Summary
Her beskriver vi en protokol til systematisk dyrkning af epidermale sfæroider i 3D-suspensionskultur. Denne protokol har vidtrækkende anvendelser til brug i en række epitelvævstyper og til modellering af flere menneskelige sygdomme og tilstande.
Abstract
Epitel dysregulering er en node for en række menneskelige tilstande og lidelser, herunder kronisk sår, betændelse, og over 80% af alle humane kræftformer. Som en foring væv, huden epitel er ofte udsat for skade og har evolutionært tilpasset ved at erhverve den cellulære plasticitet er nødvendige for at reparere beskadiget væv. I årenes løb er der gjort en stor indsats for at studere epitelisk plasticitet ved hjælp af in vitro- og ex vivo-cellebaserede modeller. Disse bestræbelser har imidlertid været begrænsede i deres evne til at sammenfatte de forskellige faser af epitelcelleplastik. Vi beskriver her en protokol til generering af 3D epidermale sfæroider og epidermale sfæroide-afledte celler fra primære neonatal menneskelige keratinocytter. Denne protokol skitserer kapaciteten af epidermale sfæroid kulturer til funktionelt model forskellige stadier af keratinocyt generative plasticitet og viser, at epidermal sfæroid re-plating kan berige heterogene normale menneskelige keratinocytter (NHKc) kulturer for integrinα6hi/ EGFRlo keratinocyte subpopulationer med forbedret stilk-lignende egenskaber. Vores rapport beskriver udviklingen og vedligeholdelsen af et høj gennemløbssystem til undersøgelse af hudens keratinocyt plasticitet og epidermal regenerering.
Introduction
Det stratificerede epitel fra pattedyr er den mest komplekse epitelarkitektur i alle levende systemer og er oftest udsat for skader og skader. Som et beskyttende væv, stratificeret epitel har udviklet sig til at generere en kompleks og effektiv vævsskade respons. Ved skade skal disse celler aktivere afstamningsplastikprogrammer, som gør det muligt for dem at migrere til det skadede sted og udføre reparation1,2,3. Denne mangefacetterede reaktion forekommer i flere sekventielle trin, som forbliver dårligt forstået.
En væsentlig hindring i at studere den indviklede proces med epitel regenerering ligger i manglen på høj gennemløb modelsystemer, der kan fange dynamiske cellulære aktiviteter på definerede stadier af celle regenerering. Mens in vivo musemodeller giver relevant indsigt i sårheling og bedst opsummerer den menneskelige regenerative proces, kræver deres udvikling en møjsommelig indsats og betydelige omkostninger, hvilket begrænser deres gennemløbskapacitet. Der er derfor et kritisk behov for at etablere systemer, der muliggør funktionel undersøgelse af regenerering af humant epitelvæv ved høj gennemstrømningsskala.
I de senere år er der gjort adskillige forsøg på at tage udfordringen med skalerbarhed op. Dette ses gennem en stor udvidelse af innovative in vitro- og ex vivo-cellebaserede modeller, der nøje efterligner den in vivo-regenerative kontekst. Dette omfatter fremskridt inden for organ-on-chip4, sfæroid5, organoid6og organotypiske kulturer7. Disse 3D cellebaserede systemer tilbyder hver især unikke fordele og præsenterer forskellige eksperimentelle begrænsninger. Til dato er sfæroidkultur fortsat den mest omkostningseffektive og udbredte 3D-cellekulturmodel. Og mens flere rapporter har indikeret, at sfæroidkulturer kan bruges til at studere hudstamcelleegenskaber, er disse undersøgelser stort set blevet udført med dyrevæv8,9, eller med dermale fibroblaster10, med næsten ingen rapporter, der grundigt karakteriserer de regenerative egenskaber hos menneskelige epidermale sfæroidkulturer. I denne protokol beskriver vi den funktionelle udvikling, kultur og vedligeholdelse af epidermale sfæroide kulturer fra normale menneskelige keratinocytter (NHKc). Vi beskriver ligeledes nytten af dette system til at modellere de sekventielle faser af epidermal regenerering og keratinocyt stamcelle plasticitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for indsamling og håndtering af hudprøver og isolering af menneskelige keratinocytter er blevet gennemgået af University of South Carolina (UofSC) IRB og klassificeret som "forskning, der ikke involverer mennesker", da forhuden prøver var kirurgiske udsmid produceret under rutinemæssige kirurgiske procedurer (omskæring af nyfødte drenge) og var helt blottet for at identificere oplysninger. Protokollen blev også regelmæssigt gennemgået og godkendt af UofSC's biosikkerhedsudvalg, og alt laboratoriepersonale gennemgik laboratoriebiosikkerhedsuddannelse. Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med UofSC's sikkerheds- og etiske standarder.
