Une culture d’explantation de queue 3D pour étudier la segmentation des vertébrés chez le poisson zèbre

Summary

Ici, nous présentons le protocole pour la culture tissulaire 3D de l’axe postérieur du corps du poisson zèbre, permettant l’étude vivante de la segmentation des vertébrés. Ce modèle d’explant fournit le contrôle sur l’élongation d’axe, l’altération des sources morphogènes, et l’imagerie vivante au niveau du tissu de résolution subcellulaire.

Abstract

Les embryons de vertébrés façonnent leur axe principal du corps comme des somites répétitives, les précurseurs des vertèbres, des muscles et de la peau. Les somites segmentent progressivement du mésoderme présomitique (PSM) à mesure que la queue de l’embryon s’allonge postérieurement. Les somites se forment avec une périodicité régulière et une échelle de taille. Le poisson zèbre est un organisme modèle populaire car il est génétiquement tractable et possède des embryons transparents qui permettent l’imagerie vivante. Néanmoins, au cours de la somitogenèse, les embryons de poisson sont enroulés autour d’un gros jaune arrondi. Cette géométrie limite l’imagerie en direct des tissus PSM dans les embryons de poissons zèbres, en particulier à des résolutions plus élevées qui nécessitent une distance de travail objective étroite. Ici, nous présentons une méthode de culture tissulaire 3D aplati pour l’imagerie vivante des explants de queue de poisson zèbre. Les explants de queue imitent des embryons intacts en montrant un ralentissement proportionnel de l’allongement de l’axe et un raccourcissement des longueurs de somite rostrocaudales. Nous sommes en outre en mesure de caler la vitesse d’allongement de l’axe grâce à la culture explant. Ceci, pour la première fois, nous permet de démêler l’entrée chimique des gradients de signalisation de l’entrée mécaniste de l’allongement axial. Dans de futures études, cette méthode peut être combinée avec une configuration microfluidique pour permettre des perturbations pharmaceutiques contrôlées dans le temps ou le dépistage de la segmentation des vertébrés sans aucun problème de pénétration des médicaments.

Introduction

La segmentation métamérique des organismes est largement utilisée dans la nature. Les structures répétées sont essentielles pour la fonctionnalité des organes latéraux tels que les vertèbres, les muscles, les nerfs, les vaisseaux, les membres ou les feuilles dans un plan corporel¹. En raison de telles contraintes physiologiques et géométriques de la symétrie axiale, la plupart des embranchements de Bilateria- tels que les annélides, les arthropodes et les chordés- présentent une segmentation de leurs tissus embryonnaires (par exemple, ectoderme, mésoderme) antéro-postérieur.

Les embryons de vertébrés segmentent séquentiellement leur mésoderme paraxial le long de l’axe principal du corps en somites avec des intervalles, des comptes et des distributions de taille spécifiques à l’espèce. Malgré une telle robustesse parmi les embryons individuels au sein d’une espèce, la segmentation de la somite est polyvalente entre les espèces de vertébrés. La segmentation se produit dans un vaste régime d’intervalles de temps (de 25 min chez le poisson zèbre à 5 h chez l’homme), de tailles (de ~20 μm dans les somites de queue de poisson zèbre à ~200 μm dans les somites de tronc de souris) et de comptages (de 32 chez les poissons zèbres à ~300 chez les serpents de maïs)². Plus intéressant encore, les embryons de poissons peuvent se développer dans une large gamme de températures (de ~ 20,5 ° C à 34 ° C pour le poisson zèbre) tout en gardant leurs somites intactes avec des distributions de taille appropriées en compensant à la fois les intervalles de segmentation et les vitesses d’allongement axiales. Au-delà de ces caractéristiques intéressantes, le poisson zèbre reste un organisme modèle utile pour étudier la segmentation chez les vertébrés en raison du développement externe, synchrone et transparent d’une plénitude d’embryons de frères et sœurs ainsi que de leurs outils génétiques accessibles. Du point de vue de la microscopie, les embryons de téléostéos se développent sur un jaune sphérique volumineux, étirant et arrondissant le tissu gazeux qui l’entoure (Figure 1A). En cet article, nous présentons une culture aplatie d’explant de tissu 3D pour des queues de poisson zèbre. Ce système d’explantation contourne les contraintes sphériques de la masse vitellin, permettant l’accès à l’imagerie vivante haute résolution d’embryons de poissons pour le modelage de somite.

