Summary
リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。リンパ浮腫の慢性マウステールモデルと、尾部への遺伝的貨物輸送のための組織ナノトランスフェクション技術(TNT)の新しい使用について述べています。
Abstract
リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。影響を受けた四肢は、体液、脂肪、線維症の蓄積のために拡大する。この病気の治療法はありません。尾のベース付近での皮膚の焦点全体の切除を用いたマウステールモデルは、尾の腫脹をもたらし、リンパ浮腫を研究するために使用されてきた。しかし、このモデルは、血管を含み、結果的に尾壊死および早期の尾の腫脹分解能をもたらし、その臨床的翻訳性を制限する。慢性マウス尾リンパ浮腫モデルは、15週間にわたって持続的なリンパ浮腫と尾部への信頼性の高い灌流を誘発する。従来のマウス尾リンパ浮腫モデルの強化には、1)外科顕微鏡を用いた正確な全厚切除およびリンパ切開、2)高分解能レーザースペックルを用いた術後動脈および静脈灌流の確認、および3)インドシアニングリーン近赤外レーザーリンパ管造影を用いた機能評価が含まれる。また、新しい非ウイルス、経皮的、マウス尾脈管構造への遺伝的貨物の焦点送達のために組織ナノトランスフェクション技術(TNT)を使用しています。
Introduction
リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。影響を受けた四肢は、体液、脂肪、線維症の蓄積のために拡大する。リンパ浮腫は、世界中で2億5000万人の人々に影響を与えます2,3,4.乳癌、黒色腫、婦人科/泌尿器腫瘍、肉腫などの固形悪性腫瘍の治療を受ける患者の20〜40%がリンパ浮腫2、4、5を発症すると推定される。リンパ浮腫による罹患率は、再発性感染、疼痛、および変形6を含む。この進行性の生涯にわたる病気の治療法はありません。現在の治療法はvariaby有効7であり、理学療法士による完全な鬱血療法、切除処置、および血管導入リンパ節移移およびリンパバイパス7、8、9、10、11、12、13、14を含む微小手術を含む。リンパ浮腫の理想的な治療法はまだ発見されていません。
リンパ浮腫のメカニズムと治療の研究は限られています。リンパ傷害15、16の後に1年の平均遅延発症があり、放射線および手術で気球原性侮辱を経験するほとんどの個人はリンパ浮腫4、6、17を発症しない。イヌ、ヒツジ、ブタなどの大型動物モデルは18、19、20と記載されていますが、マウステールモデルは容易さ、コスト、再現性のために最も広く適用されています。リンパ浮腫を調査するためのマウスモデルは、尾型モデル、ジプテリア毒素媒介性リンパ切除、腋窩または亜素リンパ節解剖21、22、23、24、25、26を含む。ほとんどのテールモデルは、尾部22の基部付近で行われるリンパ管切り抜きを伴う焦点的な完全な皮膚切除を使用し、ヒトリンパ浮腫24、27、28、29に似た尾の腫脹および組織学的特徴をもたらす。しかし、標準的なマウステールモデルは、通常、わずか20日で自発的に解決し、周期的尾壊死30を伴う。リンパ浮腫マウスの尾モデルは、15週間を超えて持続的なリンパ浮腫を拡張し、確認された動脈および静脈開存を示し、機能的リンパ機能障害評価を可能にする。
リンパ浮腫のマウステールモデルは、リンパ浮腫を治療するための新しい治療法の評価を可能にする。遺伝子ベースの戦略は、ウイルスベクター31、32によって媒介されるマウスモデルにおいて使用されてきた。また、新しい組織ナノトランスフェクション技術(TNT)を用いて、リンパ浮腫マウス尾部への遺伝貨物輸送にも使用しています。TNTは急速に焦点を合った電界33、34、35、36のナノチャネルを備えたチップを使用して、直接的な、経皮的な遺伝子の送達を促進する。このモデルは、マウス尾部35のリンパ損傷部位への潜在的な遺伝子ベースの治療薬の焦点遺伝子送達を可能にするTNT2.0を用いることを含む。
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Protocol