1. Isolering og kultur af humane keratinocytter fra neonatalt forhudensvæv
- Forbered vaskemediet ved at tilføje 0,1 M HEPES-buffer til 500 mL KSFM-medium og justere det til en pH-værdi på 7,2. Steriliser medium i et 500 mL vakuumfilter (0,22 μm porestørrelse). MCDB 153-LB basal medium kan også bruges som en alternativ vaskeløsning i stedet for KSFM.
- I en laminar flow hætte, vask neonatal forhuden med 5 mL vask medier i en 50 mL konisk rør. Gentag to gange.
- Overfør vasket forhuden til en steril petriskål. Brug en skalpel og pincet, skrabe fedt og løs bindevæv fra dermal lag. Genopvask forhuden med 5 mL vaskemedier i et 50 mL konisk rør.
- Forhudens epidermis side op i en 6-brønds plade, der indeholder 2 mL dispaseenzym fortyndet i vaskemedier (50 U/mL).
- Pladen overføres til en inkubator i 4 timer (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Fjern forhuden fra inkubatoren og overfør den under sterile forhold til en petriskål. Brug finspids-tang, adskille epidermis fra dermis lag.
- Der anbringes epidermis i et konisk rør på 15 mL med en 2 mL på 0,25% Trypsin-EDTA. Ved hjælp af en 5 mL serologisk pipet knuses den flydende epidermis mekanisk. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C med periodisk hvirvelstrøm i 5 s hver 5 min.
- Efter inkubation tilsættes 2 mL sojabønne trypsinhæmmer og blandes ved pipettering for at neutralisere trypsin.
- Centrifuge celle suspension i 2 min ved 450 x g, og derefter i 8 min ved 250 x g.
- Fjern flydende snavs med pincet, og pas på ikke at løsne cellepillen. Forsigtigt aspirere supernatant fra cellepillen.
- Genbrugt pellet i 12 mL komplet KSFM-scm medium og plade i en 10 cm skål. Inkubatret skål natten over (37 °C, 5% CO2,95% fugtighed).
- Den følgende dag fjernes mediet ved hjælp af en sugende pipette og erstattes med 12 mL komplet KSFM-scm. Gentag på dag 4 og 7.
- For at opretholde optimal vækst af normale humane keratinocyte (NHKc) kulturer, passage celler 1:5 på dag 10 for at forhindre celler i at opnå større end 80% sammenløb.
2. Generering af hud epidermosfæren kulturer in vitro
- Der fremstilles en blanding på 5 % agarose ved at tilsætte 2,5 g agarose til 50 mL 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) i en 50 mL glasflaske. Autoklaveflaske under flydende cyklus. Lad det køle af til stuetemperatur.
- For at forberede plader skal den afkølede glasflaske, der indeholder agaroseopløsning, anbringes i et 1 L plastbæger fyldt med 200 ml deioniseret vand (dH2O). Smelt agaroseblandingen i en mikrobølge i forskningskvalitet i op til 2 minutter, bland agaren hver 60. s ved forsigtigt at vippe flasken fra side til side.