Figure 1: Système d’explantation à chambre coulissante pour les embryons de poisson zèbre. (A) Les embryons de poisson zèbre présentent des avantages pour l’imagerie vivante, tels que la transparence du tissu embryonnaire gastrulating (bleu), mais le tissu se forme autour d’une masse de jaune sphérique volumineuse (jaune) qui empêche l’imagerie proche de l’objectif et à haute résolution dans les embryons intacts. Les explants de queue peuvent être disséqués en commençant par un couteau microchirurgical (brun) coupé du tissu antérieur des somites (rouge) et en continuant à la frontière avec le jaune postérieurement. (B) Les explants de queue disséqués peuvent être placés sur une lamelle de couverture (bleu clair) dorsoventralement; garder le tissu neural (gris clair) sur le dessus et notochord (gris foncé) en bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

Ce protocole implique l’utilisation d’embryons vertébrés vivants plus jeunes que 1 jour après la fécondation. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées selon les directives éthiques du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center; les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (Protocole no 2017-0048).

1. Collecte d’embryons

1. Installer des paires de poissons zèbres dans des réservoirs traversants la nuit précédant le jour de la collecte d’embryons. Pour un contrôle précis de la stadification du développement de l’embryon, utilisez des barrières entre les paires d’accouplement.
2. Soulevez les barrières avant l’heure de frai préférée et recueillez les œufs dans les 15 minutes dans une boîte de Pétri de 100 mm.
   1. Nettoyer les débris de la boîte de Pétri. Si plus de 50 embryons sont collectés à partir d’une seule couvée, divisez la couvée en plusieurs boîtes de Pétri en conséquence.
3. Incuber des embryons dans l’eau du système poissonnier à 28 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent 50 % d’épiboly (5 heures après la fécondation). Un milieu de croissance embryonnaire normalisé tel que E3 peut également être utilisé à la place de l’eau du système d’aquarium jusqu’à l’étape 3.2.
   1. Retirer les œufs non fécondés sous un stéréoscope et déplacer les embryons vers un incubateur à 23,5 °C pendant la nuit (O/N). Les embryons doivent être à un stade de 8 à 10 somites le matin suivant le jour de la collecte.

2. Préparation de l’outil

1. Stérilisez la lame du couteau de microchirurgie, les pointes d’aiguille (utilisées pour la dissection du tissu) et la pipette Pasteur en verre en trempant dans de l’éthanol à 100% (EtOH) et du vitrage feu.
2. Utilisez deux couches de ruban transparent (~ 100-120 μm d’épaisseur) sur des lames de microscope de 25 mm x 75 mm. Coupez ~ 18 mm x 18 mm puits carrés au centre du ruban adhésif de chaque diapositive recouvert d’un scalpel.
   1. Essuyez les chambres à lame préparées avec 70% d’EtOH. Ces puits retiendront environ 40 μL de milieu.

