Summary
여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
Abstract
상피 이장애는 만성 상처, 염증 및 모든 인간 암의 80 % 이상을 포함하여 다양한 인간 질환과 질병을위한 노드입니다. 안 감 조직으로, 피부 상피는 종종 부상의 대상이 되며 손상 된 조직을 복구 하는 데 필요한 세포 가소성을 획득 하 여 진화적으로 적응. 수년에 걸쳐, 시험관 내 및 전 생체 세포 기지를 둔 모형을 사용하여 상피 가소성을 연구하기 위하여 몇몇 노력이 있었습니다. 그러나, 이러한 노력은 상피 세포 가소성의 다양한 단계를 재구성하는 능력에 제한되었습니다. 우리는 여기에서 1 차적인 신생아 인간 각질 세포에서 3D 표피 스페로이드 및 표피 스페로이드 유래 세포를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 표피 스페로이드 배양의 용량을 기능적으로 모델링하여 각질 세포 생성 가소성의 뚜렷한 단계를 모델링하고 표피 스페로이드 재도금이 이질적인 정상적인 인간 각질 세포(NHKc) 배양을 풍부하게할 수 있음을 입증하여 인테그린α6 hi/EGFR로아티뉴세포 와 같은 강화된 스모티코세포 와 같은 스모티코세포 분뇨 를 특징으로 합니다. 우리의 보고서는 피부 각질 세포 가소성 및 표피 재생의 연구를 위한 높은 처리량 시스템의 발달 그리고 유지에 설명합니다.
Introduction
포유류 계층화 상피는 모든 생활 시스템에서 가장 복잡한 상피 아키텍처이며 가장 자주 손상과 부상의 대상이됩니다. 보호 조직으로서, 계층화된 상피는 복잡하고 효과적인 조직 손상 반응을 생성하기 위해 진화했습니다. 부상 시, 이러한 세포는 리니지 가소성 프로그램을 활성화해야하며, 이를 통해 부상당한 부위로 마이그레이션하여 수리1,2,3을수행할 수 있습니다. 이 다각적 인 응답은 제대로 이해되지 않은 몇 가지 순차적 단계에서 발생합니다.
상피 재생의 복잡한 과정을 연구하는 데 있어 가장 큰 장애물은 세포 재생의 정의된 단계에서 동적 세포 활동을 포착할 수 있는 높은 처리량 모델 시스템의 발굴에 있습니다. 생체 내 마우스 모델은 상처 치유에 대한 관련 통찰력을 제공하고 인간의 재생 과정을 가장 밀접하게 재구성하지만, 개발은 힘든 노력과 상당한 비용이 필요하므로 처리량 용량을 제한합니다. 따라서 높은 처리량 규모에서 인간 상피 조직 재생의 기능적 조사를 가능하게 하는 시스템을 확립해야 하는 중요한 필요성이 존재합니다.
최근 몇 년 동안, 확장성 도전을 충족하기 위해 몇 가지 시도가 있었다. 이것은 생체 내 재생 컨텍스트를 밀접하게 모방하는 혁신적인 생체 외 및 전 생체 내 세포 기반 모델의 큰 확장을 통해 볼 수 있습니다. 여기에는 오르간 온 칩4,스페로이드5,오르간구이드6및 organotypic 배양7의발전이 포함됩니다. 이러한 3D 셀 기반 시스템은 각각 고유한 이점을 제공하고 고유한 실험적 한계를 제시합니다. 현재까지 스페로이드 배양은 가장 비용 효율적이고 널리 사용되는 3D 세포 배양 모델로 남아 있습니다. 그리고 여러 보고서는 스페로이드 배양이 피부 줄기 세포 특성을 연구하는 데 사용될 수 있음을 나타내지만, 이러한 연구는 주로 동물 조직8,9,또는 진피 섬유 아세포10으로수행되었으며, 인간 표피 스페로이드 배양의 재생 특성을 철저히 특성화하는 보고가 거의 없습니다. 이 프로토콜에서 우리는 일반적인 인간 각질 세포 (NHKc)에서 표피 스페로이드 문화의 기능 개발, 문화 및 유지 보수를 자세히 설명합니다. 우리는 동등하게 시험관 내에서 표피 재생 및 각질 줄기 세포 가소성의 순차적 단계를 모델링하기 위해이 시스템의 유용성을 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
피부 표본의 수집 및 취급 및 인간 각질 세포의 격리를 위한 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학 (UofSC) IRB에 의해 검토되고 "인간 과목을 포함하지 않는 연구"로 분류되었습니다, 포피 표본은 일상적인 외과 적 절차 (신네이트 소년의 할례) 동안 생성 된 외과 폐기로, 완전히 식별 정보가 없는. 이 프로토콜은 또한 UofSC 생물 안전 위원회에 의해 정기적으로 검토되고 승인되었으며 모든 실험실 직원은 실험실 생물 안전 교육을 받았습니다. 모든 절차는 UofSC의 안전 및 윤리 기준에 일치하여 수행되었습니다.