このプロトコルは、施設の動物研究倫理委員会のガイドラインに従っています。すべての動物実験は、インディアナ大学医学部の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました。動物は、食べ物と水のアドリビタムと12時間の明暗サイクルの下で収容されました。
1. マウスの尾リンパ球の外科的破壊
- 男女分布の8週齢のC57BL/6マウスを使用してください。
- 100%酸素中の3-4%のイオブルランを有する誘導室の全身麻酔下にマウスを置き、その後、処置中に1〜3%で維持沈下した。
- 0.5 mg/kg 持続放出(SR)ブプレノルフィンを皮下に投与して疼痛制御を行う。
注: ポストオペで投与された追加の鎮痛薬: Carprofen 1回 24 時間ごとに少なくとも 48 時間とブピバカインは、切開が行われた後、または切開を閉じる前に一度, 皮膚の端に滴下することによって適用されます (4 – 6 時間まで続きます). - マウスをドーサリーに置き、70%イソプロピルアルコールで尾を準備します。
- キャリパーを使用して、尾部のベースから20mmから始まる5mm増分で手順の前に尾の直径を測定します。これらの測定値は、切り捨てられたコーン方程式37を使用して体積を計算するために使用されます。
- ベースから尾部20mmに3mmの円周切除をマークします。
- 滅菌外科用ブレード(サイズ15)で細心の3mmの完全な皮膚切除を行い、外科顕微鏡的拡大の下で基礎となるすべての血管構造をそのまま残します。上周マーク(尾部ベースから20mm)を最初に真皮を通し、最初の切開に対して3mmの周縁部の完全な厚さの切開を行います。
- 垂直な完全な厚さの垂直切開を行い、2つの切開を接続します。歯付きの細かいピックアップを使用して先端をつかみ、マイクロシザーを使用して、真皮に対する血管面内の深部を慎重に解剖し、静脈の冒険に表面化します。
- 0.1 mLのイソスルファンブルー(1%)を尾部の先端に皮下近位に注入する。
- 手術顕微鏡下で横尾静脈に隣接する2つのリンパ管を特定します。イソスルファン注射のためリンパ球は青色に見えます。まっすぐなマイクロ外科用ハサミを使用してリンパ球をトランスフェクトする。はさみを使用して、横静脈とリンパ管の間の平面を慎重に解剖します。次に、リンパ管と横静脈の間に1つのはさみ刃の先端を渡し、刃を閉じてリンパ管を移す。
- 無菌付着透明なドレッシングで尾の傷をドレスアップ。毎日、感染や出血を防ぐために、op後の切開をチェックし、2週間の創傷ケアを提供します。
- 動物を1人で収容して、尾にこれ以上の怪我を防ぎ、動物がお互いに噛み合うことを防ぎ、外科的合併症につながる。
2. レーザースペックルコントラストイメージングによる尾血管評価
- ステップ 1.2 のようにマウスを麻酔します。
- レーザースペックルコントラストイメージングを使用して尾部血管を可視化するには、幅を0.8cm、高さを1.8cmに、点密度を高く、フレームレートを44枚の画像/秒、時間を30秒に、カラー写真を1秒あたり1に設定します。
- 静脈および動脈灌流を評価して、開血を評価する。定性的に、流れの連続性を視覚化する必要があります。
3. 近赤外レーザー血管造影による機能性リンパ解析
- ステップ 1.2 のように動物を麻酔する
- インドシアニングリーン(ICG)(25mg/10 mL)を再構成し、先端付近の遠位マウス尾部に皮下0.1mLを投与する。
- 部屋の明かりを暗くする。近赤外線レーザー血管造影をバッファリング設定に入れ、その後ライブキャプチャを行います。
4. TNTを用いたマウス尾への核酸貨物のフォーカルデリバリー
- ステップ1.2のように動物を麻酔します。
- 局所皮膚剥離クリームを使用してマウスの尾を剥離します。
- マウスの尾をコラゲターゼ溶液(10mg/mL)に37°Cで5分間浸します。
- TNT2.0 チップリザーバ35に DNA をロードします。
- TNT2.0 シリコーンチップデバイスを、尾部に接触するナノニードルで尾部に所望の送達部位を置きます。
- 正の電気プローブを貯留槽に入れる。負のプローブを30G針に取り付け、針を皮下に尾に入れ、配達現場に挿入します。