3. Préparation de l’échantillon

1. Embryons de dechorionate utilisant la pointe de deux seringues d’aiguille sous un stéréoscope. Transférer les embryons dans une boîte de Pétri séparée avec de l’eau du système de poisson à rincer.
2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile vitré au feu, transférer des embryons dans une boîte de Petri de 6 cm contenant un milieu de dissection (milieu de culture cellulaire Leibovitz-15 avec de la L-Glutamine sans rouge de phénol, 0,8 mM_caCl2 et 1× solution antibiotique-antimycotique).
   REMARQUE : Continuez d’utiliser une pipette en verre stérilisé pour tous les transferts suivant cette étape.
   1. Utilisez une boîte de Petri en verre pour la procédure d’explantation afin d’éviter les copeaux de polystyrène pendant la dissection.
3. Mettre 50 μL de milieu de croissance tissulaire (milieu de dissection et 10 % de FBS) dans la chambre à glissière.
4. Stabiliser un embryon pour la dissection sous le stéréoscope avec une pointe d’aiguille à l’intersection jaune-tissu près du cerveau postérieur.
5. En maintenant le tissu embryonnaire stable à l’arme d’une aiguille, utilisez le couteau microchirurgical dont la lame est maintenue à 45° pour séparer le tissu antérieur au cerveau postérieur et décoller le jaune du tissu embryonnaire à partir de l’antérieur et en se déplaçant vers le bourgeon caudale(figure 1A).
   REMARQUE: Veillez à ne pas perdre le tissu cutané lors du nettoyage du jaune. La peau se décollerait facilement comme un tissu élastique flanquant à une seule couche autour de l’embryon pendant la dissection, il est donc facile à reconnaître.
6. Une fois que le jaune est complètement retiré du corps embryonnaire, coupez le tissu cutané flanquant du tailbud. En gardant les 3-4 derniers somites formés intacts, coupez le tissu antérieur (explant à axe complet).
   1. Le jaune doit se détacher principalement intact de cette procédure. En cas de rupture du jaune, des granules importants de jaune peuvent rester attachés à la surface ventrale du tissu. Si c’est le cas, utilisez un outil de cils pour nettoyer doucement les granules de jaune restants.
      REMARQUE: Un déséquilibre des tissus cutanés sur les côtés latéraux d’une explantation ne permettrait pas au tissu de maintenir une direction de croissance droite. L’explant se plie plutôt vers le côté d’une peau plus étirée. Ce déséquilibre peut être corrigé sous le stéréoscope en rompant la couche cutanée à l’aide d’un couteau microchirurgical.
   2. Pour les explants sans peau, appuyez sur une pointe de la couche de peau avec une aiguille et décollez le tissu explant avec le couteau microchirurgical. Ces explants n’allferont pas leur axe corporel en culture.
   3. En plus des explants d’axe complet, des explants alternatifs peuvent être fabriqués à cette étape. Par exemple, disséquer les somites déjà segmentés à l’aide du couteau microchirurgical (explants psm complets) ou disséquer le PSM dans son demi-antéropostérieur (explants mi-PSM). Veuillez consulter la section 5.1 pour une application de ces explants de remplacement.
7. Transférer immédiatement l’explant disséqué sur une lamelle de 22 mm x 22 mm sur laquelle l’imagerie sera effectuée.
   1. Disposer l’explant à plat sur l’axe dorsoventral, la face ventrale touchant la lamelle(figure 1B). Retirez délicatement l’excès de milieux autour de l’explant de tissu à l’aide d’une pipette à pointe filtrée de 20 μL.
      REMARQUE: Le transfert retardé des explants disséqués à la lamelle entraîne des déformations du tissu, car il est soulagé des contraintes géométriques du jaune.
8. Retournez rapidement et soigneusement la lame de couverture avec l’explant sur la chambre à glissière remplie de milieu de croissance.
   1. Pour éviter la formation de bulles, placez un côté de la lamelle de couverture carrée sur la chambre à ruban adhésif et relâchez doucement l’autre côté. Veillez à ne pas déplacer/déformer l’explant dans cette étape.
   2. Retirez délicatement l’excès de saignements de milieux hors de la chambre en appuyant sur la chambre à glissière sur un tissu de laboratoire. La lamelle de couverture reposera de manière stable sur la chambre à glissière pour l’imagerie en direct, en raison de la tension superficielle du milieu liquide sans aucune étanchéité.
   3. Pour la culture à long terme (>6 heures), utilisez une chambre plus grande. Des lamelle rectangulaires de 22 mm x 50 mm ainsi que deux voies parallèles de couches de ruban adhésif sur des glissières peuvent être utilisées dans de tels cas. Un espace d’environ 1 mm de large peut être laissé entre deux voies de ruban pour faciliter l’accès de l’air dans le milieu de croissance.
9. Répétez les étapes 3.3-3.8 pour préparer plus d’explants. Les explants préparés allineront leur axe corporel A-P avec une vitesse moyenne d’environ 30 μm/h et segmenteront leurs somites avec des intervalles d’environ 40 minutes à 25 °C(Figure 2A,Vidéo 1).
   1. Pour les explants non allongés, appliquer une pression douce sur les côtés de la lame qui retient l’échantillon à l’étape 3.8.2 tout en aspirant l’excès de milieu sur un tissu de laboratoire. Alternativement, les explants peuvent être cultivés dans des chambres à glissière à couche de ruban unique. En outre, l’activation chimique de la surface de la chambre à glissière avec du collagène de type I entraînera des explants non allongés(Figure 2B,Vidéo 2).
      1. Effectuer le revêtement de la chambre avec du collagène de type I à l’avance en couvrant entièrement les chambres à glissière avec 15-20 mL de solution de collagène prédiluée à température ambiante pendant 1 h. Utilisez une hotte à flux laminaire pour ce protocole afin de maintenir la stérilité. Rincer soigneusement les chambres avec un milieu de dissection à la fin.
   2. Pour les embryons de plus de 15 somite, monter latéralement le tissu explantaire de la queue au lieu d’un support plat (dorsoventral) (Vidéo 3). Pour prévenir les contractions musculaires, inclure une solution de tricaine à 0,004% dans les milieux de culture en tant qu’agent anesthésique³.