ADVARSEL: Smeltning af agar i mikrobølgeovnen vil få kolbebeholderen til at blive ekstremt varm, hvilket resulterer i trykopbygning. Slip tryk oprustning hver 30 s. Brug passende beskyttelsesudstyr for at forhindre skader. - Der tilsættes 3 mL smeltet 5% agarose til 12 mL KSFM-scm forvarmet til 42 °C for en endelig koncentration på 1% agarose (wt/vol. ).
Valgfrit: Forvarm de serologiske pipetter og pipettespidser for at forhindre for tidlig polymerisering af den bløde agar. - Pipetter hurtigt 200 μL af 1% agarblandingen i individuelle brønde af en 96-brønds rundbundsplade ved hjælp af en multikanalpipetor(Figur 1A). Lad pladen stå i sterilt miljø ved 25 °C i 4 timer, så agarose kan polymeriseres fuldstændigt.
BEMÆRK: Eksperimenter kan stoppes her og fortsættes næste dag. Polymeriserede agaroseplader kan opbevares ved 37 °C op til 24 timer eller ved 4 °C i op til 48 timer, når de forsegles med parafilmindpakning. Varm plade til 37 °C i en befugtet inkubator i mindst 1 time før brug. - Passage sfæroid-dannende NHKc ved indsugning medier og vaskeceller i 2 mL PBS. Aspirat PBS og tilsæt 2 mL af 0,25% Trypsin-EDTA til vaskede celler. Inkuber i 5 min ved 37 °C, eller indtil alle celler løsnes helt. Tilsæt 2 mL Sojabønne Trypsin-hæmmer til plade og vask celler fra pladen i et 15 mL rør. Centrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Genbrugt pellet i 1 mL PBS. Kvantificer celle levedygtighed ved hjælp af trypan blå farvning og en hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller.
- Aliquot 2 x 104 NHKc i 100 μL KSFM-scm og frø i individuelle brønde af tidligere forberedt 96-godt rundbundet plade. Inkubatplade natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Brug et omvendt fasekontrastmikroskop til at analysere seedet godt til epidermosfæredannelse.
BEMÆRK: Humane epidermospheres fra normale humane keratinocytter kan forblive levedygtige i 3D-suspensionskultur i op til 96 timer, dog med betydeligt fald i celle levedygtighed (Figur 2).
3. Epidermal sfæroid re-plating assay
- 24-48 timer efter 3D epidermosphere dannelse, tilsæt 4 mL forvarmet KSFM-scm til en 6 cm skål. Brug en bred boring 1 mL pipette spids til at overføre en enkelt sfæroid til pladen, sikre at ikke bryde det fra hinanden. Alternativt kan du udvide en 1 mL pipettespids ved hjælp af et sterilt barberblad for at skære spidsen.
- Pladen inkuberes natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Analysere seedet sfæroid til fastgørelse i bunden af pladen og observere for formering af celler ved hjælp af en omvendt fase kontrast mikroskop (Figur 3). Foderceller hver 96 timer ved forsigtigt at fjerne 2 mL af mediet inde i pladen og langsomt tilføje 2 mL frisk KSFM-scm medier til pladen.
- Passage sfæroid-afledt (SD) NHKc når de når 70-80% sammenløb og fortsætte med assay valg. Monitor SD-NHKc ofte for at forhindre celler i at nå fuld sammenløb i kulturen, da dette resulterer i for tidlig differentiering og cellevækst anholdelse (Figur 3E-F).
- Den epidermale sfæroide, der afviser analysemodeller keratinocyt-medieret sårreparation ved at indfange hver af de vigtigste sekventielle faser af epidermal regenerativ plasticitet: a) homeostatisk vedligeholdelse, b) differentieringsstop/vending c) stressafstivningsmobilitet og d) vævsgendannelse(figur 1B; Tabel 2) Denne analyse kan også bruges til at producere cellepopulationer til organotypiske flådekulturer eller til at modellere HPV-medieret neoplasi som demonstreret i vores tidligere arbejde 11,12.
