En 3D tail explant kultur for å studere virveldyr segmentering i sebrafisk
Summary
Her presenterer vi protokollen for 3D-vevskultur av sebrafisk posterior kroppsaksen, noe som muliggjør live studie av virveldyrsegmentering. Denne explant-modellen gir kontroll over akseforlengelse, endring av morfinkilder og subcellulær oppløsning vevsnivå levende bildebehandling.
Abstract
Virveldyr embryoer mønster deres store kroppsakse som repeterende somitter, forløpere av ryggvirvler, muskler og hud. Somitter segmenterer gradvis fra presomitisk mesoderm (PSM) som haleenden av embryoet forlenger bakre. Somitter dannes med regelmessig periodicitet og skala i størrelse. Sebrafisk er en populær modellorganisme, da den er genetisk gjennomførbar og har gjennomsiktige embryoer som tillater levende avbildning. Likevel, under somitogenese, er fiskeembryoer pakket rundt en stor, avrunding av eggeplomme. Denne geometrien begrenser levende avbildning av PSM-vev i sebrafiskembryoer, spesielt ved høyere oppløsninger som krever en nær objektiv arbeidsavstand. Her presenterer vi en flatt 3D vevskulturmetode for levende avbildning av sebrafiskhaleutløp. Haleutløp etterligner intakte embryoer ved å vise en proporsjonal nedgang i akseforlengelse og forkorting av rostrocaudale somite lengder. Vi er videre i stand til å stoppe akseforlengelseshastighet gjennom utvisningskultur. Dette gjør det for første gang mulig for oss å løsne den kjemiske inngangen til signalgradienter fra den mekanistiske inngangen til aksial forlengelse. I fremtidige studier kan denne metoden kombineres med et mikrofluidisk oppsett for å tillate tidskontrollerte farmasøytiske perturbasjoner eller screening av virveldyrsegmentering uten problemer med legemiddelgjennomtrengning.
Introduction
Metamerisk segmentering av organismer er mye brukt i naturen. Gjentatte strukturer er avgjørende for funksjonalitet av laterale organer som ryggvirvler, muskler, nerver, kar, lemmer eller blader i en kroppsplan1. Som et resultat av slike fysiologiske og geometriske begrensninger i aksialsymmetrien, viser de fleste phyla av Bilateria- som annelider, leddyr og akkordater-utstilling segmentering av deres embryonale vev (f.eks. ektoderm, mesoderm) antero-posteriorly.
Virveldyrembryoer segmenterer sekvensielt deres paraksialmesoderm langs den store kroppsaksen til somitter med artsspesifikke intervaller, tellinger og størrelsesfordelinger. Til tross for slik robusthet blant individuelle embryoer i en art, er somittsegmentering allsidig mellom virveldyrarter. Segmentering skjer i et stort regime med tidsintervaller (fra 25 min i sebrafisk til 5 timer hos mennesker), størrelser (fra ~ 20 μm i hale somitter av sebrafisk til ~ 200 μm i trunk somitter av mus) og teller (fra 32 i sebrafisk til ~ 300 i maisslanger)2. Mer interessant kan fiskeembryoer utvikle seg i et bredt spekter av temperaturer (fra ~ 20,5 ° C opp til 34 ° C for sebrafisk) samtidig som de holder somittene intakte med riktige størrelsesfordelinger ved å kompensere for både segmenteringsintervaller og aksial forlengelseshastigheter. Utover slike interessante egenskaper forblir sebrafisk som en nyttig modellorganisme for å studere segmentering i vertebrater på grunn av den eksterne, synkrone og gjennomsiktige utviklingen av et mangfold av søskenembryoer samt deres tilgjengelige genetiske verktøy. Negativt fra et mikroskopiperspektiv utvikler teleostembryoer på en stor sfærisk eggeplomme, strekker og avrunder gasstrulateringsvevet rundt det (Figur 1A). I denne artikkelen presenterer vi en flatt 3D vev utvise kultur for sebrafisk haler. Dette eklantsystemet omgår de sfæriske begrensningene i eggeplommemasse, noe som gir tilgang til høyoppløselig levende avbildning av fiskeembryoer for somittmønster.
Figur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Sebrafiskembryoer har fordeler for levende avbildning, for eksempel gjennomsiktigheten av gastrulaterende embryonalt vev (blå), men vevet dannes rundt en klumpete sfærisk eggeplommemasse (gul) som forhindrer nesten objektiv, høyoppløselig avbildning i intakte embryoer. Haleutløp kan dissekeres fra og med en mikrokirurgisk kniv (brun) kuttet fra vevet fremre av somitter (rød) og fortsetter ved grensen med eggeplommen bakre. (B) Dissekerte haleutløp kan plasseres på en deksleslip (lyseblå) dorsoventrally; holde nevralt vev (lysegrå) på toppen og notokord (mørkegrå) nederst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for en vevskultur explant teknikk vi utviklet og brukte nylig5 for sebrafisk embryoer. Vår teknikk bygger på de tidligere explant-metodene i kylling8 og sebrafisk9,10,11 modellorganismer. Hale explants forberedt med denne protokollen kan overleve så lenge >12 h i et enkelt lysbildekammer, fortsetter å forlenge sin store kropps…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker AECOM Zebrafish Core Facility og Cincinnati Children’s Veterinary Services for fiskevedlikehold, Cincinnati Children’s Imaging Core for teknisk assistanse, Didar Saparov for hjelp med videoproduksjon og Hannah Seawall for redigering av manuskriptet. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under Prisnummer R35GM140805 til E.M.Ö. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. . Growth in length: Embryological Essays. , (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