1. 신생아 포피부 조직에서 인간의 각질 세포의 격리 및 문화
- KSFM 배지의 500mL에 0.1 M HEPES 버퍼를 추가하여 세척 매체를 준비하고 7.2의 pH로 조정한다. 500mL 진공 필터(0.22 μm 모공 크기)로 배지를 살균합니다. MCDB 153-LB 기저형은 KSFM 대신 대체 세척 용액으로도 사용할 수 있습니다.
- 라미나르 플로우 후드에 50mL 원판 튜브에 5mL의 워시 미디어로 신생아 포피를 씻으십시오. 두 번 반복합니다.
- 씻은 포피를 멸균 페트리 접시에 옮기. 메스와 집게를 사용하여 진피 층에서 지방과 느슨한 결합 조직을 긁어 냅니다. 50mL 원물 튜브에서 5mL의 워시 미디어로 포피를 다시 씻습니다.
- 세차 성 에서 희석 된 디스파제 효소 2 mL (50 U /mL)을 포함하는 6 웰 플레이트에 포스킨 표피 면을 놓습니다.
- 플레이트를 4시간 동안 인큐베이터로 옮기(37°C, 5% CO2,습도 95%).
- 인큐베이터에서 포피를 제거하고 멸균 조건에서 페트리 접시로 옮습니다. 미세 팁 집게를 사용하여 표피를 진피 층과 분리합니다.
- 표피를 15mL 원추형 튜브에 넣고 0.25% 트립신-EDTA의 2mL를 함유한다. 5mL 세로지오티 파이프를 사용하여 부동 표피를 기계적으로 분쇄합니다. 37°C에서 15분 동안 배양하고 5분마다 5s의 주기적인 소용돌이를 처리합니다.
- 인큐베이션 후, 2mL의 대두 트립신 억제제를 넣고 배팅하여 트립신을 중화시다.
- 원심분리기 세포 현탁액은 450 x g에서2 분, 그리고 250 x g에서8 분 동안.
- 집게로 떠다니는 파편을 제거하고 셀 펠릿을 빼내지 않도록 주의하십시오. 셀 펠릿에서 신중하게 흡인 슈퍼내수.
- 10cm 접시에 KSFM-scm 중간 및 플레이트의 12mL에서 펠릿을 재중단합니다. 하룻밤 접시 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 다음 날, 지각 파이펫을 사용하여 매체를 제거하고 12mL 완전 KSFM-scm로 교체하십시오.
- 정상적인 인간 각질세포(NHKc) 배양의 최적의 성장을 유지하기 위해 10일째 1:5로 세포가 80% 이상의 인플루엔성을 달성하지 못하도록 한다.
2. 체외에서 피부 표피권 배양 생성
- 50mL 유리 병에 1x 인산완충식염(PBS)의 50mL에 아가로즈 2.5g을 첨가하여 5% 아가로즈 혼합물을 준비한다. 액체 주기 에서 자동 클바브 병. 실온까지 식힙니다.
- 플레이트를 준비하려면 200mL 의 다이온화 수(dH 2O)로 채워진 1L 플라스틱 비커에아가로즈 용액이 들어 있는 냉각된 유리 병을 놓습니다. 연구급 전자레인지에 아가로즈 혼합물을 최대 2분간 녹여 60년대마다 병을 부드럽게 기울여 혼합합니다.
주의: 전자레인지에 한천을 녹여면 플라스크 용기가 매우 뜨거워져 압력이 축적됩니다. 30s마다 방출 압력 축적. 부상을 방지하기 위해 적절한 보호 장비를 착용하십시오. - 1% 아가로즈(wt/vol)의 최종 농도를 위해 42°C로 예동된 12mL KSFM-scm에 용융 5% 아가로즈 3mL을 첨가한다.
