Summary
Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. Descrevemos um modelo crônico de cauda murina de linfedema e o novo uso da tecnologia de nanotransfescção de tecido (TNT) para entrega genética de carga na cauda.
Abstract
Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose. Não há cura para esta doença. Um modelo de cauda de rato que usa uma excisão focal de pele de espessura total perto da base da cauda, resultando em inchaço na cauda, tem sido usado para estudar linfedema. No entanto, este modelo pode resultar em compor vascular e consequente necrose da cauda e resolução precoce do inchaço da cauda, limitando sua tradução clínica. O modelo de linfedema crônico da cauda murina induz linfedema sustentado ao longo de 15 semanas e uma perfusão confiável à cauda. Os aprimoramentos do modelo tradicional de linfedema da cauda murina incluem 1) excisão de espessura total precisa e recorte linfático usando um microscópio cirúrgico, 2) confirmação de perfusão arterial pós-operatória e venosa usando mancha laser de alta resolução, e 3) avaliação funcional usando lymphangiography laser indocyanine perto de infravermelho. Também usamos a tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para a nova entrega não viral, transcutânea e focal de carga genética para a vasculatura da cauda do rato.
Introduction
Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose1. Linfedema afeta 250 milhões de pessoas em todo o mundo2,3,4. Estima-se que 20-40% das pacientes que se submetem ao tratamento de malignidades sólidas, como câncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos, ou sarcomas, desenvolvem linfedema2,4,5. A morbidade do linfedema inclui infecções recorrentes, dor e deformidade6. Não há cura para esta doença progressiva ao longo da vida. As terapias atuais são variadas por7 eficazes e incluem compressão, terapia descongestória completa por fisioterapeutas, procedimentos excisionais e operações microcirúrgicas, incluindo transferência vascularizada de linfonodo e bypass linfovennoso7,8,9,10,11,12,13,14. O tratamento ideal para linfedema ainda não foi descoberto.
O estudo do mecanismo e terapia do linfedema tem sido limitado. Há um início médio de atraso de um ano após a lesão linfática15,16 e a maioria dos indivíduos que experimentam insulto iatrogênico com radiação e cirurgia não desenvolvem linfedema4,6,17. Embora grandes modelos animais, incluindo caninos, ovinos e suínos tenham sido descritos18,19,20, o modelo de cauda de rato tem sido o mais amplamente aplicado por causa da facilidade, custo e reprodução. Os modelos de camundongos para investigar linfedema incluem um modelo de cauda, ablação linfática mediada por difteria e dissecção de linfonodo axilar ou popliteal21,22,23,24,25,26. A maioria dos modelos de cauda utiliza uma excisão focal de pele de espessura total com recorte de canal linfático que é realizado perto da base da cauda22, resultando em inchaço na cauda e características histológicas semelhantes ao linfedema humano24,27,28,29. No entanto, o modelo padrão de cauda murina normalmente se resolve em apenas 20 dias e é acompanhado por necrose periódica da cauda30. O modelo de cauda do rato linfedema estende um linfedema sustentado para além de 15 semanas, demonstra patência arterial e venosa confirmada e permite avaliação de disfunção linfática funcional.
Um modelo de cauda murina de linfedema permite a avaliação de novas terapêuticas para tratar linfedema. Estratégias baseadas em genes têm sido usadas no modelo de mouse mediado pelos vetores virais31,32. Também usamos uma nova tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para entrega de carga genética à cauda linfática do rato. A TNT facilita a entrega direta e transcutânea de genes usando um chip com nanocanais em um campo elétrico rápidofocado 33,34,35,36. O modelo inclui o uso do TNT2.0 para permitir a entrega de genes focais de potenciais terapêuticas baseadas em genes para o local de lesão linfática da cauda do rato35.
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Protocol
O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa animal da instituição. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana. Os animais foram alojados sob um ciclo claro-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.
1. Interrupção cirúrgica de linfáticos da cauda do rato
- Use camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade de distribuição igualitária de gênero.