4. Acquisition d’images en direct

1. Échantillons d’images soit sur une portée de dissection pour l’imagerie de lumière transmise à large champ des tailles et des périodes de segmentation de somite, soit avec éclairage structuré / confocal / microscopie à feuille de lumière utilisant des lignes de poissons rapporteurs transgéniques.
2. Équilibrer la température des explants tissulaires avec la température ambiante d’imagerie pendant au moins 15 min.
   1. Pour un contrôle de température plus précis, utilisez un système commercial de contrôle de la température monté sur un microscope inversé.
3. Définissez les intervalles de trame d’acquisition d’image sur 2 à 10 min en fonction du processus biologique d’intérêt.
   REMARQUE: La segmentation de la somite du poisson zèbre est un processus rapide, allant de 20 à 55 min pour des températures viables de 30 ° C à 21,5 ° C dans des embryons entiers. Les explants s’allongeront et se segmenteront environ 30% plus lentement que les embryons entiers.
   1. Faites attention à laisser suffisamment de délai entre les séries d’acquisitions de canaux pour éviter une phototoxicité possible des tissus vivants. N’exposez pas le tissu au faisceau d’excitation pendant plus de la moitié de la durée de l’imagerie et abaissez l’intensité du faisceau autant que possible.
      NOTA : L’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est généralement la principale cause de phototoxicité dans les échantillons vivants⁴. L’acide ascorbique en tant qu’extracteur de ROS peut être complété au milieu de croissance à une concentration de 4 mM pour amortir l’activité des ROS et soulager la phototoxicité. Les effets indésirables de la phototoxicité peuvent être difficiles à remarquer lors de l’imagerie en direct. Les explants de queue sont avantageux à cet égard puisque certains marqueurs visuels de phototoxicité tels que l’arrêt mitotique, le développement tissulaire entravé (c.-à-d. formation de somites, allongement de la queue) et la désintégration des tissus sont plus faciles à remarquer. Veuillez vous référer à la référence⁴ fournie pour une discussion détaillée.
4. Utilisez des embryons injectés d’ARN au stade cellulaire unique pour acquérir des images 4D destinées à être segmentées et analysées au niveau de résolution cellulaire.
   1. Utilisez 300 pg d’ARN provenant de membranes transcrites in vitro et de plasmides marqueurs rapporteurs fluorescents nucléaires tels que pCS-membrane-ceruleanFP (plasmide Addgene #53749) ou pCS-memb-mCherry (plasmide Addgene #53750) en combinaison avec pCS2+ H2B-mTagBFP2 (plasmide Addgene #99267) ou pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) dans les injections. Pour un exemple de film avec membrane cellulaire et marqueurs de noyaux s’il vous plaît voir Vidéo 4.
      REMARQUE: La taille moyenne des cellules du tissu PSM est d’environ ~ 5 μm de diamètre, dont les noyaux comprennent ~ 3 - 4 μm. Une taille de pixel d’environ 0,5 μm et une section z d’environ 1 μm doivent être enregistrées pour une segmentation cellulaire appropriée.