선택 사항: 부드러운 한천의 조기 중합을 방지하기 위해 세로지 피펫 과 파이펫 팁을 미리 데워줍니다. - 1% 한고의 1%의 신속한 파이펫 200 μL은 멀티채널 피펫터(그림1A)를사용하여 96웰의 둥근 바닥 플레이트의 개별 우물으로 혼합된다. 아가로즈가 완전히 중합할 수 있도록 4h에 대해 25°C의 멸균 환경에 플레이트를 둡니다.
참고: 실험은 여기에서 중지하고 다음 날 계속될 수 있습니다. 중합화 아가로즈 플레이트는 파라필름 랩으로 밀봉될 때 최대 48시간 동안 최대 24시간 또는 4°C에서 37°C로 유지될 수 있다. 사용하기 전에 가습 된 인큐베이터에서 37 °C로 따뜻한 플레이트. - PBS의 2mL에서 세포및 세척 세포를 심는에 의해 구균 형성 NHKc를 통과한다. PBS를 흡인하고 세척 된 세포에 0.25 % 트립신 -EDTA의 2 mL을 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 또는 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 배양합니다. 접시에 콩 트립신 억제제 2 mL을 추가하고 15 mL 튜브로 접시에서 세포를 씻어. 원심 분리기 250 x g에서 5 분 동안.
- PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 트라이판 블루 스테인링과 혈종계 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 생존 가능성을 정량화합니다.
- Aliquot 2 x 104 NHKc 에서 KSFM-scm의 100 μL및 이전에 준비된 96웰 라운드 하단 플레이트의 개별 우물에 시드. 하룻밤 동안 배양 플레이트 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 반전 된 상 대비 현미경을 사용하여 표피 구체 형성을 위해 시드를 잘 분석하십시오.
참고: 정상적인 인간 각질 세포로부터의 인간 표피권은 세포 생존율이 현저한 감소에도 불구하고 최대 96h의 3D 서스펜션 배양에서 실행 가능한 상태를 유지할 수있습니다(그림 2).
3. 표피 스페로이드 재도금 분석
- 3D 표피피어 형성 후 24-48h, 6cm 접시에 예열된 KSFM-cm 4mL를 추가합니다. 넓은 보어 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 단일 스페로이드를 플레이트로 전송하여 분리하지 않도록 합니다. 또는 멸균 면도날을 사용하여 1mL 파이펫 팁을 넓히면 팁을 잘라냅니다.
- 하룻밤 접시를 배양 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 시드 스페로이드를 분석하여 플레이트 의 바닥에 부착하고 반전된 상 대비현미경(도 3)을사용하여 세포를 전파하는 것을 관찰한다. 플레이트 내부의 2mL를 부드럽게 제거하고 플레이트에 2mL 의 신선한 KSFM-scm 매체를 천천히 추가하여 96h마다 세포를 공급합니다.
- 통과 스페로이드 파생 (SD) NHKc 그들은 70-80 % 합류에 도달하고 선택의 분석으로 계속되면. SD-NHKc를 자주 모니터링하여 세포가 배양에 완전한 합류에 도달하지 못하도록 하는데, 이는 조기 분화 및 세포 성장 체포(그림3E-F)를초래한다.
- 표피 스페로이드 투석 분석 모델 각질 세포 매개 상처 수리 모델 각표 재생 가소성의 각 주요 순차적 단계를 캡처하여: a) 동종 성 유지 보수, b) 분화 정지/반전 c) 응력 계보 이동성, 및 d) 조직 복원(도 1B; 표 2)를참조하십시오. 이 분석체는 또한 조직래프팅 배양을 위한 세포 집단을 생산하거나 이전 작업 11,12에서입증된 바와 같이 HPV 매개 신동증을 모델링하는 데 사용될 수 있다.
4.3D 형광 세포 추적
- 6cm 접시에서, 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자를 운반하는 pMSCV-IRES-EGFP 플라스미드 벡터의 1 μg를 가진 트랜스펙트 스페로이드 형성 2D 단층 NHKc 배양. 하룻밤 동안 배양 플레이트 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도) 현미경(그림 4A).