- Coloque um rato sob anestesia geral em uma câmara de indução com isoflurane de 3-4% em 100% de oxigênio seguido de sedação de manutenção em 1-3% durante o procedimento.
- Administre 0,5 mg/kg de liberação sustentada (RS) de buprenorfina subcutânea para o controle da dor.
NOTA: Medicamentos analgésicos adicionais administrados após a operação: Carprofen uma vez a cada 24 h por pelo menos 48 h e Bupivacaína uma vez após a incisão foi feita ou antes de fechar a incisão, aplicada pingando nas bordas da pele (dura até 4 - 6 h). - Posicione o rato dorsalmente e prepare a cauda com 70% de álcool isopropílico.
- Meça o diâmetro da cauda antes do procedimento em incrementos de 5 mm a partir da base da cauda usando uma pinça. Estas medidas serão usadas para calcular o volume usando a equação do cone truncado37.
- Marque uma excisão circunferencial de 3 mm na cauda a 20 mm da base.
- Realize uma meticulosa excisão de pele de 3 mm de espessura total com uma lâmina cirúrgica estéril (tamanho 15), deixando toda a vasculatura subjacente intacta sob ampliação microscópica cirúrgica. Incisar a marca circunferencial superior (20 mm da base da cauda) primeiro através da dermis seguido por uma incisão de espessura total circunferencial 3 mm distlal à primeira incisão.
- Faça uma incisão vertical de espessura total perpendicular para conectar as duas incisões. Use uma picape fina dentada para agarrar uma borda de ponta e use microscissores para dissecar cuidadosamente profundamente dentro do plano avascular para a derme e superficial para a veia adventitia.
- Injete 0,1 mL de isosulfan azul (1%) subcutâneamente proximal à ponta da cauda.
- Identifique os dois canais linfáticos adjacentes às veias laterais da cauda sob o microscópio cirúrgico. Os linfáticos aparecerão azuis por causa da injeção de isosulfan. Transecte os linfáticos usando tesoura microcirúrgica reta. Use a tesoura para dissecar cuidadosamente um plano entre a veia lateral e o linfático. Em seguida, passe a ponta de uma lâmina de tesoura entre o vaso linfático e a veia lateral e feche as lâminas para transectar o vaso linfático.
- Vista a ferida da cauda com um curativo transparente estéril. Verifique as incisões pós-operatórias diariamente para garantir que elas não estejam infectadas ou sangrando e forneça cuidados com feridas por 2 semanas.
- Abrigar os animais de forma singly para evitar qualquer lesão adicional na cauda e para evitar que os animais mordam uns aos outros, o que levaria a complicações cirúrgicas.
2. Avaliação vascular da cauda com imagem de contraste de manchas de laser
- Anestesiar o mouse como na etapa 1.2.
- Para usar imagens de contraste de manchas laser para visualizar a vascularidade da cauda, ajuste a largura para 0,8 cm, altura a 1,8 cm, densidade de ponto para alta, taxa de quadros para 44 imagens/segundo, tempo para 30 segundos e foto colorida para 1 por 10 segundos.
- Avalie a perfusão venosa e arterial para patência. Qualitativamente, a continuidade do fluxo deve ser visualizada.
3. Avaliação linfática funcional com angiografia a laser infravermelha próxima
- Anestesiar o animal como na etapa 1.2
- Reconstitua o verde indocitanina (ICG) (25 mg/10 mL) e administre 0,1 mL subcutâneamente na cauda do rato distal perto da ponta.
- Apague as luzes do quarto. Coloque angiografia a laser quase infravermelha na configuração de buffering seguida de captura ao vivo.
4. Entrega focal de carga de ácido nucleico para cauda de rato usando TNT
- Anestesiar o animal como no passo 1.2.
- Esfoliar a cauda do rato usando creme de esfoliação de pele tópico.