5. Immunomarquage des explants de la queue

REMARQUE: Les tissus cultivés après divers scénarios de dissection (allongé, non allongé, bourgeon de queue disséqué, demi-PSM, etc.) sous forme d’explants de queue montés à plat⁵ peuvent être récupérés à partir de chambres à lame pour d’autres quantifications immunostaining des protéines d’intérêt. Ici, nous présentons le protocole utilisé pour la coloration de la kinase régulée par signal extracellulaire di-phosphorylée (ppERK) des explants en tant que lecture du gradient de signalisation FGF.

1. Après la formation de somites jusqu’au stade souhaité, déplacez prudemment la lame de couverture à mi-chemin vers le coin de la chambre à glissière sans soulever.
2. À l’aide d’environ 100 μL de milieu de dissection supplémentaire dans une pipette Pasteur en verre, récupérez les explants de la lame et transférez-les dans une plaque de culture cellulaire à 64 puits.
   REMARQUE: À partir de cette étape, tous les remplacements de solution peuvent être effectués sous une portée de dissection avec une pipette en verre distincte pour les échantillons fixes. Cela garantira de ne pas perdre de tissus explant dans les puits ou de les transférer entre les deux.
3. Après avoir transféré toutes les explants, aspirez le milieu excessif hors des puits un par un et mettez 100 μL de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (PFA) dans chaque puits.
   ATTENTION : Le PFA est une solution toxique aux effets cancérigènes. Un EPI approprié doit être utilisé pendant la manipulation.
4. Fixer les explants dans une plaque de 64 puits à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur.
   1. Les explants tissulaires sont plus sensibles aux déformations que les embryons entiers. Ajustez la vitesse du shaker en conséquence.
5. Laver le fixateur avec 150 μL de PBS-Tw (0,1 % tween20 dans pbs) trois fois. Collectez le premier lavage dans un récipient spécifique « PFA Waste ».
6. Déshydrater les explants par étapes de 4×5 min en remplaçant ~40 μL de solution à chaque fois par du méthanol à 100% (MeOH).
   ATTENTION : Le MeOH est un produit chimique toxique qui est volatil et inflammable. Travaillez dans un espace bien ventilé et utilisez un EPI approprié pour la manipulation.
7. Comme dernière étape de déshydratation, retirer toute la solution des puits et la remplacer par 100 μL de MeOH. Incuber à -20 °C pendant 15 min.
   REMARQUE: Utilisez un conteneur spécifique « MeOH Waste » pour collecter les solutions jusqu’à l’étape 5.11.
8. Ajouter 50 μL de MeOH et agiter à température ambiante pendant 5 min.
9. Réhydrater les explants par étapes de 4×5 min en remplaçant ~40 μL de solution à chaque fois par du PBS-T (0,1 % de Triton-X 100 dans du PBS). Utilisez un conteneur spécifique « MeOH Waste » pour collecter les solutions.
10. Comme dernière étape de la réhydratation, retirer toute la solution des puits et la remplacer par 100 μL de PBS-T.
11. Pour la perméabilisation tissulaire, traiter les explants avec 1,5% de Triton-X 100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante sur le shaker.
12. Laver les échantillons avec du détergent MAB-D-T (0,1 % de détergent Triton-X 100 et 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tampon d’acide maléique 150 mM NaCl 100 mM pH 7,5) 3×5 min.
    ATTENTION : Le DMSO est inflammable et mutagène toxique. Un EPI approprié doit être utilisé pendant la manipulation.
13. Incuber les plantes dans une solution de blocage sérique de 100 μL/puits (2 % de sérum fœtal bovin dans du MAB-D-T) pendant 2 heures à température ambiante.
14. Remplacer toute la solution bloquante par une solution d’anticorps primaires de 50 à 100 μL/puits (dilution 1:1000 de l’anticorps monoclonal de souris contre le ppERK dans le bloc sérique). Incuber les échantillons O/N (>16 h) à 4 °C sur agitateur.
15. Laver la solution d’anticorps primaires avec MAB-D-T 5×5 min.
16. Incuber des échantillons dans une solution d’anticorps secondaires (Alexa Fluor 597 chèvre anti-souris IgG2b (1:200) et Hoechst 33342 (1:5000) dans MAB-D-T) O/N à 4 °C sur un agitateur ou pendant 3 h à température ambiante.
    REMARQUE: À partir de cette étape, couvrez la plaque de 64 puits avec du papier d’aluminium pour éviter l’exposition légère d’échantillons d’anticorps secondaires traités.
    ATTENTION : Hoechst 33342 est un cancérogène potentiel. Un EPI approprié doit être utilisé pendant la manipulation.
17. Laver la solution d’anticorps secondaire avec PBS-Tw 3×5 min.
18. Fixer les échantillons avec PFA pendant 15 minutes à température ambiante.
19. Laver le fixateur avec pbs-tw et équilibrer les échantillons dans 60% de glycérol. Monter des explants sur des lames de microscope avec du vernis à ongles et 60% de glycérol pour l’imagerie. Pour des résultats d’immunomarquage représentatifs, veuillez consulter la figure 3.