참고: 혈청이 없는 항생제 없는 조건에서 트랜스페션을 완료하는 것이 중요합니다. - 경질 혼합물을 제거하지 않고, 세포에 미리 따뜻해지는 KSFM-cm 2mL을 추가합니다. 하룻밤 동안 배양 플레이트 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 플레이트에서 모든 배설물을 흡인하고 전동된 KSFM-cm3mL로 세포에 공급합니다.
- 통과 및 종자 2 x 104 EGFP-전소 세포는 이전에 준비된 96웰 라운드 하단 플레이트의 개별 우물로 들어갔다. 하룻밤 동안 배양 플레이트 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도). 형광 현미경의 FITC 채널 하에서 EGFPpos 스페로이드 세포 운동을 시각화하고 모니터링합니다(도4B-C).
- 도금 후 24시간, 6cm 접시에 미리 따뜻해지는 KSFM-cm 3mL을 추가합니다. 넓은 보어 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 단일 스페로이드를 플레이트로 전송하여 분리하지 않도록 합니다. 하룻밤 동안 배양 플레이트 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 형광 현미경을 사용하여 전파하는 SD-NHKcEGFP를 관찰하고 분석한다. 플레이트 내부의 미디어를 부드럽게 제거하고 플레이트에 2mL 신선한 KSFM-cm 미디어를 천천히 추가하여 96h마다 세포를 공급합니다.
- FACS 격리 또는 선택의 에세이에 대한 수확 SD-NHKCEGFP.
5. FACS에 의한 스페로이드 유래(SD) 하위 모집단의 특성화
- 패시터스 SD-NHKc 및 해당 자가 2D 단층 배양은 PBS의 2mL에서 오래된 미디어 및 세척 세포를 흡입하여. PBS를 제거하고 세척 된 세포에 0.25 % 트립신 -EDTA의 2 mL을 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 또는 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 배양합니다.
- 플레이트에 대두 트립신 억제제 2mL을 추가하고 세포를 15mL 튜브로 옮킨다. 원심 분리기 250 x g에서 5 분 동안.
- PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 트라이판 블루와 혈종계의 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 생존 가능성을 정량화합니다.
- 알리쿼트 100 μL 은 0.1-4 x 106 NHKc 세포를 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브로 함유한다. 라미나르 후드 내에서 밝은 조명을 끄고 만든 어두운 환경에서 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- FITC-공주 방지 제테그린α6 2μL과 PE-공주 방지 EGFR 2μL을 튜브에 추가하여 1:50 희석을 달성합니다. 염색되지 않은 대조군역할을 하기 위해 항체가 첨가되지 않은 튜브를 준비합니다. 어두운 얼음또는 4°C에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 비드 또는 피부 SCC 라인의 사용은 피부 SCC 세포가 인테그린α6 및 EGFR의 높은 수준을 발현하기 때문에 긍정적인 대조군역할을 할 수 있다.
- 적절한 레이저를 포함하는 선택의 흐름 세포계를 사용하여 유동 세포 측정 분석을 수행합니다.
- 네거티브 및 양수 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정합니다. 인테그린α6 하이/EGFR로 셀의 하위 집단을 정렬; 이들은 표피 줄기 세포 분획입니다. Integrinα6hi/EGFR하이 셀은 증식 전구 세포 분획이다. 인테그린α6lo/EGFR하이 셀은 커밋된 전구 세포 분획(도4D)이다. FACS 튜브를 정렬하는 것은 얼음 차가운 KSFM-scm의 적어도 1 mL을 포함해야합니다.
- PBS에서 정렬된 세포의 10배를 포함하는 15mL 원문 튜브로 각각의 각 선별 튜브의 함량을 전송하여 정렬된 세포 하위 집단의 증식 능력에 대한 테스트. 참고: 각질 세포가 종종 부착할 수 있으므로 정렬 FACS 튜브의 벽을 여러 번 파이프로 사용하여 림에 부착된 모든 셀을 제거하는 것이 중요합니다.
- 원심분리기 15mL 튜브 250 x g에서 5 분 동안. KSFM-scm의 12mL에서 상수체를 제거하고 펠릿을 재연하십시오. 재중단된 세포를 6cm 플레이트로 옮기고 하룻밤 동안 배양한다(37°C, 5%CO2,95% 습도).
- 다음날 플레이트에서 미디어를 제거하고 8mL 사전 따뜻하게 된 KSFM-cm. 인큐베이션을 37°C, 5% CO2,95% 습도에서 추가합니다. 70-80% 컨서블(그림4E)까지3일마다 12mL 배지로 세포를 다시 공급한다.