- Mergulhe a cauda do mouse na solução de colagenase (10 mg/mL) a 37 °C por 5 minutos.
- Carregue DNA no reservatório de chip TNT2.0 35.
- Coloque o dispositivo de chip de silicone TNT2.0 sobre o local focal desejado de entrega na cauda com nanonegubras em contato com a cauda.
- Coloque uma sonda elétrica positiva no reservatório. Conecte a sonda negativa a uma agulha de 30 G e insira a agulha subcutânea na cauda ao local de entrega.
- Aplique estimulação elétrica de pulso de onda quadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).
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Representative Results
A técnica para o modelo de cauda do rato para linfedema sustentado é mostrada na Figura 1. A figura exibe a anatomia relevante do modelo de cauda do rato. A Figura 2 demonstra o inchaço progressivo e o linfedema persistente sustentado na cauda do rato após a indução de linfedema. O volume da cauda do rato, calculado pela equação do cone truncado, atinge picos na semana 4 e planaltos para a semana 6 seguido de melhora gradual que é mantida para a semana 15. O volume da cauda pode ser utilizado como variável de desfecho para avaliar o efeito de intervenções terapêuticas para linfedema no modelo. Na Figura 3,pode-se observar uma mancha laser de alta resolução para avaliação da patência da vasculatura traseira. Isso adiciona rigor ao modelo para garantir que o welling seja secundário à disfunção linfática em vez de lesão venosa. O efeito das intervenções pode, então, potencialmente se traduzir em tratamento de linfedema com maior confiança. A Figura 4 mostra uma avaliação linfática funcional realizada através de linfografia a laser infravermelha próxima. Esta variável de desfecho adicional permite um efeito linfático funcional das intervenções. A Figura 5 demonstra a entrega focal de carga genética transcutânea no local cirúrgico utilizando tecnologia de nanotransfesão tecidual (TNT2.0). A TNT2.0 facilita o atendimento de terapêuticas baseadas em genes candidatos em potencial neste modelo de linfedema.
Figura 1: Modelo de cauda de rato para linfedema sustentado. (A) Uma excisão de pele de espessura total de 3 mm de largura é realizada em uma cauda murina 20 mm da base sob o micrcópio cirúrgico. É preciso cuidado para preservar a vasculatura. (B) Um esquema da seção transversal da cauda do rato. DV=veia dorsal, LV=veias laterais, artéria caudal A=ventral, cv=vértebra caudal, T=tendão e músculo, setas amarelas mostram os linfáticos. (C) Após a administração do azul isosulfan na ponta da cauda para localização dos linfáticos, os linfáticos (seta amarela) exibem a cor azul. Os linfáticos são interrompidos preservando as veias laterais adjacentes (seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Inchaço progressivo do modelo de linfedema da cauda do camundongo. (A) Após a excisão da pele de espessura total e transeção linfática, a cauda do rato apresenta inchaço progressivo que é sustentado ao longo de 15 semanas. O suporte denota 20 mm da base da cauda até o início da excisão cirúrgica de espessura total da pele. (B-C) Quantificação da alteração no volume da cauda ao longo de 15 semanas representados como(B) gráficos de barras, cada ponto representando um animal, n=15, ou como (C) gráfico de linha. Dados representados como ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem de contraste de manchas de laser de alta resolução para confirmar a perfusão da cauda do rato no modelo de cauda do rato linfedema. A mancha laser é usada para avaliar a vasculatura da cauda do rato no pós-operatório para validar o inchaço da etiologia linfática e minimizar a necrose da cauda. (A) Uma cauda de rato com veias laterais feridas (seta preta) detectada por mancha laser. (B) Veia traseira lateral intacta (seta preta) pós-linfedema detectada por mancha laser. (n=5) resolução 0,02 mm; A barra codificada por cores indica perfusão (azul: baixo, vermelho: alto) medido em unidades relativas arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação da função linfática utilizando linfórica a laser quase infravermelha no modelo de cauda do rato. O verde indocyanina (ICG) injetado na ponta da cauda do rato localizado para os linfáticos. No pré-operatório, os linfáticos estão intactos ao longo da cauda do rato. No pós-operatório, não há trânsito de ICG além do local cirúrgico, confirmando que o inchaço é causado por disfunção linfática. A seta amarela indica a base da cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Entrega