Representative Results

Ce protocole permet la culture géométrique plate d’explants de queue de poisson zèbre vivants. La culture de tissu présente trois avantages principaux au-dessus des embryons entiers : 1) contrôle de la vitesse d’élongation d’axe, 2) contrôle au-dessus de diverses sources de signalisation (morphogène) par dissection simple, et 3) presque-objectif, grossissement élevé et formation image vivante élevée de NA.

Les chambres à lame chimiquement non traitées permettent à l’explant de la queue d’allonger son axe principal(figure 2A)par l’ectoderme de la peau qui s’enroule autour du tissu en dessous. Lorsque nous avons cultivé les explants sur les chambres à glissière activées chimiquement (avec du collagène de type I), l’ectoderme de la peau s’est étiré et a adhéré à la chambre à glissière, ce qui a arrêté l’allongement de l’axe de l’explant. Malgré cela, les somites ont continué à segmenter (Figure 2B, Films supplémentaires S1 et S2). Comme décrit dans le protocole, l’allongement de l’axe peut également être arrêté directement en appliquant une pression physique pendant le processus de montage ou en montant des explants dans une chambre à glissière moins profonde. La quantification de la vitesse d’allongement de l’axe sous de telles contraintes physiques peut être trouvée dans nos travaux précédemment publiés⁵.

Figure 2: Contrôle de l’allongement de l’axe chez les explants. (A)Explants cultivés sur une chambre à lame régulière (à gauche) s’allongent axialement lorsqu’ils continuent à segmenter de nouvelles somites. La lumière transmise (gauche, niveaux de gris) et les instantanés de marqueurs nucléaires transgéniques (droite, rouge) sont montrés pendant 2 h de la durée de la culture. (B) L’activation chimique de la chambre à glissière avec du collagène de type I avant la culture bloque l’allongement axial mais n’affecte pas la vitesse de segmentation de la somite. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Deuxièmement, les explants peuvent être cultivés en disséquant les sources de morphogènes pour identifier les informations instructives qu’ils fournissent pour les processus de développement. Nous présentons ici trois exemples d’images montrant l’effet des dissections sur les niveaux de signalisation ppERK (Figure 3). Dans le tissu PSM un gradient de signalisation FGF est établi du postérieur à l’antérieur (lu par des niveaux de ppERK). Seul le tissu du bourgeon caudale transcrit activement fgf8⁶ et forme une source pour ce gradient à l’aide de la diffusivité du ligand FGF^5. Les explants de queue manquant la partie du bourgeon de queue du tissu après la dissection(figure 3C)entraînent un gradient ppERK plus court(figure 3B,3D). Opposé, un gradient acide retinoic est établi de l’antérieur au postérieur dans le PSM et le tissu neural dorsal. Les somites récemment formés et l’extrémité antérieure du PSM expriment des enzymes synthétisant l’acide rétinoïque (RA) et agissent comme source pour le gradient de RA^7. Lorsque nous avons disséqué le tissu PSM antérieur dans les explants(figure 3E),nous avons tout de même observé une étendue normale du gradient ppERK(figure 3F)tel que visualisé par immunomarquage. Une utilisation détaillée de cette force de la méthode explant peut être trouvée dans notre étude récente⁵.