4.3D sporing af fluorescensceller
- I en skål på 6 cm, transfekt sfærisk dannende 2D monolayer NHKc kulturer med 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plasmid vektor transporterer forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) gen. Inkubatplade natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed) mikroskop(figur 4A).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at transfekten gennemføres under serumfrie antibiotikafrie forhold. - Uden at fjerne transfektblandingen tilsættes 2 mL forvarmet KSFM-scm til cellerne. Inkubatplade natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Aspirat alle transfektmedier fra plade- og foderceller med 3 mL forvarmet KSFM-scm. Vurder for tilstedeværelse af EGFP-udtrykkende celler under FITC-kanalen af et fluorescerende mikroskop.
- Passage og frø 2 x 104 EGFP-transfected celler i individuelle brønde af en tidligere forberedt 96-godt rundbundet plade. Inkubatplade natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed). Visualiser og overvåg EGFPpos sfæroidcellebevægelse under FITC-kanalen af et fluorescensmikroskop(figur 4B-C).
- 24 timer efter plating tilsættes 3 mL forvarmet KSFM-scm til en 6 cm skål. Brug en bred boring 1 mL pipette spids til at overføre en enkelt sfæroid til pladen, sikre at ikke bryde det fra hinanden. Inkubatplade natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Overhold og analyser formering af SD-NHKcEGFP ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Foderceller hver 96 h ved forsigtigt at fjerne 2 mL mediet inde i pladen og langsomt tilføje 2 mL frisk KSFM-scm medier til pladen.
- Høst SD-NHKCEGFP for FACS isolation eller assays valg.
5. Karakterisering af sfæroid-afledte (SD) delpopulationer af FACS
- Passage SD-NHKc og tilsvarende autologe 2D monolayer kulturer ved at aspirere gamle medier og vaske celler i 2 mL PBS. Fjern PBS og tilsæt 2 mL af 0,25% Trypsin-EDTA til vaskede celler. Inkuber ved 37 °C i 5 min. eller indtil alle celler løsnes helt.
- Tilsæt 2 mL sojabønne trypsinhæmmer til plade og overføre celler til et 15 mL rør. Centrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Genbrugte pellets i 1 mL PBS. Kvantificere celle levedygtighed ved hjælp af trypan blå og en automatiseret celle tæller af hæmometer.
- Aliquot 100 μL indeholdende 0,1-4 x 106 NHKc celler til 1,5 mL mikrocentrifuge rør. Placer røret på is i et mørkt miljø, skabt ved at slukke lyse lys i laminar hætten.
- Der tilsættes 2 μL FITC-konjugeret anti-integrinα6 og 2 μL PE-konjugeret anti-EGFR til rør for at opnå en 1:50 fortynding. Forbered et rør uden antistoffer tilsættes for at tjene som den uhæmmede kontrol. Rør, der inkuberes på is i mørke eller ved 4 °C i 30 minutter. Brugen af perler eller en SCC-hudlinje kan tjene som positiv kontrol, da hudens SCC-celler udtrykker forhøjede niveauer af integrinα6 og EGFR.
- Udfør flowcytometrianalyse ved hjælp af flowcytometer, der indeholder med passende lasere.
- Brug de negative og positive kontroller til at oprette porte. Sortere underpopulationen af integrinα6hi/EGFRlo celler; disse er den epidermale stamcellefraktion. Integrinα6hi/EGFRhi-celler er den proliferative stamcellefraktion. Integrinα6lo/EGFRhi-cellerne er den bindende stamcellefraktion ( Figur4D). Sortering facs rør (r) skal indeholde mindst 1 mL iskold KSFM-scm.
- Test for proliferativ kapacitet af sorterede celleunderpopulationer ved at overføre indholdet af hvert respektive sorteringsrør til et 15 mL konisk rør, der indeholder 10x mængden af sorterede celler i PBS. BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne alle celler, der er fastgjort til fælgen, ved at pipettere væggen i sorterings-FACS-rørene flere gange, da keratinocytter ofte kan klæbe der.