focal de carga genética utilizando tecnologia de nanotransfesão tecidual (TNT). (A) Ilustração da entrega da TNT. (B) Os plasmídeos são carregados no reservatório TNT2.0. As sondas elétricas positivas e negativas são anexadas e uma breve estimulação elétrica de pulso de onda quadrada é fornecida (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA), facilitando transfecção focal, não viral e transcutânea. (C) Eficiência da entrega de carga genética utilizando TNT2.0 como observado através de fluoresceína amidita (FAM) rotulada entrega de DNA para a cauda murina. As caudas do rato foram seccionadas dois dias após o tratamento da TNT e avaliadas através de microscopia de fluorescência. Linhas pontilhadas brancas indicam o epitélio da pele da cauda murina. As setas brancas indicam o DNA rotulado pela FAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Linfedema é categorizado como lesão primária (congênita) ou secundária (linfática iatrogênica)38,39. O linfedema secundário compreende 99% dos casos39. Linfedema secundário é mais comumente causado por infecção (filariase) ou tratamento pós-oncológico com linfodenectomia ou radiação4,39. Um modelo animal translacional é desafiador para o linfedema secundário, pois 70% dos animais tratados com linfofentomia e radiação não adquirem linfedema2,16. Além disso, o linfedema fenotípico exibe um início de início atrasado (um ano) de lesão pós-linfática. O modelo de linfedema da cauda do rato supera esses obstáculos, pois todos os camundongos submetidos à excisão linfática da cauda focal exibem linfedema dentro de dias após o procedimento21,23. A excisão subcutânea focal de espessura total é realizada sob visualização com o microscópio cirúrgico permitindo a identificação definitiva do plano tecidual entre as veias da cauda e os tecidos subcutâneos e facilitando a preservação do vaso. Já ligamos o canal linfático com sutura de nylon, mas como linfedema persistente pode ser induzido apenas com a transeção do canal linfático, a ligadura deve ser considerada desnecessária. Os dois canais linfáticos laterais na cauda do rato estão próximos das veias traseiras laterais. Histologicamente, a cauda inchada apresenta inflamação, retenção de fluidos intersiitiais, deposição adiposa e fibrose, semelhante ao linfedema clínico24,27,28,40.
Uma armadilha deste modelo é o risco de lesões nas veias laterais e vasculatura. Realizar o procedimento na excisão da pele de espessura total usando a ampliação da lupa pode levar a sangramento venoso inadvertida durante a dissecção. A excisão cuidadosa sob alta ampliação estereoscópica facilita maior precisão para ficar dentro de um plano vascular entre a adventitia do vaso e a camada subdérmica. Outra dificuldade é que a necrose da cauda ocorre com uma frequência de até 30%30, pois a lesão do vaso aumenta muito o risco de necrose da cauda. O modelo marginaliza a necrose da cauda com (1) o uso de um microscópio cirúrgico para dissecção meticulosa e (2) a confirmação da patência do vaso por imagem de mancha laser41. Se a lesão vascular for identificada, o animal deve ser removido do estudo. Outros pesquisadores usaram injeção de microesfera intracardiac para avaliar a perfusão arterial22. A imagem de manchas a laser permite quantificar a cinética do fluxo sanguíneo das veias, além das artérias41. Esta técnica minimamente invasiva pode fornecer dados precisos de microperfusão. 41
O volume da cauda é usado como uma variável de desfecho fenotípico do modelo. A avaliação da função linfática da cauda no modelo também é utilizada para avaliar o efeito experimental. Usamos linfígiografia a laser infravermelha para avaliar a função linfática na cauda do rato. Isso visualiza diretamente o fluxo linfático em tempo real no animal vivo. A linfaggiografia a laser do ICG também é comumente usada clinicamente durante procedimentos linfáticos microcirúrgicos de threapeutica, como anastomose linfovennosa, por isso traduz bem10. Clinicamente, isso facilita o mapeamento linfático introperador e a identificação de vasos linfáticos-alvo para conectá-los em veias em anatomose linfovennosa para tratar linfedema7,10. Uma armadilha do uso da linfagografia a laser ICG é a facilidade com que a cauda do rato e outros materiais podem ser revestidos com ICG, resultando em fluoresência não especiaica e dificultando a visualização adequada dos linfáticos. Por isso, trocamos de luvas imediatamente após o manuseio do ICG e a administração para minimizar esse risco.