6. 기저 줄기 세포 마커에 대한 표피구의 면역 불발성 및 염색
- 폴리 리신으로 코팅 된 커버스립에 표피스피어를 전달합니다. SD-NHKc가 75%의 컨할 때까지 전파할 수 있도록 허용합니다.
- PBS (4 °C)에서 각각 5 분 동안 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.
- 실온에서 20분 동안 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 셀을 수정합니다.
- 1% 글리신에서 0.5% 트리톤 X-100으로 세포를 페메아빌화합니다. 실온에서 30분 동안 0.5% BSA 및 5% 염소 세럼을 사용하는 블록.
- P63(1:200) 및 사이토케라틴 14(1:200)에 대한 항체를 사용하여 샘플을 4°C에서 밤새 차단한다.
- 트위엔 20(PBST)을 함유한 PBS(4°C)로 3회 세척한 후 FITC-및 Alexa 568-컨쥬게이션이 있는 이차 항체(1:1000 희석)를 함유한 배양이 뒤따릅니다.
- 스테인 핵4', 6-디아미노-2-페닐린돌 (DAPI) (1:5000 희석) 장착 세포 전에.
- FITC 및 PE 레이저라인(도 4F)을사용하여 형광 성 유현미경을 사용하여 세포를 관찰한다.
7. 표피권 배양의 전사 분석
- RNA를 분리하기 위해 낮은 통로 NHKc 배양의 삼중 판판을 설정하면 동일한 자가 세포주로부터 단층, 스페로이드 및 스페로이드 유래 배양으로부터 이루어질 수 있다.
- 풀 3-5 상응하는 표피스피어를 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 넣습니다. 별도로 자가 수확 SD-NHKc 및 2D 단층 배양.
- 세 그룹 모두에서 총 RNA를 분리합니다.
- 총 RNA 의 1 μg로 역 전사를 수행합니다.
- cDNA를 사용하여 GAPDH를 내부제어(표 1)로사용하여 실시간 PCR을 수행합니다.
- 아가로즈 젤 전기포에 의한 앰플리통 제품 크기를 검증(2% v/v).
참고: 전체 게놈 마이크로어레이 분석을 사용하여 표피권 배양을 전사적으로 프로파일링하기 위해, 단일 NHKc 기증자의 질량 배양으로부터 총 RNA를 분리하고 동일한 기증자로부터 해당 SD-NHKc를 각각 6개로 복제합니다. - 적어도 9.0에서 9.1에 이르는 RNA 무결성 수(RIN)를 달성하기 위해 바이오 분석기를 사용하여 RNA 품질을 평가합니다.
- 총 RNA 샘플을 증폭하고 생체화하여 마이크로어레이 실험을 수행합니다.
- T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 NNN 무작위 프라이머를 사용하여 샘플당 총 RNA 의 100 ng를 ds-cDNA로 역전한다.
- T7 RNA 폴리머라아제를 cDNA 샘플에 첨가하여 RNA를 증폭한 다음 RNA를 ss-cDNA로 복사합니다. RNase H를 사용하여 과잉 RNA를 분해합니다.
- 조각 sscDNA 분자 및 비오틴 라벨.
- 45°C에서 16h에 라벨이 붙은 시료를 증폭시합니다.
- 혼성화 오븐과 세척 및 얼룩 키트를 사용하여 샘플을 혼성화합니다.
- 혼성 어레이를 세척하고 얼룩지게 합니다.
- 시스템 및 컴퓨터 워크스테이션을 사용하여 배열을 스캔합니다.
- 어레이 스캔이 완료된 후, 프로브 셀 강도(CEL) 파일을 발현 콘솔 소프트웨어로 가져오고 라이브러리 파일 및 RMA(견고한 멀티칩 분석) 알고리즘을 사용하여 CHP 파일을 생성합니다.
- Expression Console 내에서 데이터 품질을 확인한 후 각 프로브에 대한 log2 식 신호를 포함하는 CHP 파일을 전사 분석 소프트웨어에 가져와 분산의 주체 간 분석을 사용하여 셀 유형별 특정 전사 응답을 분석합니다.
8. SD-NHKc 식민지 형성 효율 평가
- 세포가 70-80%의 합류에 도달하면 플레이트에서 미디어를 흡인합니다. PBS(4°C)에서 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 100% 메탄올(4°C)의 3mL로 세포를 15분 동안 수정합니다. PBS에서 각각 5분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.