- Centrifuge 15 mL rør ved 250 x g i 5 min. Supernatant og resuspend pellet fjernes i 12 mL KSFM-scm. De genindførte celler overføres til en 6 cm plade, og der inkuberes natten over (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Den næste dag skal du fjerne medier i plader og tilføje 8 mL forvarmet KSFM-scm. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed. Re-feed celler med 12 mL medium hver 3. dag indtil 70-80% sammenfald (Figur 4E).
6. Immunfluorescens og farvning af epidermosfærer til basale stamcellemarkører
- Overfør epidermospheres på coverslips belagt med poly-lysin. Lad SD-NHKc formere sig indtil 75% sammenløb.
- Cellerne vaskes to gange i PBS (4 °C) i 5 min.
- Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min ved stuetemperatur.
- Gennemtrænge celler med 0,5% Triton X-100 i 1% glycin. Blok ved hjælp af 0,5% BSA og 5% gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber prøver med antistoffer mod P63 (1:200) og cytokeratin 14 (1:200) i blokeringsopløsning natten over ved 4 °C.
- Der vaskes tre gange med PBS (4 °C), der indeholder Tween 20 (PBST), efterfulgt af inkubation med FITC-og Alexa 568- konjugerede sekundære antistoffer (1:1000 fortynding).
- Pletkerner med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:5000 fortynding) før montering af celler.
- Overhold celler ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med FITC- og PE-laserlinjer(Figur 4F).
7. Transskriptionel analyse af epidermosfærens kulturer
- Opsæt tre eksemplarer plader af lav passage NHKc kulturer til at isolere RNA kan være fra monolayer, sfheroid, og sfæroid-afledte kulturer fra samme autologe celle linje.
- Pool 3-5 tilsvarende epidermospheres i et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Høst autologe SD-NHKc- og 2D-monolagskulturer separat.
- Isoler det samlede RNA fra alle tre grupper.
- Udfør omvendt transskribering med 1 μg samlet RNA.
- Brug cDNA til at udføre PCR i realtid ved hjælp af GAPDH som et internt kontrolelement (Tabel 1).
- Validering af ampliconproduktstørrelsen ved hjælp af agarosegelelektroforese (2% v/v).
BEMÆRK: For transskription-dækkende profilering af epidermosphere kulturer ved hjælp af hele genom mikroarray analyse, isolere samlede RNA fra massekulturer af en enkelt NHKc donor og tilsvarende SD-NHKc fra samme donor, i seks replikerer hver. - Vurder RNA-kvaliteten ved hjælp af en bioanalyzer for at opnå RNA Integrity Numbers (RIN) fra mindst 9,0 til 9,1.
- Udfør mikroarray eksperimenter ved at forstærke og biotinylere samlede RNA prøver.
- Omvendt transskribering 100 ng af det samlede RNA pr. prøve til ds-cDNA ved hjælp af NNN tilfældige primere, der indeholder en T7 RNA polymerasepromotorsekvens.
- Tilføj T7 RNA polymerase til cDNA prøver for at forstærke RNA, og kopier derefter RNA til ss-cDNA. Fornedr overskydende RNA ved hjælp af RNase H.
- Fragment sscDNA molekyler og etiket med biotin.
- Forstærke mærkede prøver i 16 timer ved 45 °C.
- Hybridiser prøver ved hjælp af en hybridisering ovn og en vask og plet kit.
- Vask og plette hybridiserede arrays.
- Scan arrays ved hjælp af en system- og computerarbejdsstation.
- Når matrixscanningerne er afsluttet, skal du importere CEL-filer (Probe Cell Intensity) til udtrykskonsolsoftware og behandle på genniveau ved hjælp af biblioteksfil og RMA-algoritme (Robust Multichip Analysis) til at generere kraftvarmefiler.