- 矩波パルス電気刺激(10 x 10 msパルス、250 V、10 mA)を適用します。
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Representative Results
持続的なリンパ浮腫のマウス尾モデルの技術を 図1に示す。この図は、マウスの尾型モデルの関連する解剖学を示しています。 図2 は、リンパ浮腫誘導後のマウス尾部における進行性の腫脹および持続性持続性リンパ浮腫を示す。マウスの尾部の体積は、切り捨てられたコーン方程式で計算されるように、第4週でピークを迎え、第6週に続いて第15週まで徐々に改善される。尾容積は、モデルにおけるリンパ浮腫に対する治療介入の効果を評価する転帰変数として使用することができる。 図3では、尾脈管構造の開口の評価のための高解像度レーザースペックルが観察できる。これは、ウェルディングが静脈損傷ではなくリンパ機能不全に二次的であることを保証するために、モデルに厳しさを追加します。介入の効果は、潜在的に大きな自信を持ってリンパ浮腫治療に変換することができます. 図4 は、近赤外レーザーリンパ球法を介して行われる機能的リンパ性評価を示す。この追加の結果変数は、介入の機能的なリンパ効果を可能にする。 図5 は、組織ナノトランスフェクション技術(TNT2.0)を用いて、外科部位における遺伝貨物の経皮的な送達を示す。TNT2.0 は、このリンパ浮腫モデルにおける潜在的な候補遺伝子ベースの治療薬のケアのポイントデリバリーを促進する。
図1:持続的リンパ浮腫用マウステールモデル(A)手術用ミカースコープ下のベースから20mmのマウス尾部に対して3mm幅の全厚皮膚切除が行われる。血管系を維持するために注意が払われる。(B)マウス尾翼の断面の概略図。DV=底側静脈、LV=側方静脈、A=腹側尾骨動脈、CV=尾骨椎、T=腱および筋肉、黄色の矢印はリンパ管を示す。(C)後に、リンパ球を局所化するためにイソスルファンブルーを尾端に投与すると、リンパ系(黄色矢印)は青色を呈する。リンパ管は隣接する横静脈(白い矢印)を維持しながら破壊される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス尾部リンパ浮腫モデルの進行性腫脹(A)全厚皮膚切除術およびリンパ性トランセクションに続いて、マウス尾部は15週間にわたって持続する進行性の腫脹を示す。ブラケットは尾の基部から外科の完全な厚さの皮の切除の開始に20のmmを示す。(B-C)15週間にわたる尾量変化の定量化(B)棒グラフ、動物を表す各ドット、n=15、または(C)線グラフとして表す。± SEM として表されるデータは、ここをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。
図3:リンパ浮腫マウス尾モデルにおけるマウス尾の灌流を確認する高分解能レーザースペックルコントラストイメージング。 レーザースペックルは、リンパ性病因の腫れを検証し、尾壊死を最小限に抑えるために、術後にマウスの尾脈管を評価するために使用されます。(A)レーザースペックルで検出された横静脈(黒矢印)を持つマウスの尾。(B)無傷の横方向尾静脈(黒矢印)後リンパ浮腫手術はレーザースクレによって検出される。(n=5) 分解能 0.02 mm色分けされたバーは、任意の相対単位で測定された灌流(青:低、赤:高)を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウス尾型モデルにおける近赤外レーザーリンパ様光量を用いたリンパ機能の評価 マウス尾の先端に注入されたインドシアニングリーン(ICG)はリンパ球に局部的に局部する。術前に、リンパ球はマウスの尾に沿ってそのままである。術後、手術部位を越えてICGトランジットが存在することはなく、腫脹がリンパ機能障害によって引き起こされることを確認する。黄色の矢印は尾の底を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:組織ナノトランスフェクション技術(TNT)を用いた遺伝貨物の焦点送達 (A) TNT 配信の図。(B)プラスミドは TNT2.0 リザーバに積み込まれます。