- 3mL의 3mL에서 30분 동안 10% 지름사에 스테인 셀. PBS에서 각각 5분 동안 세 번 씻으시면 됩니다. 세포가 밤새 건조하도록 허용하십시오.
- 다음 날 식민지 형성을 분석하고 얻은 식민지 수를 정량화
9. SD-NHKc 인구 두 배로 결정
- 2mL PBS에서 오래된 미디어 및 세척 세포를 심음하여 SD-NHKc 및 해당 자가 2D 단층 배양. PBS를 제거하고 세척 된 세포에 2 mL 0.25 % 트립신 -EDTA를 추가합니다. 5 분 동안 또는 모든 세포가 완전히 분리 될 때까지 배양 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 플레이트에 대두 트립신 억제제 2mL을 추가하고 세포를 15mL 튜브로 옮킨다.
- 원심 분리기 250 x g에서 5 분 동안.
- 상체를 제거하고 KSFM-scm의 12mL에서 펠릿을 다시 분리합니다.
- 저밀도 1-2 x 104 NHKc에서 종자 세포는 개별 10cm 요리로 하룻밤 동안 배양 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도).
- 다음날 8mL KSMF-scm로 플레이트를 공급합니다. 4일마다 25% 이상 소모될 때까지 먹이를 주고 2일마다 먹이실 수 있습니다.
- 세포증 용량이 소진될 때까지 60cm 요리에서 연속 통로 셀 1:5. 트라이판 블루 스테인링으로 셀 생존 가능성을 정량화합니다. 수식을 사용하여 각 통로에서 집단 이중을 결정합니다:로그(N/N0)/ log2, 여기서 N은 각 통로에서 얻은 총 세포 수를 나타내고 N0은 실험의 시작 부분에서 도금된 세포의 수를 나타낸다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
피부 표피피스피어 분석 시 NHKc 배양은 96웰플레이트(도 1A)의아가로즈 코팅 된 우물에서 시드된다. 스페로이드 형성 세포는 48시간 이내에 자가 집계되어야 합니다. 자율 스페로이드 형성은 표준 반전 위상 대비 현미경을 사용하여 24 시간 초에 평가될 수 있습니다. 피부 표피구 형성 및 재도금 분석 모델은 표피 조직 재생의 다양한단계(도 1B). 도 2는 3D 배양에서 표피 스페로이드 형성 능력을 위해 분석된 다양한 NHKc 균주의 고해상도 이미지를 나타낸다. 이것은 자발적인 스페로이드 형성의 특징이기 때문에 조밀 한 구 모양 응집세포를 검사하는 것이 중요합니다. 우리는 적절한 자발적 응집성을 보장하기 위해 2 x 104 세포 이상을 사용할 필요가 발견했습니다. 균주 도 2A에서볼 수 있는 비구형 세포 집계는 적절한 표피구 형성으로 간주되지 않는다. 2D 단층 배양에서 다시 비 스페로이드 형성 세포 현탁액을 도금하는 것은 거의 실행 가능한 NHKc 세포 성장의 결과. 그러나, 2D 배양에서 표피스피어의 도금은 소형 형 용 NHKc(도 3)의확산을 초래한다. 표피권 및 SD-NHKc의 이미지는 표준 반전 위상 대비 현미경을 사용하여 보고 모니터링할 수 있습니다. 이러한 배양문화를 100% 이하로 유지하는 것이 중요하다. 표피 스페로이드 형성의 과정은 형광 기자(도4A-C)와세포를 배분함으로써 단일세포 수준에서 기능적으로 추적될 수 있다. 최적의 조건에서, SD-NHKc 배양에서 주로 농축된 각질 세포 하위 인구는 Integrinα6hi/EGFRlo 세포입니다. 이러한 세포는 일반적으로 모든 SD-NHKc 배양의 약 25%를 구성하며FACS(도 4D)에의해 쉽게 분리될 수 있다. 그러나,이중(그림 4D)을제외하기 위해 전방 측 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A) 게이트를 설정하는 것이 중요하다. 이러한 줄기유사 각질세포 하위집단의 추가 특성화는 기저 사이토케라틴(14)과 종양 단백질 63(P63)과 같은 표피 줄기 세포 마커 발현의 면역형광 염색 분석에 의해 달성될 수있다(도 4F; 표 2)를참조하십시오.