A TNT foi desenvolvida inicialmente para reprogramação de tecidos in vivo33. É usado como uma plataforma de transferência de genes, incluindo o resgate da neuropatia periférica diabética e a reparação de nervos esmagados34,36 e utiliza três componentes essenciais: (1) um nanochip de silicone para transferência genética baseada em nanonególes; (2) uma carga de ácido nucleico (plasmídeos com ORF ou siRNAs); e (3) uma fonte de alimentação padrão. A TNT facilita a entrega direta, transcutânea e não viral de genes com um campo elétrico rápido focado. Tem sido usado para diminuir a isquemia de membros aumentando a neovascularização em um modelo de camundongo33. Mais recentemente, o TNT2.0 tem sido usado para rotular exosóis do local da ferida35. O uso de TNT no modelo de linfedema na cauda do rato oferece um futuro emocionante para a entrega de terapias baseadas em genes.
Uma limitação translacional do modelo de linfedema da cauda do rato tem sido a resolução espontânea do linfedema21,22, como o inchaço da cauda se resolve após 20-30 dias em alguns modelos experimentais21. No modelo, o volume de inchaço da cauda, medido pela equação37do cone truncado comumente utilizada, foi sustentado por 15 semanas sem apresentar resolução. Talvez os aprimoramentos da técnica tenham maximizado a persistência do linfedema. As modificações técnicas incluem dissecção completa sob ampliação microcópica, avaliação de manchas a laser da vasculatura traseira para garantir rigor para a origem linfática do linfedema, avaliação funcional com linfício a laser icg e TNT2.0 para entrega de genes terapêuticos. O modelo de cauda de rato modificado de linfedema é um modelo animal reprodutível e clinicamente traduzível de linfedema.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento de subvenções fornecidos pela Associação Americana de Cirurgiões Plásticos Bolsista Acadêmico e pelo Departamento de Defesa W81XWH2110135 para AHH. A Fundação de Educação e Pesquisa em Cirurgia Estética concede ao MS. NIH U01DK19099, R01NS042617 e R01DK125835 à CKS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tegaderm Film | 1626W | ||
| Surgical Microscope | Leica, Wetzlar, Germany | MSV266 | |
| Adherent Dressing (Tegaderm) | 3M, St. Paul, Minn. | 1626W | |
| Laser speckle (Pericam PSI System ) | Perimed AB, Stockholm, Sweden) | PSIZ | |
| Near-infrared laser (LUNA) | Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada) | LU3000 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth | Fine Science Tools (USA) Inc. | 11019-12 | |
| V-Hook | Fine Science Tools (USA) Inc. | 18052-12 | |
| Scalpel SS NO15 | Fischer Scientific | 29556 | |
| Disposable Needle 30GX1 | Fischer Scientific | 305128 | |
| Operating Scissors | Fischer Scientific | 12-460-796 | |
| Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in | Fischer Scientific | 50-118-4255 | |
| Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge | Fine Science Tools (USA) Inc. | 15024-10 | |
| Cardiogreen | Sigma | I2633-25MG | |
| IsosulfanBlue (Lymphazurin) 50 mg/5ml | Mylan | 67457-220-05 |
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