正極および陰性の電気プローブが取り付けられ、短い方形波パルス電気刺激(10 x 10 msパルス、250V、10mA)が送達され、焦点、非ウイルス、経皮トランスフェクションが容易になります。(C)フッ素アミド(FAM)標識したDNAを介してマウス尾部に観察したTNT2.0 を用いた遺伝貨物送達の効率。マウスの尾部はTNT治療の2日後に切り離され、蛍光顕微鏡を通じて評価された。白い点線は、マウスの尾の皮膚の上皮を示す。白い矢印は、DNAとラベル付けされたFAMを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
リンパ浮腫は、原発(先天性)または二次(気中原性リンパ)傷害38、39に分類される。二次リンパ浮腫は、症例の99%を含む39.二次リンパ浮腫は、最も一般的に感染(フィラリア症)またはリンパ節切術または放射線による事後の治療によって引き起こされる4,39.翻訳動物モデルは、リンパ12次16>と放射線で治療された動物の70%がリンパ浮腫2,16を獲得しないので、二次性リンパ浮腫には挑戦的である。また、現象性リンパ浮腫は、遅発性発症(1年)後リンパ損傷を呈する。リンパ浮腫のマウス尾モデルは、これらの障害を克服し、焦点尾リンパ切除術を受けているすべてのマウスは、処置21,23の後の数日以内にリンパ浮腫を示す。完全な厚み焦点皮下切除は、尾静脈と皮下組織との間の組織面の決定的な同定を可能にし、血管の保存を促進する外科用顕微鏡で可視化の下で行われる。我々は以前にナイロン縫合糸でリンパ管を結紮したが、持続的なリンパ浮腫はリンパ管の単に切開によって誘発することができるので、結紮は不要と考えなければならない。マウス尾部の2つの横方向リンパチャネルは、横方向尾静脈と近接している。組織学的には、腫れた尾部は、炎症、間質液貯留、脂肪沈着、および線維症を示し、臨床リンパ浮腫24、27、28、40と同様である。
このモデルの1つの落とし穴は、側面静脈および脈管構造への傷害のリスクである。ルーペ倍率を使用して完全な厚さの皮膚切除に関する手順を実行すると、解剖中に不注意な静脈出血につながる可能性があります。高い立体視倍率の下で慎重な切除は、血管の出現と皮下層の間の血管面内に滞在するためのより高い精度を容易にします。もう一つの困難は、尾壊死が30%の頻度で起こることであり、血管損傷が尾壊死リスクを大幅に増加させる。このモデルは、(1)細心の解剖のための外科用顕微鏡の使用と(2)レーザースペックルイメージング41による血管の開口の確認を用いて尾壊死を疎外する。血管損傷が確認された場合、動物は研究から取り除かれるべきである。他の研究者は、心臓内微小球注入を使用して動脈灌流22を評価している。レーザースペックルイメージングは、動脈41に加えて静脈の血流運動の定量を可能にする。この低侵襲技術は精密なマイクロ灌流データを提供できる。41
尾部容積はモデルの表現型の結果変数として使用されます。モデルにおける尾のリンパ機能を評価することも、実験効果を評価するために使用される。近赤外線レーザーリンパ節造法を用い、マウスの尾部のリンパ機能を評価します。これは、生きている動物のリアルタイムリンパ流を直接可視化します。ICGレーザーリンパ節造影はまた、リンパ球性微細外科的麻酔術中に臨床的に用いられているので、10によく翻訳される。臨床的には、これはリンパ浮腫7,10を治療するためにリンパ解剖学で静脈にそれらを接続するリンパ管内リンパのマッピングおよび標的リンパ管の同定を容易にする。ICGレーザーリンパ管造影法を用いる1つの落とし穴は、マウスの尾および他の材料がICGでコーティングされ、非種的な蛍光を生じ、リンパ管の適切な可視化を妨げることである。そのため、ICGの取り扱いと管理の直後に手袋を交換し、このリスクを最小限に抑えます。
TNTは生体内組織リプログラミング33のために最初に開発されました。これは、糖尿病末梢神経障害の救助および破砕された神経34、36の修復を含む遺伝子導入プラットフォームとして使用され、3つの必須コンポーネントを利用する:(1)ナノニードルベースの遺伝子導入のためのシリコーンナノチップ。(2) 核酸貨物(ORFまたはsiRNAを有するプラスミド)(3) 標準電源。TNTは急速に焦点を合った電界との直接、経皮的な、非ウイルス性の遺伝子の送達を促進する。マウスモデル33において新血管化を増加させることにより、四肢虚血を減少させるために用いられている。最近では、TNT2.0は創傷部位エキソソーム35にラベルを付けるために使用されています。マウスの尾リンパ浮腫モデルでTNTを使用すると、遺伝子ベースの治療法の提供のためのエキサイティングな未来を提供しています。