도 1: 3D 서스펜션에서 NHKc 표피스피어의 재배. (A) 표피 스페로이드 재도금 분석의 회로도 표현 11에서적응. (B) 표피 스페로이드 재도금 분석의 각 순차적 단계에서 NHKc 배양, 표피 스페로이드 및 SD-NHKc의 대표적인 위상 대조 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 피부 표피권 성장 평가. (A) 6개의 개별 스페로이드 비형성 및 (B) 스페로이드 형성 NHKc 균주부 3D 서스펜션의 이미지. (C) 피피피어스는 다양한 양의 NHKc.(D) 부동 3D 서스펜션 배양에서 NHKc의 상이한 수량을 사용하여 수득된 평균 표피권 크기의 정량화를 이용하여 수득하였다. 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스페로이드 유래 배양 성장. (A) 24h, (B) 48h, (C) 72h, (D) 96h 후 2D 플라스틱 배양에서 재도금 후, 부착된 표피피어 24h, (B) 48h, (C) 및 (D) 96h에서 전파되는 SD-NHKc 단층 배양의 시간 과정 위상 대비 이미징. (E) SD-NHKc 배양은 각각 2D 플라스틱 배양에서 분리한 후 15일과 20일 동안 80%의 인플루엔자 및 (F) 100% 수렴을 한다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스페로이드 유래(SD) 하위 모집단의 특성화. (A) Woappi 외. 202012에의해 기술된 바와 같이 시험관내 표피스피어의 3D 세포 추적 분석의 회로도 표현. (B) EGFP-표현 표피스피어 2 h 및 (C) 24 h 시드 후 3D 배양에서 시드. (D) SD-NHKc 하위 집단의 형광 활성화 셀 분류(FACS). 모든 세포의 약 1/4th는 통합α6hi/EGFRlo여야한다. (E) Integrinα6hi/EGFRlo 하위 모집단은 각질 세포 홀로클론을 생성합니다. (F) Integrinα6 hi/EGFRlo 세포에서 기저 상피 줄기 세포마커 발현의 면역형 염색분석. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 시퀀스 (5'-3') | ||
| 유전자 이름 | 포워드 프라이머 | 역프라이머 |
| 알DH1 | GCACGCCAGACTTACCTCTC | CCTCCTCAGTTGCAG가타아AG |
| EGFR | 아갈카가그타카막카막카 | ATGAGGACATAACCACCACC |
| GAPDH | 개그가가트CCAAAT | GGCTGTCATCATCTCTCTCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT |
| K14 | 트가그CCGCATTGAACGAG | 개그랙트그지가트카가가 |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTACTATCAAAAAGG | 카가크카트택트GTGTGTGGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | 카그테카가가가트CG가아 |
| TP63 | 가카가타카가카가아그 | 아가카프GTCGAACTGTGC |
| β 액틴 | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAAACAATGCC | 카그카트카가타악 |
표 1. 신생아 각질 세포가 가소성에 관여하는 선택 유전자의 검출에 사용되는 PCR 프라이머 서열을 간략하게 설명합니다.
