BEMÆRK: Kanalstørrelsen kan variere, men en bredde på 3 mm-5 mm anbefales. Bredere kanaler kræver større prøvemængder, og meget smalle kanaler kan være svære at indlæse. Normalt kan to parallelle kanaler nemt oprettes på 24 mm x 24 mm dækslæbet. Protokollen kan sættes på pause her.
- Placer dækslingen på 24 mm x 24 mm på et stykke aluminiumsfolie. Anbring strimler af dobbeltsidet tape oven på dækslæbet på 24 mm x 24 mm som vist i figur 2B, og skær tapen langs glassets kant. Adskå dækslrækket fra aluminiumsfolien og fastgør den til arbejdssiden af dæksækslip'en på 24 mm x 50 mm (Figur 2C).
2. Klargør antistofantigenprøverne til affinitetsmålingerne
- Filter mindst 2 ml AF PBS-bufferen ved hjælp af 0,22 μm sprøjtefiltre for at fjerne støvpartikler eller aggregater. Centrifuge proteinmassen i 10 minutter ved bordpladecentrifugens maksimale hastighed (ca. 16.000 x g).
BEMÆRK: PBS er den anbefalede buffer for denne protokol, men MP har ingen særlige bufferkrav, og andre biologiske buffere kan også accepteres. Høje glycerolkoncentrationer (>10%) og meget lave ioniske styrker (saltkoncentration <10 mM) kan påvirke billedet og datakvaliteten og anbefales ikke. - De faktiske koncentrationer af antistof- og antigenbestandene bestemmes ved at måle deres UV-absorbans på 280 nm.
- Målekoncentrationerne af antigen-antistofblandingen beregnes. Hvis den anslåede værdi af antistofbindende tilhørsforhold ikke er kendt, planlægges det at forberede en prøve med 30 nM-antigen og 20 nM-antistofkoncentration. Når den omtrentlige affinitet er kendt, skal antistoffet til antigenforholdet og koncentrationerne af det skal optimeres i henhold til de forventede Kd-værdier. Den samlede antigenkoncentration i blandingen svarer til summen af den forventede Kd og den samlede antistofkoncentration i ligningen nedenfor. Hvis man antagerKd1 = Kd2 for antistoffets to paratoper, vil dette resultere i sammenlignelige koncentrationer af det frie antistof og antistofantigenkomplekserne i prøven.
Antistofkoncentrationen justeres for at holde den samlede proteinkoncentration i prøven inden for 10 nM- og 50 nM-området. De bedste resultater opnås ved hjælp af blandinger med antistofkoncentrationer mellem 5 nM og 25 nM.
BEMÆRK: MP registrerer proteiner med en molekylmasse større end 40 kDa. Derfor kan prøvekoncentrationer af antigener med en molekylmasse på mindre end 40 kDa overskride den typiske grænse på 50 nM. Ved koncentrationer på over ca. 100 nM kan selv lav molekylær masseantigener imidlertid påvirke billedkvaliteten og nøjagtigheden af Kd-bestemmelsen. - Der tilberedes 50 μL af antistofantigenblandingen ved den endelige målekoncentration beregnet i trin 2.3.
BEMÆRK: Der kræves kun én prøve af antigenantistofblandingen til bestemmelsen af Kd. Men, forberede flere prøver med forskellige antigen til antistof nøgletal kan hjælpe med at optimere prøvekoncentrationen. Hvis der indsamles data fra flere prøver, kan de analyseres via en global pasform. - Antigen-antistofblandingen inkuberes i ca. 10 min ved stuetemperatur, så den bindende reaktion kan opnå kemisk ligevægt. Undgå unødigt lange inkubationstider.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere afhængigt af bindingskinetik. For at bekræfte, at den kemiske ligevægt er nået, kan prøvemålingerne gentages ved forskellige inkubationstider. Time-invariant Kd værdier indikerer tilstrækkelig lang inkubation. Langvarig inkubation kan føre til signifikant protein adsorption til overfladen af plast labware og dermed til betydelige fejl i proteinkoncentration bestemmelse. Af denne grund anbefales laboratorieartikler med lav friktion kraftigt til MP-prøveforberedelse13.