- Når du har bekræftet datakvaliteten i Expression Console, skal du importere CHP-filer, der indeholder log2-udtrykssignaler for hver sonde, til en transskriptionsanalysesoftware for at analysere celletypespecifikke transskriptionelle svar ved hjælp af envejs mellem emneanalyse af varians.
8. Vurdering af SD-NHKc kolonidannende effektivitet
- Indsug medier fra plader, når cellerne når 70-80% sammenløb. Cellerne vaskes tre gange i PBS (4 °C) i 5 min hver.
- Der fastgøres celler med 3 mL 100% methanol (4 °C) i 15 min. Vask tre gange i PBS i 5 min hver.
- Pletceller i 3 mL på 10% Giemsa i 30 min. Vask tre gange i PBS i 5 min hver. Lad cellerne lufttørre natten over.
- Analyser kolonidannelse den følgende dag, og kvantificer antallet af opnåede kolonier
9. Bestem SD-NHKc befolkning fordoblinger
- Passage SD-NHKc og tilsvarende autologe 2D monolayer kulturer ved at aspirere gamle medier og vaske celler i 2mL PBS. Fjern PBS og tilsæt 2 mL 0,25% Trypsin-EDTA til vaskede celler. Inkuber i 5 minutter, eller indtil alle celler helt løsner sig (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Tilsæt 2 mL sojabønne trypsinhæmmer til plade og overføre celler til et 15 mL rør.
- Centrifuge ved 250 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes og den genudnyttede pellet fjernes i 12 mL KSFM-scm.
- Frøceller med lav densitet 1-2 x 104 NHKc i individuelle 10 cm retter og inkubere natten over (37 °C, 5% CO2,95% fugtighed).
- Foderplader med 8 mL KSMF-scm den følgende dag. Foder hver 4. dag, indtil mindst 25% sammenløb, og foder derefter hver 2. dag.
- Serielt passage celler 1:5 i 60 cm retter, indtil cellen proliferative kapacitet er opbrugt. Kvantificere celle levedygtighed ved trypan blå farvning. Fastlæg en fordobling af populationen ved hver passage ved hjælp af formlen: log(I/N0) / log2, hvor N repræsenterer det samlede cellenummer, der opnås ved hver passage, og N0 repræsenterer antallet af celler, der er belagt i begyndelsen af eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under huden epidermosphere assay, NHKc kulturer er seedet i agarose-belagt brønde af en 96-brønd plade (Figur 1A). Sfæroiddannende celler skal selvaggregateres inden for 48 timer. Autonom sfæroiddannelse kan vurderes allerede 24 timer ved hjælp af et standard inverteret fasekontrastmikroskop. hudens epidermosfæredannelse og genuddannelse af analysemodel forskellige faser af regenerering af epidermalt væv (figur 1B). Figur 2 viser billeder i høj opløsning af forskellige NHKc-stammer, der er analyseret for epidermal sfæroiddannelsesevne i 3D-kultur. Det er vigtigt at undersøge cellerne for tæt kugleformssammenlægning, da dette er kendetegnende for spontan sfæroiddannelse. Vi fandt det nødvendigt at bruge mere end 2 x 104 celler for at sikre korrekt spontan sammenlægning. Ikke-sfærisk cellesammenlægning, som det ses i stammer Figur 2A, betragtes ikke som tilstrækkelig epidermosfæredannelse. Plating ikke-sfæroid danner celle suspensioner tilbage i 2D monolayer kultur sjældent resulterer i levedygtige NHKc cellevækst. Belægning af epidermosfærer i 2D-kultur resulterer imidlertid i spredning af små levedygtige NHKc (figur 3). Billeder af epidermospheres