マウス尾リンパ浮腫モデルの翻訳上の制限は、リンパ浮腫21,22の自発的な分解であり、尾部腫脹が21の実験モデルでは20~30日後に解決する。モデルにおいて、尾膨潤容容は、一般的に使用される切り捨てられたコーン方程式37によって測定されるように、解像度を示すことなく15週間持続している。おそらく、技術の強化は、リンパ浮腫の持続性を最大化しています。この技術の変更には、顕微鏡的拡大下の完全な解剖、リンパ浮腫のリンパ起源の厳格さを保証するための尾脈管構造のレーザー斑点評価、ICGレーザーリンパ管造影による機能評価、および治療遺伝子送達のためのTNT2.0が含まれる。リンパ浮腫のマウス尾型改変モデルは、リンパ浮腫の再現性と臨床的に翻訳可能な動物モデルである。
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Disclosures
著者らは競合する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、米国形成外科医学術奨学金協会と国防総省W81XWH2110135がAHHに提供する助成金によって支えられた 。美容外科教育研究財団は、CKSに対して、MS. NIH U01DK119099、R01NS042617およびR01DK125835に助成金を与えます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tegaderm Film | 1626W | ||
| Surgical Microscope | Leica, Wetzlar, Germany | MSV266 | |
| Adherent Dressing (Tegaderm) | 3M, St. Paul, Minn. | 1626W | |
| Laser speckle (Pericam PSI System ) | Perimed AB, Stockholm, Sweden) | PSIZ | |
| Near-infrared laser (LUNA) | Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada) | LU3000 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth | Fine Science Tools (USA) Inc. | 11019-12 | |
| V-Hook | Fine Science Tools (USA) Inc. | 18052-12 | |
| Scalpel SS NO15 | Fischer Scientific | 29556 | |
| Disposable Needle 30GX1 | Fischer Scientific | 305128 | |
| Operating Scissors | Fischer Scientific | 12-460-796 | |
| Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in | Fischer Scientific | 50-118-4255 | |
| Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge | Fine Science Tools (USA) Inc. | 15024-10 | |
| Cardiogreen | Sigma | I2633-25MG | |
| IsosulfanBlue (Lymphazurin) 50 mg/5ml | Mylan | 67457-220-05 |
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