3. Indsamle massefotometri data
- Påfør en dråbe mikroskop nedsænkningsolie på MP instrumentet objektivet og placere den samlede flow kammer på mikroskop fase. Sørg for, at olien spænder over afstanden mellem dækslet og målet.
- Læg flowkammeret i, og fokuser massefotometeret.
- Der deponeres 10 μL ren, filtreret bufferopløsning i den ene ende af flowkammerets kanal, der er forberedt i trin 1. Væske vil komme ind i kanalen ved kapillær handling.
- Juster scenens Z-position for at fokusere mikroskopet på arbejdsfladen på 24 x 50 mm dækslæbet.
- Brug knapperne Op og ned i fokuskontrol under fanen Fokuskontrol i dataindsamlingssoftwaren til at foretage de første justeringer.
- Klik på knappen Skarphed for at få vist udlæsningen af skarphedssignalet og bruge justeringsknapperne Op og Ned for at maksimere skarphedens værdi.
- Klik på knapperne Angiv fokus og Lås fokus for at aktivere funktionen til fokussporing. Et korrekt fokuseret billede (Figur 1A,C)skal have "signalværdien" under 0,05 %.
BEMÆRK: Hvis "signalværdien" ved den maksimale skarphedsposition er over 0,05 %, kan det indikere urenheder på glasoverfladen eller i bufferen.
- Ved hjælp af den samme kanal skal der indlæses 20 μL af antistofantigenprøven ved at deponere den på den ene side af kanalen og blotting væsken fra den anden ende med et lille stykke blotting papir (Figur 2D).
BEMÆRK: Lydstyrken på en 3-5 mm bred kanal er ca. 10 μL. Det anbefales at udskifte den buffer, der findes i kanalen, fuldstændigt og for at undgå fortynding af prøverne. - Når du har indlæst eksemplet, skal du straks klikke på knappen Optag for at starte dataindsamlingen og hente en 100 s video ( Figur1D).
- I slutningen af dataindsamlingen skal du angive filnavnet og klikke på OK for at gemme datafilen.
- Kassér dækslæberne, og tør olien af objektivet med bomuldsoptiske svaberprøver vådt med isopropanol.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
4. Analysér mp-dataene
- Betyr den indsamlede videofil ved hjælp af MP-databehandlingssoftwaren for at identificere landingshændelserne.
- Brug menuindstillingen Filer/Åbn til at indlæse filen til analysen, og klik på Analysér.
- Klik på knappen Indlæs for at indlæse kalibreringsfunktionen, og gem de analyserede data ved hjælp af menupunktet Filer/Gem resultater som.
- Den molekylære massefordeling monteres med gaussiske funktioner for at opnå relative koncentrationer af hver art i prøven. Denne analyse kan udføres ved hjælp af en fælles videnskabelig grafsoftware (se Tabel over materialer).
- Importer filen "eventsFitted.csv" ind i softwaren, og plot den molekylære massefordeling (kolonne M i .csv-filen) ved hjælp af funktionen Plot/Statistik/Histogram.
- Dobbeltklik på histogrammet for at åbne vinduet Plotegenskaber. Deaktiver automatisk placering, og vælg en placeringsstørrelse på 2,5 kDa. Klik på knapperne Anvend og Gå for at oprette data om placeringscentre og optællinger.
- Vælg kolonnerne Placeringscentre og Optællinger, og brug menufunktionen Analyse/Toppe og Grundlinje/Flere spidsbelastningsformat til at passe til histogrammet med gaussiske funktioner. Dobbeltklik for at angive de omtrentlige spidsbelastningspositioner på distributionsplottet, og klik derefter på knappen Åbn NLFit.
- Kontroller de faste afkrydsningsfelter for "xc" peak centre og indstille deres værdier til de forventede molekylære masser af det frie antistof og enkelt og dobbelt antigen-antistof komplekser. Markér indstillingen Del for breddeparametrene. Klik på knappen Tilpas. De gaussiske bestanddelenes højdeshøjdeværdier repræsenterer den relative koncentration af hver art iprøven 11.
BEMÆRK: Placeringsstørrelsen kan justeres for at optimere massefordelingsafbildningens opløsning. MP-præcisionsgrænsen er ca. 1 kDa, og mindre placeringsstørrelser kan forstærke støjen fra fordelingen, uden at der afsløres yderligere oplysninger. Meget store bin størrelser vil skjule de fine detaljer i massefordelinger.