og SD-NHKc kan ses og overvåges ved hjælp af et standard inverteret fasekontrastmikroskop. Det er vigtigt at fastholde disse kulturer under 100% sammenløb, da dette i høj grad kan hæmme deres vækst og stamcelletilstand i kulturen (figur 3E-F). Processen med epidermal sfæroiddannelse kan funktionelt spores på enkeltcelleniveau ved at transfektere celler med en fluorescerende reporter (Figur 4A-C). Under optimale forhold er keratinocyt subpopulation primært beriget i SD-NHKc kulturer Integrinα6hi/EGFRlo celler. Disse celler udgør generelt ca. 25% af alle SD-NHKc kulturer og kan let isoleres af FACS (Figur 4D). Det er dog vigtigt at etablere fremskudte spredningsområde (FSC-A) og side scatter area (SSC-A) porte for at udelukke doublets (Figur 4D). Yderligere karakterisering af denne stængellignende keratinocyt subpopulation kan opnås ved immunfluorescerende farvning analyse af epidermal stamcelle markør udtryk, såsom basal cytokeratin 14 (K14) og tumor protein 63 (P63) (Figur 4F; Tabel 2)
Figur 1: Dyrkning af NHKc epidermospheres i 3D-suspension. (B) Repræsentative fasekontrastbilleder af NHKc-kulturer, epidermale sfæroider og SD-NHKc på hvert sekventielt trin i den epidermale sfæroide re-plating assay. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vurdering afhudens epidermosfærevækst. (A) Billeder af seks individuelle sfæroide ikke-dannende og (B) sfæroiddannende NHKc-stammer i flydende 3D-suspension. C) Epidermospheres opnået ved hjælp af forskellige mængder NHKc. (D) Kvantificering af den gennemsnitlige epidermosfærestørrelse opnået ved hjælp af forskellige mængder NHKc i flydende 3D-suspensionskultur. Søjler angiver standardafvigelse. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Voksende sfæroid-afledte kulturer. (A) Tidsforløbsfasekontrastbilleddannelse af SD-NHKc monolayerkulturer, der formerer sig fra en vedhæftet epidermosfære 24 timer, (B) 48 h, (C) 72 h og (D) 96 h efter genudsætning i 2D-plastkultur. (E) SD-NHKc kulturer på 80% sammenløb og (F) 100% sammenløb 15 og 20 dage efter replating i 2D plast kultur, hhv. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Karakterisering af sfæroidafledte (SD) underpopulationer. (A) Skematisk repræsentation af 3D-cellesporingsanalyse af epidermospheres in vitro som beskrevet af Woappi et al. 202012. b) EGFP-udtrykkende epidermosfærer 2 h og C 24 timer efter såning i 3D-kultur. (D) Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af SD-NHKc-delpopulationer. Ca. 1/4af alle celler skal være integrinα6hi/EGFRlo. (E) Integrinα6 hi/EGFRtil delpopulationer producerer keratinocyte holoclones. F) Immunfluorescerende farvningsanalyse af basale epitel stamcellemarkørudtryk i Integrinα6hi/EGFRlo celler. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer sekvens (5'-3') | ||
| Gennavn | Fremad primer | Omvendt primer |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| Globaliseringsfonden | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | AVS-STATERNES VIRKSOMHED | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabel 1. Skitserer PCR primer sekvenser, der anvendes til påvisning af udvalgte gener, der er involveret i neonatal keratinocyt plasticitet.