| 문화 조건 | 위상 대비 모양 | 면역 염색 | FACS 분석 | 전사 적 서명 | |
| 홈모틱 유지 보수 | 2D 단층 | 소형 셀 < 30 μm | K14, P63 | ITGα6메드/EGFP메드 | 표피 유지보수(K14, P63, IVL, K10) |
| 차별화 중지/반전 | 3D 스페로이드 | 컴팩트한 다세포 집계 > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N/A | 차별화 해제: 나노G, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| 스트레스 계보 이동성 | 3D-투-2D 스페로이드 부착 | 스페로이드 가장자리에서 소형 셀(< 20 μm)의 확산 | K14, P63, Ki-67 | ITGα6하이/EGFP메드 | 피부 세포의 증식: K14, K16, K17, Ki-67 |
| 조직 복원 | 3D-투-2D 스페로이드 모노레이어 | 20 μm< 소형 셀 전파 | K14, P63, IVL | ITGα6하이/EGFPlo 및 ITGα6하이/EGFP하이 | 표피 형성: K14, IVL, FLG |
표 2. 표피 스페로이드 레탈링 분석 분석의 표피 및 분자 특성화를 위한 전략.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D 스페로이드 배양 시스템의 사용은 세포 줄기를 평가하는 데 광범위한 유틸리티를 가지고 있다. 이러한 시스템은 조직 줄기 세포의 농축을 향상시키기 위해 입증되었습니다13,아직 인간의 표피 줄기 세포의 연구를위한 자신의 유틸리티는 제한적으로 탐구하고있다. 여기서는 3D 배양 기술을 사용하여 인간 각질 세포 줄기 세포를 풍부하게 하는 전략을 설명합니다. 이 시스템에서 NHKc는 KSFM-scm이 함유된 아가로즈 침대 위에 매달린 여러 각질 세포 구형으로 구성된 자체 조립 다세포 스페로이드 서스펜션으로 재배됩니다. 이 프로토콜에 대한 설정은 한천이 실온에서 빠르게 중합됨에 따라 시간에 민감합니다. 예열 세리컬 파이펫, 마이크로파이펫 팁, 그리고 한천/세포 혼합 튜브뿐만 아니라 42°C의 매체는 조기 중합을 극적으로 감소시킬 수 있다. 우리는 우물에 한천/미디어 믹스를 첨가한 직후 96웰 플레이트를 4°C에 넣으면 중합화를 상당히 가속화하고 한천 쿠션이 세포의 후속 파종에 충분히 견고하다는 것을 관찰했습니다. 중합 공정 동안 항상 플레이트) 수준을 유지하는 것이 중요하며, 한천/미디어 믹스의 중합이 불량하여 연한 한천 내부에서 세포가 파종되거나 자라는 결과를 초래하여 분석이 무효화된다.
또한 이 프로토콜에 설명된 2D 단층 배양에서 표피구를 전파하여 줄기와 같은 스페로이드 유래 세포를 생성하기 위한 전략을 제시합니다. 표피 스페로이드 재도금 분석은 줄기 세포와 같은 혈중 의 하부 집단인 인테그린α6hi/EGFRlo 각질 세포를 농축한다. 이들 세포는 표피 재구성, 건선, 또는 세포신화증(11,12,14)을연구하는 데 사용될 수 있다. Integrinα6hi/EGFRlo keratinocytes는 또한 FACS에 의해 쉽게 격리되고 면역 형광 염색을 특징으로 할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행 할 때, 우리는 컨트롤로 정렬되지 않은 자가 2D 단층 세포를 사용하는 것이 도움이 발견., 피부 SCC 세포주이러한 사용할 수없는 경우 좋은 대안이다.
요약하자면, 이 보고서는 동종 요법 유지, 분화 반전, 스트레스 계보 이동성 및 조직 복원의 4단계 각각을 캡처함에 따라 인간 표피 스페로이드 재도금 모델 인 체외에서각질 세포 재생 가소성을 다시 도금하는 것을 보여줍니다. 그러나, agar 기반 스페로이드 자체 조립의 한 가지 제한은 모든 NHKc 얼룩이 자발적으로 스페로이드를 형성 할 수 있다는 것입니다. 매달려 있는낙하방법(15)은 이 도전을 극복하고 다세포 구체 형성을 유도하는 좋은 대안 전략이다. 이 분석은 또한 표피 재생에 다양한 세포 집단의 기여에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 근육, 기질, 또는 면역 세포와 멀티플렉스 될 수있다. 마트리겔을 한천에 첨가하면 표피권 생존과 효능을 향상시킬 수 있는지 를 탐구하는 것이 흥미로웠습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 재정적 관계가 없습니다.
Acknowledgments
UofSC 의과 대학 계측 자원 시설 (IRF)은 이미징 및 세포 선별 장비 및 기술 지원에 대한 액세스를 제공했습니다. 이 작업은 보조금 1R21CA201853에 의해 부분적으로 지원되었습니다. MCF와 IRF는 NIH 보조금 P20GM103499, SC INBRE로부터 부분 지원을 받습니다. MCF는 또한 NIH 보조금 P20GM109091의 지원을 받습니다. 이본 워피(Yvon Woappi)는 NIH 보조금 2R25GM066526-06A1(PREP)과 R25GM076277(IMSD)과 UofSC의 그레이스 조던 맥파든 교수 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다. 제럴딘 에제카와 저스틴 베르첼리노는 UofSC에서 NIH 보조금 2R25GM066526-10A1 (PREP)에 의해 지원되었다. 숀 M. 블로오스는 UofSC에서 2016 마젤란 학자 상을 수상했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