- Koncentrationsfraktionen for hver art beregnes ved hjælp af følgende ligning:
hvor hi- og fi-værdierne repræsenterer tophøjder og koncentrationsfraktioner af det frie antistof og det enkelt- og dobbeltbundne antistof i prøven.
5. Beregn ligevægtskonstante værdier
- Koncentrationsfraktionerne af interaktionsarten beregnet i trin 4.3 monteres med Eq. 1 og 2 ved hjælp af en egnet analysesoftware. Her demonstrerer vi en metode til at beregne ligevægtskonstanter ved hjælp af etregnearksprogram 14 (se Supplerende oplysninger).
- Åbn regnearket "Kd calculation.xlsx" . I dette regneark kan celleværdierne i række 1 til 10 fremhævet med gult ændres for at udføre beregningerne af ligevægtskonstanter.
- Indtast de estimerede Kd-værdier i nanomolarenheder i cellerne B1 og B2 i tabellen. Disse startværdier optimeres i tilpasningsproceduren. Hvis de estimerede Kd-værdier ikke er kendte, skal standardværdierne i cellerne B1 og B2 være uændrede.
- Indtast værdierne af (cAb)tot og (cAg)tot i nanomolarenheder i cellerne D2 og E2. Angiv de brøkværdier, der er beregnet i trin 4.3, i cellerne F2, G2 og H2. Hvis der blev målt flere prøver i forskellige koncentrationsforhold, kan der indføres yderligere koncentrationsværdier for disse prøver i række 2 til 10.
- Vælg menufunktionen Data/Problemløser. Skriv "$B$15" i feltet "Angiv målsætning" og "$B$1:$B$2" i feltet "Ved at ændre variable celler:". Vælg alternativknappen Min for indstillingen Til: . Markér afkrydsningsfeltet Gør ikke-ubegrænsede variabler ikke-negative, og vælg GRG Nonlinear som løsningsmetode. Klik på knappen Løs. De bedst egnede Kd1- og Kd2-værdier vises i celle B1 og B2 og den endelige sum af kvadrerede fejl i celle B15.
BEMÆRK: Hvis funktionen Problemløser ikke er aktiv, skal du vælge Indstillinger under menuen Filer i regnearksprogrammet. Vælg tilføjelsesprogrammet Problemløser under tilføjelsesprogrammerne i kategorien Tilføjelsesprogrammer, og klik på knappen Gå. Markér afkrydsningsfeltet Tilføjelsesprogrammet Problemløser, og klik på OK.
Figur 1: Massefotometribilleder. (A) Repræsentativt oprindelig visningsbillede af billedbufferen, der er indsamlet på en ren dæksletogb) på en dækslet med overfladefejl. c) Differential ratiometrisk billede af billedbufferen ogd) AHT· HT-løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MP flow kammer forberedelse og lastning. a) Dækslæbholdningsposition til rengøringsproceduren. (B)Justering af 24 x 24 mm dækslæbet (mellemlag) og det dobbeltsidede bånd (øverste lag) på overfladen af aluminiumsfolie (nederste lag, ikke vist). Blå stiplede linjer viser placeringen af afskårne linjer. (C) Top- og sidevisning af det samlede strømningskammer med to prøvekanaler og et billede af det samlede strømningskammer. d) Procedure for prøvebelastning i en flowkanal, der tidligere var fyldt med buffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere undersøgt samspillet mellem humane α-thrombin (HT) og mus monoklonale anti-human trombin antistof (AHT) ved hjælp af MP baseret assay11. Da den molekylære masse af HT (37 kDa) er under 40 kDa-detektionsgrænsen, kan den maksimale prøvekoncentration overstige 50 nM MP-koncentrationsbegrænsningen uden at påvirke massefordelingens opløsning negativt. Forsøget var planlagt som en titrering serie med AHT antistof på en fast 25 nM koncentration, og HT ved koncentrationer på 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM og 120 nM. Figur 3 viser de molekylære massefordelinger af antigenantistofblandingerne og antistofprøven. Her analyserer vi dataene ved hjælp af den metode, der er beskrevet i protokollen. En videnskabelig grafsoftware blev brugt til at passe massedistributionerne med tre gaussiske komponenter, der repræsenterer den frie AHT, AHT· HT og AHT· HT2. De kendte molekylære masseværdier for de tre komponenter blev fastsat, og der blev monteret en enkelt parameter med spidsbredde for de tre arter. Parametrene for den bedst egnede tophøjde for de gaussiske komponenter blev normaliseret ved hjælp af Eq. 3 for at opnå arternes koncentrationsfraktioner (tabel 1). Disse værdier blev sammen med den samlede antistof- og antigenkoncentration for hver prøve indført i "Kd-beregningen.xlsx". Den globale pasform i regnearket giver Kd1 = 40 nM (68,3% konfidensinterval: 28 nM, 68 nM) og Kd2 = 28 nM (68,3% konfidensinterval: 17 nM, 45 nM). De eksperimentelle koncentrationsfraktioner og fit-resultaterne afbildes i figur 4. De afsmeltningskonstante værdier, der opnås her ved montering af de integrerede koncentrationsfraktioner, er i overensstemmelse med dem, der tidligere er opnået ved direkte montering af MP-fordelinger, og med dissociationskonstanteværdier opnået ved Isotermisk Titrering Calorimetry (ITC)11.