| Kultur tilstand | Udseende af fasekontrast | Immunostaining | Analyse af FACS | Transskriberingssignatur | |
| Vedligeholdelse af homeostatic | 2D monolayer | Små celler < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Vedligeholdelse af epidermale (K14, P63, IVL, K10) |
| Differentieringsstop/tilbageførsel | 3D-kugleformet | Kompakt multicellulært aggregat > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | NIELSEN | Dedifferentiering: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Stress afstamning mobilitet | 3D-til-2D-kasseformet vedhæftet fil | Diffusering af små celler (< 20 μm) fra kuglekanten | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hi/EGFPmed | Spredning af hudceller: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Væv restaurering | 3D-til-2D sfærisk monolag | Overførsel af små celler < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo og ITGα6hi/EGFPhi | Dannelse af epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabel 2. Strategier for fænotypisk og molekylær karakterisering af den epidermale sfæroid replaterende analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af 3D-sfæroidkultursystemer har haft bred nytte ved vurderingen af cellestamme. Disse systemer har vist sig at øge berigelsen af vævsstamceller13, men deres nytteværdi for studiet af humane epidermale stamceller er blevet begrænset undersøgt. Her beskriver vi en strategi for berigelse af menneskelige keratinocyt stamceller ved hjælp af 3D-kulturteknikker. I dette system dyrkes NHKc som selvsamlende multicellulære sfæroidaffjedringer, der består af flere keratinocytundertyper suspenderet oven på agarose senge indeholdende KSFM-scm. Opsætningen af denne protokol er tidsfølsom, da agar polymeriserer hurtigt ved stuetemperatur. Forvarmning af serologiske pipetter, mikropipettespidser og agar/celleblandingsrøret samt medierne til 42 °C kan dramatisk reducere for tidlig polymerisering. Vi bemærkede, at placering af 96-brøndspladen i 4 °C kort efter tilsætning af agar/medieblanding til brønde kan fremskynde polymeriseringen betydeligt og sikre, at agarpuden er tilstrækkelig fast til efterfølgende såning af celler. Det er vigtigt at opretholde pladen) niveau på alle tidspunkter i løbet af polymeriseringsprocessen, som dårlig polymerisering af agar / medier mix vil resultere i celler såning eller voksende inde i den bløde agar, ugyldig assay.
Også skitseret i denne protokol, præsenterer vi en strategi for udbredelse af epidermospheres i 2D monolayer kultur til at generere stamceller-lignende sfæroid-afledte celler. Den epidermale sfæroide re-plating assay beriger for en stamcelle-lignende subpopulation af integrinα6hi/EGFRlo keratinocytter. Disse celler kan bruges til at studere epidermal genopbygning, psoriasis eller cellulær neoplasi11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo keratinocytter kan også let isoleres af FACS og karakteriseres ved immunfluorescent farvning. Når vi udførte sådanne eksperimenter, fandt vi det nyttigt at bruge usorterede autologe 2D-monolayerceller som kontroller., hud-SCC-cellelinjer er et godt alternativ Hvis disse ikke er tilgængelige.
Sammenfattende viser denne rapport, at humane epidermale sfæroide re-plating modeller keratinocyt regenerativ plasticitet in vitro, da det fanger hver af de fire faser af regenerering: homeostatic vedligeholdelse, differentiering vending, stress afstamning mobilitet, og væv restaurering. Men en begrænsning af agar-baserede sfæroid selvmontering er, at ikke alle NHKc pletter er i stand til spontant at danne sfæroider. Den hængende dråbe metode15 er en god alternativ strategi til at overvinde denne udfordring og til at tvinge fremkalde multicellulære sfæroid dannelse. Denne analyse kan også multiplekseres med muskler, stromale eller immunceller for at få yderligere indsigt i bidraget fra forskellige cellepopulationer på epidermal regenerering. det ville være interessant at undersøge, om tilføjelsen af Matrigel i agaren kunne forbedre epidermosphere overlevelse og styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke økonomiske relationer til at afsløre.
Acknowledgments
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) gav adgang til billedbehandlings- og cellesorteringsudstyr og teknisk bistand. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud 1R21CA201853. MCF og IRF modtager delvis støtte fra NIH-tilskuddet P20GM103499, SC INBRE. MCF modtager også støtte fra NIH-tilskud P20GM109091. Yvon Woappi blev delvist støttet af NIH-tilskud 2R25GM066526-06A1 (PREP) og R25GM076277 (IMSD) og af et stipendium af Grace Jordan McFadden Professors Program på UofSC. Geraldine Ezeka og Justin Vercellino blev støttet af NIH tilskud 2R25GM066526-10A1 (PREP) på UofSC. Sean M. Bloos blev støttet af Magellan Scholar Award 2016 på UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