Troisièmement, les explants de poisson zèbre montés à plat sont optimaux pour l’observation vivante à haute résolution de la morphogenèse tissulaire. Ici, nous présentons un film (Vidéo 4) pris avec une explante transgénique exprimant EGFP comme un marqueur de membrane cellulaire (faussement coloré avec du rouge) et coloré avec un marqueur de noyaux de cellules lointaines rouges (faussement coloré avec du cyan). Sans plus de quantification, beaucoup de processus tels que l’entrée des progéniteurs neuromesodermal dans le bourgeon de queue, la motilité plus élevée des cellules postérieures de PSM par rapport à antérieur, et l’épithélialisation des cellules limites somitiques peuvent être directement observés dans le film.

Figure 3: Immunomarquage des explants de queue. (A)Explants psm complets avec des gradients de signalisation intacts le long du PSM comme contrôle. (B) Le gradient ppERK régulier est observé dans les explants psm complets avec immunostaining. (C) Les explants disséqués des bourgeons de queue manquent une grande partie de la source de signalisation FGF postérieure. (D) Un signal ppERK très restreint postérieurement est observé dans les explants disséqués par les bourgeons de queue. (E) Psm antérieur et le tissu somitique peuvent être disséqués pour enlever les sources pour les facteurs de signalisation antérieurs possibles de PSM tels que la signalisation de RA. (F) L’élimination antérieure de PSM ne change pas l’étendue normale du gradient de ppERK. Des tissus ont été fixés 2 h après explanting pour immunostaining protocol. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film 1: Allongement de l’axe et segmentation de la somite dans les explants 3D. Lumière transmise à large champ (en haut) et GFP localisé nucléaire (rouge faussement coloré) images de time lapse (en bas) d’une chambre à glissière régulière explant monté à plat. Le tissu de queue explanted de l’embryon à l’étape 13 de somites. L’acquisition d’images est effectuée sur un microscope inversé avec des intervalles de trame de 3 min. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 2: Allongement de l’axe bloqué sur la chambre à glissière activée chimiquement. La lumière transmise à widefield (en haut) et les images d’épifluorescence localisées nucléaires GFP (rouge faussement coloré) (en bas) d’une explant montée à plat. Un explant d’embryon d’étape de 11 somites a été monté sur une chambre de lame enduite avec la solution de collagène de queue de rat pendant la minute 30 avant montage. L’acquisition d’images est effectuée sur un microscope inversé avec des intervalles de trame de 3 min. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 3: Montage latéral d’explants embryonnaires à un stade avancé. Widefield a transmis la lumière (à gauche) et les images localisées nucléaires d’épifluorescence (rouge faussement coloré) (droite) d’une chambre à glissière régulière explant montée latéralement. Le tissu de queue explanted de l’embryon à l’étape 15 de somites et la solution de tricaine a été employée comme anesthésiques. L’acquisition d’images est effectuée sur un microscope inversé avec des intervalles de trame de 3 min. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 4: Imagerie de résolution cellulaire unique des explants de queue. Imagerie confocale time-lapse d’une explant exprimant EGFP comme marqueur membranaire (rouge faussement coloré) et rouge lointain coloré pour les noyaux en direct (cyan faussement coloré). La projection d’intensité moyenne à partir de 5 couches z (10 μm) est montrée dans le film sur 1 heure. L’acquisition d’image est réalisée sur un microscope confocal inversé détecteur GaAsP avec une lentille objective apochromatique ×λS λS d’immersion dans l’eau 1.15 NA, avec des intervalles de trame de 4 min. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé d’une technique d’explant de culture de tissu que nous avons développée et employée récemment⁵ pour des embryons de poisson zèbre. Notre technique s’appuie sur les méthodes explant précédentes chez les poussins⁸ et les poissons^{zèbres 9,10,11} organismes modèles. Les explants de queue préparés avec ce protocole peuvent survivre aussi longtemps que >12 h dans une simple chambre à glissière, en continuant à allonger son axe principal du corps et à segmenter les somites, jusqu’à la fin de la somitogenèse.