Figur 3: MP molekylær massefordelinger af 25 nM AHT blandet med HT ved henholdsvis 0, 7,5, 15, 30, 60 og 120 nM (A-F). Sorte prikker viser de eksperimentelle MP-data afbildet med 2,5 kDa bin størrelse. Cyan, grøn og blå linjer repræsenterer de bedst egnede gaussiske fordelinger af det frie antistof, enkeltbundet antistof og dobbeltbundne antistofarter. Røde linjer viser summen af de tre gaussiske komponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Brøkdele af den frie AHT (blå), AHT· HT (rød) og AHT· HT2(sort) som funktion af HT-koncentration. Point repræsenterer eksperimentelle værdier opnået ved gaussisk montering af MP-fordelingerne. Faste linjer repræsenterer den bedst egnede ved hjælp af Eq. 1 og Eq. 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tekniske replikater af AHT-målingerne for molekylmassefordeling. Plots viser reproducerbarheden af MP målinger og renheden af antistof præparat. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 7.50E-09 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1.50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
Tabel 1: Normaliserede tophøjder for gaussiske komponenter, der fremkomnes ved montering af mp-fordelingerne (figur 3).
Supplerende oplysninger: Implementering af ligevægt konstanter montering procedure i Excel og Affinity beregning regneark. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Massefotometri baseret protokol skitseret her giver en hurtig og præcis metode til måling af antigen-antistof bindende tilhørsforhold. MP-analyse bruger en meget lille mængde materiale, og yderligere oplysninger, herunder støkiometri, oligomerisering og renhed , kan vurderes ud fra de samme data (Figur 5). Uden ændringer gælder denne metode for målinger af dissociationskonstanter i ca. 5 nM til 500 nM-området og for ligandmolekyler med molekylmasse på ca. 20 kDa eller større. Den samme protokol kan ikke kun bruges til at analysere antigen-antistofbindingen, men også til at måle proteinproteininteraktion tilhørsforhold, når den molekylære masse af mindst en af bindingspartnerne er større end 50 kDa. Da MP-detektionen ikke er specifik, kan MP-målinger ikke udføres på prøver, der indeholder en høj koncentration af bæreproteiner eller store molekylære masseurenheder.
SPR er almindeligt anvendt til karakterisering af antigen-antistof binding, og direkte sammenligning af begge metoder kan hjælpe med analysen udvælgelse. I sammenligning med SPR, MP bindende analyse er hurtigere og kræver ikke protein immobilisering. For en typisk bindende eksperiment, MP kræver mindre materiale end SPR. MP data afslører støkiometri af de komplekser, som ikke er let tilgængelige fra SPR10,11. Kinetiske bindingsparametre kan fås ved henvendelse til MP-data13, men SPR måler de bindende kinetik direkte og er i stand til at måle en bredere vifte af tilknytnings- og dissociationsrater. Tilknytningskonstanterne for to separate bindingssteder kan kun fås ved hjælp af SPR-dataene, når tilknytnings- og dissociationsraterne for begge lokaliteter er tilstrækkeligt forskellige. På den anden side kan MP præcist karakterisere molekylære komplekser med flere bindende steder10,11. SPR er i stand til at måle bindende affinitet for små molekylære masseligands, og MP fungerer bedst for ligaander med molekylmasse på ca. 20 kDa eller større.
Indsamling af MP-data af god kvalitet er et vigtigt skridt i at opnå nøjagtige resultater fra denne protokol. Urenheder i bufferen eller på overfladen af dækslerne vil forstyrre MP dataindsamling. Forkert fokusering forvrænger MP-signalet, hvilket fører til fejl i molekylmasseestimater og balancekonstanter. Begge disse faktorer bør undersøges, når protokollen foretages fejlfinding. En vigtig overvejelse ved arbejde med lavkoncentration proteinopløsninger er, at overflade adsorption kan føre til tab af materiale og ændringer i prøvekoncentrationen. De resulterende fejl kan minimeres ved hjælp af lav adsorption labware og ved at anvende overflade passivation. For at opnå nøjagtige resultater er det vigtigt at tillade, at alle proteinfortyndinger og blandinger når kemisk ligevægt, men unødigt lange inkubationstider bør undgås. For hvert proteinsystem anbefales det, at satserne for det ikke-specifikke protein, der binder sig til coverslipglasset, vurderes ud fra MP-dataene. Hvis der observeres væsentligt forskellige satser for forskellige arter, kan mp-data nemt korrigeres for at undgå potentielle fejl i Kd-beregningerne 10,11.
Der bør tages hensyn til flere faktorer, når der planlægges forberedelse af stikprøven. Der kan opnås nøjagtige resultater ved måling af en enkelt prøve, men antigen- og antistofkoncentrationerne skal justeres for at opnå en sammenlignelig koncentration af den frie og bundne art. En analyse af en enkelt massefordeling , der domineres af en af reaktionsarterne , kan give acceptable Kd-værdier skøn , men giver normalt relativt store monteringsfejl11. En alternativ strategi omfatter en global analyse af titreringsdata. Det regnearkssoftwarebaserede tilpasningsværktøj, der leveres med denne protokol, kan bruges til montering af både individuelle data og til global analyse. Hvis et enkelt eksperiment eller datasæt analyseres, kan konfidensintervallerne for parametrene for den bedste tilpasning estimeres ved hjælp af fejlprojektionsmetoden. En detaljeret beskrivelse af konfidensintervallernes beregningsprocedure i regnearkssoftwaren findesandetsteds 14. Ved udformningen af analysen anbefales det at planlægge replikerede eksperimenter. Når data fra replikerede eksperimenter analyseres, kan standardafvigelsen bruges til at rapportere fejl i Kd-værdierne.
Den protokol, der er beskrevet her, kan ændres for at udvide dens anvendelighed ud over de typiske molekylære masse- og affinitetsområdebegrænsninger. Rækken af målbare tilhørsforhold er begrænset af proteinkoncentrationsområdet, der er tilgængeligt for MP, typisk fra 10 nM til 50 nM. Dette område kan udvides, og proteinprøver i koncentrationer under 10 nM kan måles ved hjælp af perfunderes flowceller og længere dataindsamlingstider. Proteinprøver ved højere koncentrationer kan potentielt måles ved hjælp af passivede dækslip til MP-målingerne. For antigener med en lille molekylær masse vil det frie antistof og antigen-antistofkompleksets toppe i MP-massefordelingerne være uløste. Dette udelukker brugen af den gaussiske topmonteringsanalyse, der er beskrevet i protokollen. I så fald kan den bindende affinitet stadig måles ved at titrere antistoffet med antigenet og i gennemsnit foretage MP-fordelingerne for at opnå den gennemsnitlige molekylære masse af alle arter for hver prøve. Bindingsligningen kan derefter være egnet til disse data for at opnå antigenantistofbindingen11.
Når der ikke kræves nøjagtige affinitetsoplysninger, kan protokollen forenkles og bruges til hurtig screening for antistofinteraktion. I så fald kan de kommercielt tilgængelige pakningsbeholdere anvendes i stedet for prøvekanaler for yderligere at forenkle forsøgsproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Keir Neuman for hans kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af den intramurale program af NHLBI, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Rosenberg, M. I. Protein Analysis and Purification. , Birkhauser. Basel. (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