Des précautions doivent être données pour garder le tissu explant en bonne santé et s’allonger avec succès pendant de longues durées. Tout d’abord, l’explant de tissu doit être disséqué sans endommager l’intégrité des tissus postérieurs. Nous avons observé que les cellules de peau fournissent une poche pour les cellules progénitrices neuromesodermal entrant dans le tailbud postérieur. Si la peau des explants se décolle de ces cellules très mobiles, quittez le tissu de tailbud et migrez postérieurement sur la lamelle au-delà des limites tissulaires. Deuxièmement, la tension médiaolatéralement déséquilibrée du tissu cutané peut entraîner un allongement divergent de l’axe, qui peut plier l’axe du PSM et du notochord. Une coupe à fente courte faite aux cellules de la peau flanquantes des deux côtés de l’explant aide à atténuer ce problème. Outre les préoccupations pertinentes pour la peau, une attention particulière doit être accordée au maintien de la stérilité des milieux de croissance et des outils de dissection pour les cultures de plus longue durée.

Avec des soins appropriés, la culture explante récapitule la croissance saine d’embryons entiers. Nous avons observé des contractions musculaires dans les explants à partir de 20 somites stade comme dans les embryons entiers¹². Bien que nous nous s’ayons concentré sur le tissu PSM pour l’étude de la segmentation de la somite, les tissus adjacents tels que l’ectoderme de la peau, la quille neurale (tige neurale et tube neural ultérieur), le notochord, le mésoderme des plaques intermédiaires et latérales restent également intacts dans les conditions de culture décrites(figure 1B). Ceci est particulièrement avantageux pour les tissus obscurcis par le jaune qui peuvent être enticatés en haute résolution au niveau d’explants montés ventralement, tels que le notochord, la vésicule de Kupffer et d’autres tissus se développant aux stades de segmentation^12. Il convient de souligner que le système explant ne se développe pas aussi rapidement que les embryons entiers et ne segmente pas les somites au même rythme que les embryons entiers. Cette limitation pour le système d’explantation peut également modifier la dynamique temporelle d’autres événements non observables ici.

Ici, nous avons présenté des résultats représentatifs qui mettent en évidence trois avantages majeurs du système d’explantation de la queue par rapport aux expériences sur des embryons entiers. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour démêler les rôles instructifs de l’allongement de l’axe à partir de gradients morphogènes pour la segmentation de la somite^5. Les progrès tardifs de la microscopie à feuille de lumière ont rendu possible l’imagerie vivante d’embryons^{entiers 13} pour plusieurs organismes modèles. Mais la plupart de ces méthodes n’ont toujours pas de résolution subcellulaire appropriée et sont à peine accessibles à l’ensemble de la communauté de recherche. Le modèle d’explantation de queue décrit ici rend l’imagerie vivante au niveau des tissus à résolution subcellulaire accessible avec de simples microscopes inversés ou confocaux. Outre les avantages méthodologiques, une telle imagerie en direct peut fournir des informations sur la segmentation de l’axe du corps des vertébrés postérieurs. En maintenant le protocole aussi direct et accessible que possible, le système explant peut également profiter au domaine plus large de la biologie du développement du poisson zèbre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP