Summary
Här beskriver vi ett protokoll för systematisk odling av epidermala sfäroider i 3D suspension kultur. Detta protokoll har omfattande tillämpningar för användning i en mängd olika epitelvävnadstyper och för modellering av flera mänskliga sjukdomar och tillstånd.
Abstract
Epiteldysreglering är en nod för en mängd olika mänskliga tillstånd och sjukdomar, inklusive kronisk sårning, inflammation och över 80% av alla mänskliga cancerformer. Som fodervävnad är hudepitelet ofta utsatt för skada och har evolutionärt anpassats genom att förvärva den cellulära plasticitet som krävs för att reparera skadad vävnad. Under årens lopp har flera ansträngningar gjorts för att studera epitelplastik med hjälp av in vitro- och ex vivo-cellbaserade modeller. Dessa ansträngningar har dock begränsats i deras förmåga att rekapitulera de olika faserna av epitelcells plasticitet. Vi beskriver här ett protokoll för att generera 3D epidermal sfäroider och epidermal sfäroid-härledda celler från primära neonatal mänskliga keratinocyter. Detta protokoll beskriver kapaciteten hos epidermala sfäroid kulturer att funktionellt modellera distinkta stadier av keratinocyte generativ plasticitet och visar att epidermal sfäroid omplätering kan berika heterogena normala mänskliga keratinocyter (NHKc) kulturer för integrinα6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulationer med förbättrade stam-liknande egenskaper. Vår rapport beskriver utveckling och underhåll av ett högt genomströmningssystem för studier av huden keratinocyte plasticitet och epidermal regenerering.
Introduction
Däggdjursstratifierade epitel är den mest komplexa epitelarkitekturen i alla levande system och är oftast föremål för skador och skador. Som skyddande vävnad har stratifierat epitel utvecklats för att generera ett komplext och effektivt vävnadsskada. Vid skada måste dessa celler aktivera härstamningsprogram, vilket gör det möjligt för dem att migrera till den skadade platsen och utföra reparation1,2,3. Detta mångfacetterade svar sker i flera sekventiella steg som förblir dåligt förstådda.
Ett stort hinder för att studera den invecklade processen med epitelregenerering ligger i bristen på modeller med hög genomströmning som kan fånga dynamiska cellulära aktiviteter i definierade stadier av cellregenerering. Medan musmodeller in vivo erbjuder relevant inblick i sårläkning och närmast rekapitulerar den mänskliga regenerativa processen, kräver deras utveckling mödosamma ansträngningar och betydande kostnader, vilket begränsar deras genomströmningskapacitet. Det finns därför ett kritiskt behov av att upprätta system som möjliggör funktionell undersökning av mänsklig epitelvävnadsregenerering i hög genomströmningsskala.
Under de senaste åren har flera försök gjorts för att möta skalbarhetsutmaningen. Detta ses genom stor expansion av innovativa in vitro- och ex vivo-cellbaserade modeller som nära efterliknar in vivo-regenerativa sammanhang. Detta inkluderar framsteg i organ-på-chip4,sfäroid5,organoid6, och organotypiska kulturer7. Dessa 3D-cellbaserade system erbjuder var och en unika fördelar och presenterar distinkta experimentella begränsningar. Hittills är sfäroidkultur fortfarande den mest kostnadseffektiva och allmänt använda 3D-cellkulturmodellen. Och medan flera rapporter har indikerat att sfäroidkulturer kan användas för att studera hudstamcellsegenskaper, har dessa studier till stor del utförts meddjurvävnad 8,9, eller med dermala fibroblaster10, med praktiskt taget inga rapporter som grundligt karakteriserar de regenerativa egenskaperna hos mänskliga epidermala sfäroidkulturer. I detta protokoll beskriver vi funktionell utveckling, kultur och underhåll av epidermala sfäroid kulturer från normala mänskliga keratinocyter (NHKc). Vi beskriver också nyttan av detta system att modellera de sekventiella faserna av epidermal regenerering och keratinocyte stamcells plasticitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för insamling och hantering av hudprover och isolering av mänskliga keratinocyter har granskats av University of South Carolina (UofSC) IRB och klassificerats som "forskning som inte involverar mänskliga försökspersoner", eftersom förhudsproverna var kirurgiska kasserade under rutinmässiga kirurgiska ingrepp (omskärelse av nyfödda pojkar) och var helt utan att identifiera information. Protokollet granskades och godkändes också regelbundet av UofSC Biosafety Committee, och all laboratoriepersonal genomgick laboratorieutbildning i biosäkerhet. Alla förfaranden utfördes i överensstämmelse med UofSC:s säkerhets- och etiska normer.
1. Isolering och odling av mänskliga keratinocyter från neonatal förhudsvävnad
- Förbered tvättmediet genom att tillsätta 0,1 M HEPES-buffert till 500 ml KSFM-medium och justera det till ett pH-värde på 7,2. Sterilisera mediet i ett vakuumfilter på 500 ml (0,22 μm porstorlek). MCDB 153-LB basal medium kan också användas som en alternativ tvättlösning i stället för KSFM.
- Tvätta neonatal förhud med 5 ml tvättmedier i ett koniskt rör på 50 ml i en laminär flödeshuv. Upprepa två gånger.
- Överför tvättad förhud till en steril Petri-skål. Använd en skalpell och tång, skrapa bort fett och lösa bindväv från dermalskiktet. Tvätta förhuden med 5 ml tvättmedel i ett 50 ml koniskt rör.
- Placera förhudsepdermissidan uppåt i en 6-brunnsplatta som innehåller 2 ml dispasenzym utspädd i tvättmedier (50 U/ml).
- Överför plattan till en inkubator i 4 timmar (37 °C, 5 % CO2, 95 % luftfuktighet).
- Ta bort förhuden från inkubatorn och överför den under sterila förhållanden till en petriskål. Använd finspetstångar och separera epidermis från dermis-skiktet.
- Placera epidermis i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. Använd en 5 ml serologisk rörledning, krossa mekaniskt den flytande epidermis. Inkubera i 15 min vid 37 °C med periodisk virvel i 5 s var 5:e minut.
- Efter inkubation, tillsätt 2 ml sojaböns trypsinhämmare och blanda genom pipetting för att neutralisera trypsin.
- Centrifugcellsupphängning i 2 min vid 450 x g, och sedan i 8 min vid 250 x g.
- Ta bort flytande skräp med tång, var försiktig så att du inte lossar cellpelleten. Aspirera försiktigt supernatant från cellpelleten.
- Återanvänd pellets i 12 ml komplett KSFM-scm medium och tallrik i en 10 cm skål. Inkubera skålen över natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % luftfuktighet).
- Nästa dag, ta bort medium med en aspirerande pipett och ersätt med 12 ml komplett KSFM-scm. Upprepa dag 4 och 7.
- För att upprätthålla optimal tillväxt av normala humant keratinocyt (NHKc) kulturer, passageceller 1:5 på dag 10 för att förhindra celler från att uppnå större än 80% sammanflöde.
2. Generera hud epidermosfär kulturer in vitro
- Förbered en 5% agarosblandning genom att tillsätta 2,5 g agarosa till 50 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), i en 50 ml glasflaska. Autoklavflaska under vätskecykel. Låt svalna till rumstemperatur.
- För att förbereda tallrikar, placera den kylda glasflaskan som innehåller agarosalösning i en 1 L plastbägare fylld med 200 ml avjoniserat vatten (dH2O). Smält agarosablandningen i en mikrovågsugn av forskningskvalitet i upp till 2 minuter och blanda agaren var 60:e sekund genom att försiktigt luta flaskan sida vid sida.
VARNING: Smältning av agar i mikrovågsugnen gör att kolvbehållaren blir extremt varm vilket resulterar i tryckuppbyggnad. Släpp tryckuppbyggnaden var 30:e sekund. Använd lämplig skyddsutrustning för att förhindra skador. - Tillsätt 3 ml smält 5% agaros till 12 ml KSFM-scm förvärmd till 42 °C för en slutlig koncentration på 1% agaros (wt/vol).
Tillval: förvärm de serologiska pipetterna och pipettspetsarna för att förhindra för tidig polymerisering av den mjuka agaren. - Snabbt pipett 200 μL av 1% agarblandning i enskilda brunnar på en 96-brunns rund bottenplatta med en flerkanalsrörtor (Figur 1A). Låt plattan vara i steril miljö vid 25 °C i 4 timmar så att agarosen kan polymeriseras helt.
OBS: Experiment kan stoppas här och fortsätta nästa dag. Polymeriserade agarosaplattor kan bibehållas vid 37 °C upp till 24 timmar eller vid 4 °C i upp till 48 timmar när de förseglas med parafilmsfolie. Varm platta till 37 °C i en fuktad inkubator i minst 1 timme före användning. - Passage sfäroid-bilda NHKc genom att aspirera media och tvätta celler i 2 ml PBS. Aspirera PBS och tillsätt 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA till tvättade celler. Inkubera i 5 minuter vid 37 °C eller tills alla celler är helt lossade. Tillsätt 2 ml Sojaböns trypsinhämmare för att plätera och tvätta bort celler från plattan i ett 15 ml-rör. Centrifugera vid 250 x g i 5 min.
- Återanvänd pellet i 1 ml PBS. Kvantifiera cellens livskraft med trypanblå färgning och en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
- Aliquot 2 x 104 NHKc i 100 μL KSFM-scm och frö till enskilda brunnar av tidigare beredd 96-brunns rundbottenplatta. Inkubatplatta över natten (37 °C, 5 % CO2,95 % luftfuktighet).
- Använd ett inverterat faskontrastmikroskop, analysera sådd väl för epidermosfärbildning.
OBS: Mänskliga epidermosfärer från normala mänskliga keratinocyter kan förbli livskraftiga i 3D-suspensionskulturen i upp till 96 timmar, dock med betydande minskning av cellens livskraft (Figur 2).
3. Epidermal sfäroid ompläteringsanalys
- 24-48 h efter 3D epidermosphere bildandet, tillsätt 4 ml förvärmda KSFM-scm till en 6 cm skål. Använd en bred borrhål 1 ml pipettspets för att överföra en enda sfäroid till plattan, så att den inte bryts isär. Alternativt kan du bredda en 1 ml pipettspets med ett sterilt rakblad för att skära spetsen.
- Inkubera plattan över natten (37 °C, 5 % CO2, 95 % luftfuktighet).
- Analysera sådd sfäroid för fastsättning på botten av plattan och observera för förökning av celler med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop (Figur 3). Mata celler var 96: e timme genom att försiktigt ta bort 2 ml av mediet inuti plattan och långsamt lägga till 2 ml färsk ksfm-scm media på plattan.
- Passage sfäroid-härledda (SD) NHKc när de når 70-80% confluency och fortsätter med valfri analys. Övervaka SD-NHKc ofta för att förhindra att celler når full tillväxt i kulturen, eftersom detta resulterar i för tidig differentiering och celltillväxtstopp (Figur 3E-F).
- De epidermala sfäroidreperieringsanalysmodellerna keratinocyte-medierad sårreparation genom att fånga var och en av de viktigaste sekventiella faserna av epidermal regenerativ plasticitet: a) homeostatiskt underhåll, b) differentieringsstopp/återföring c) stress härstamningsrörlighet och d) vävnadsrestaurering (Figur 1B; Tabell 2). Denna analys kan också användas för att producera cellpopulationer för organotypiska flottkulturer eller för att modellera HPV-medierad neoplasi som visats i vårt tidigare arbete 11,12.
4.3D fluorescens cellspårning
- I en 6 cm maträtt, transfect spheroid-bilda 2D monolayer NHKc kulturer med 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plasmid vektor som bär den förbättrade gröna fluorescerande protein (eGFP) genen. Inkubatplatta över natten (37 °C, 5 % CO2,95 % luftfuktighet)(figur 4A).
OBS: Det är viktigt att transfection slutförs i serumfria antibiotikafria tillstånd. - Utan att ta bort transfection mix, tillsätt 2 ml förvärmd KSFM-scm till celler. Inkubatplatta över natten (37 °C, 5 % CO2,95 % luftfuktighet).
- Aspirera alla transfection media från plattan och matningsceller med 3 ml förvärmda KSFM-scm. Bedöma för närvaro av EGFP-uttrycksceller under FITC-kanalen i ett fluorescerande mikroskop.
- Passage och frö 2 x 104 EGFP-transfekterade celler i enskilda brunnar i en tidigare beredd 96-brunns rund bottenplatta. Inkubatplatta över natten (37 °C, 5 % CO2,95 % luftfuktighet). Visualisera och övervaka EGFPpos sfäroid cellrörelse under FITC-kanalen i ett fluorescensmikroskop (Figur 4B-C).
- 24 h efter plätering, tillsätt 3 ml förvärmd KSFM-scm till en 6 cm skål. Använd en bred borrhål 1 ml pipettspets för att överföra en enda sfäroid till plattan, så att den inte bryts isär. Inkubatplatta över natten (37 °C, 5 % CO2,95 % luftfuktighet).
- Observera och analysera förökning SD-NHKcEGFP med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Mata celler var 96: e timme genom att försiktigt ta bort 2 ml mediet inuti plattan och långsamt lägga till 2 ml färsk ksfm-scm media på plattan.
- Skörda SD-NHKCEGFP för FACS isolering eller valfria analyser.
5. Karakterisering av sfäroid-härledda (SD) subpopulationer av FACS
- Passage SD-NHKc och motsvarande autologa 2D monolayer kulturer genom att aspirera gamla medier och tvätta celler i 2 mL PBS. Ta bort PBS och tillsätt 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA till tvättade celler. Inkubera vid 37 °C i 5 minuter eller tills alla celler är helt lossade.
- Tillsätt 2 ml sojaböns trypsinhämmare för att plätera och överföra celler till ett 15 ml-rör. Centrifugera vid 250 x g i 5 min.
- Återanvänd pellets i 1 ml PBS. Kvantifiera cellens livskraft med trypanblått och en automatiserad cellräknare av hemocytometer.
- Alikvot 100 μL innehållande 0,1-4 x 106 NHKc-celler till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Placera röret på is i en mörk miljö, skapad genom att släcka starkt ljus i laminarhuven.
- Tillsätt 2 μL FITC-konjugerad anti-integrinα6 och 2 μL PE-konjugerad anti-EGFR till rör för att uppnå en utspädning på 1:50. Förbered ett rör utan att några antikroppar tillsätts för att fungera som den obekarna kontrollen. Inkubera rör på is i mörker eller vid 4 °C i 30 min. Användningen av pärlor eller en hud SCC-linje kan fungera som positiv kontroll, eftersom hudens SCC-celler uttrycker förhöjda nivåer av integrinα6 och EGFR.
- Utför flödescytometrianalys med valfri flödescytometer som innehåller lämpliga lasrar.
- Använd de negativa och positiva kontrollerna för att upprätta grindar. Sortera delpopulationen av integrinα6hi/EGFR-loceller; Dessa är epidermal stamcellsfraktion. Integrinα6hi/EGFRhi celler är proliferative stamceller fraktion. Integrinα6lo/EGFRhi-cellerna är den utfästa stamcellsfraktionen (figur 4D). Sortering av FACS-rör bör innehålla minst 1 ml iskallt KSFM-scm.
- Provning för proliferativ kapacitet hos sorterade cellunderpopulationer genom överföring av innehållet i varje respektive sorteringsrör till ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 10x volymen sorterade celler i PBS. OBS: Det är viktigt att ta bort alla celler som är fästa vid kanten genom att pipettera väggen i sorterings-FACS-rören flera gånger, eftersom keratinocyter ofta kan klibba där.
- Centrifugera 15 ml rör vid 250 x g i 5 min. Ta bort supernatant och återanvänd pellet i 12 ml KSFM-scm. Överför de återanvända cellerna till en 6 cm platta och inkubera över natten (37 °C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
- Nästa dag, ta bort media i tallrikar och tillsätt 8 ml förvärmd KSFM-scm. Inkubera vid 37 °C, 5% CO2, 95% luftfuktighet. Återmata celler med 12 ml medium var tredje dag tills 70-80% konfluent(figur 4E).
6. Immunofluorescens och färgning av epidermosfärer för basala stamcellsmarkörer
- Överför epidermosfärer på täcklips belagda med polylysin. Låt SD-NHKc sprida sig tills 75% konfluent.
- Tvätta cellerna två gånger i PBS (4 °C) i 5 minuter vardera.
- Fixera celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min vid rumstemperatur.
- Permeabilisera celler med 0,5% Triton X-100 i 1% glycin. Blockera med 0,5% BSA och 5% getserum i 30 min vid rumstemperatur.
- Inkubera prover med antikroppar mot P63 (1:200) och cytokeratin 14 (1:200) i blockerande lösning över natten vid 4 °C.
- Tvätta tre gånger med PBS (4 °C) som innehåller interpolering 20 (PBST), följt av inkubation med FITC- och Alexa 568- konjugerade sekundära antikroppar (1:1000 utspädning).
- Fläckkärnor med 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1:5000 utspädning) före montering av celler.
- Observera celler som använder ett fluorescerande mikroskop med FITC- och PE-laserlinjer (Figur 4F).
7. Transkriptionell analys av epidermosfärkulturer
- Ställ in triplicate plattor av låg passage NHKc kulturer för att isolera RNA kan vara från monolayer, sfäroid och sfäroid-härledda kulturer från samma autologa cellinje.
- Pool 3-5 motsvarande epidermosfärer i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör. Skörda separat autologa SD-NHKc och 2D monolayer kulturer.
- Isolera totalt RNA från alla tre grupperna.
- Utför omvänd transkription med 1 μg totalt RNA.
- Använd cDNA, utför PCR i realtid med GAPDH som intern kontroll (tabell 1).
- Validera ampliconproduktstorlek med agarose gelelektrofores (2% v/v).
OBS: För transkriptionsomic-wide profilering av epidermosphere kulturer med hjälp av hela genom microarray analys, isolera totala RNA från masskulturer av en enda NHKc givare och motsvarande SD-NHKc från samma givare, i sex replikat vardera. - Utvärdera RNA-kvalitet med hjälp av en bioanalyzer för att uppnå RNA Integrity Numbers (RIN) från minst 9,0 till 9,1.
- Utför mikroarrayexperiment genom att förstärka och biotinylera totala RNA-prover.
- Omvänd transkribering 100 ng totalt RNA per prov till ds-cDNA med NNN slumpmässiga primers som innehåller en T7 RNA polymeraspromotor sekvens.
- Tillsätt T7 RNA-polymeras till cDNA-prover för att förstärka RNA och kopiera sedan RNA till ss-cDNA. Försämra överskottet av RNA med hjälp av RNase H.
- Fragment sscDNA molekyler och etikett med biotin.
- Förstärk märkta prover i 16 timmar vid 45 °C.
- Hybridisera prover med hjälp av en hybridiseringsugn och ett tvätt- och fläckkit.
- Tvätta och fläckhybridiserade matriser.
- Skanna matriser med hjälp av en system- och datorarbetsstation.
- Efter slutförandet av matrisskanningar importerar cel-filer (Import Probe Cell Intensity) till konsolprogramvara och bearbetar på gennivå med hjälp av biblioteksfil och Robust Multichip Analysis (RMA) algoritm för att generera CHP-filer.
- När du har bekräftat datakvaliteten i Expression Console importerar du CHP-filer som innehåller log2-uttryckssignaler för varje avsökning till en transkriptionsanalysprogramvara för att analysera celltypsspecifika transkriptionssvar med hjälp av envägsanalys mellan ämnen av varians.
8. Bedömning av SD-NHKc kolonibildande effektivitet
- Aspirera media från plattor när celler når 70-80% sammanflöde. Tvätta cellerna tre gånger i PBS (4 °C) i 5 minuter vardera.
- Fixera celler med 3 ml 100% metanol (4 °C) i 15 min. Tvätta tre gånger i PBS i 5 minuter vardera.
- Fläckceller i 3 ml 10% Giemsa i 30 min. Tvätta tre gånger i PBS i 5 minuter vardera. Låt cellerna lufttorka över natten.
- Analysera kolonibildning följande dag och kvantifiera antalet erhållna kolonier
9. Bestäm SD-NHKc befolkningsfördubblingar
- Passage SD-NHKc och motsvarande autologa 2D monolayer kulturer genom att aspirera gamla medier och tvätta celler i 2mL PBS. Ta bort PBS och tillsätt 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA till tvättade celler. Inkubera i 5 minuter eller tills alla celler helt lossar (37 °C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
- Tillsätt 2 ml sojaböns trypsinhämmare för att plätera och överföra celler till ett 15 ml-rör.
- Centrifugera vid 250 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 12 ml KSFM-scm.
- Fröceller med låg densitet 1-2 x 104 NHKc i enskilda 10 cm rätter och inkubera över natten (37 °C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
- Foderplattor med 8 ml KSMF-scm följande dag. Mata var 4: e dag tills minst 25% konfluent och mata sedan varannan dag.
- Seriell passageceller 1:5 i 60 cm rätter tills cellproliferativ kapacitet är uttömd. Kvantifiera cellens livskraft genom trypanblå färgning. Bestäm populationsfördubblingar vid varje passage med hjälp av formeln: log(N/N0)/ log2, där N representerar det totala cellnumret som erhålls vid varje passage och N0 representerar antalet celler som pläteras i början av experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under huden epidermosphere analys sås NHKc kulturer i agarose-belagda brunnar av en 96-brunn platta (Figur 1A). Sfäroidbildande celler bör själv aggregeras inom 48h. Autonom sfäroidbildning kan bedömas redan 24 timmar med hjälp av ett standardinverterat faskontrastmikroskop. Hud epidermosfär bildas och omplätering analys modell olika faser av epidermal vävnad regenerering (Figur 1B). Figur 2 visar högupplösta bilder av olika NHKc-stammar som analyserats för epidermal sfäroidformningsförmåga i 3D-kulturen. Det är viktigt att undersöka cellerna för tät sfärformsaggregering, eftersom detta är ett kännetecken för spontan sfäroidbildning. Vi fann det nödvändigt att använda mer än 2 x 104 celler för att säkerställa korrekt spontan aggregering. Icke-sfärisk cellaggregering, såsom i stammar figur 2A,anses inte vara tillräcklig epidermosfärbildning. Plätering icke-sfäroid bildar cell suspensioner tillbaka i 2D monolayer kultur sällan resulterar i livskraftig NHKc cell tillväxt. Plätering av epidermosfärer i 2D-kulturen leder dock till spridning av små livskraftiga NHKc (figur 3). Bilder av epidermosfärer och SD-NHKc kan ses och övervakas med hjälp av ett standard inverterat faskontrastmikroskop. Det är viktigt att hålla dessa kulturer under 100% konfluens eftersom detta avsevärt kan öka deras tillväxt och stamcellstillstånd i kulturen (Figur 3E-F). Processen med epidermal sfäroidbildning kan spåras funktionellt på encellsnivå genom att transfektera celler med en fluorescerande reporter (Figur 4A-C). Under optimala förhållanden är keratinocyte subpopulation främst berikad i SD-NHKc kulturer Integrinα6hi/EGFRlo celler. Dessa celler utgör i allmänhet cirka 25% av alla SD-NHKc-kulturer och kan lätt isoleras av FACS (Figur 4D). Det är dock viktigt att upprätta spridningsområde på främre sidan (FSC-A) och sidospridningsfält (SSC-A) för att utesluta dubblettar(figur 4D). Ytterligare karakterisering av denna stamliknande keratinocyt subpopulation kan uppnås genom immunofluorescerande färgning analys av epidermal stamcell markör uttryck, såsom basala cytokeratin 14 (K14) och tumör protein 63 (P63) (Figur 4F; Tabell 2).
Figur 1:Odling av NHKc epidermospheres i 3D suspension. (A) Schematisk representation av epidermal sfäroiden re-plätering analys anpassad från 11. B) Representativa faskontrastbilder av NHKc-kulturer, epidermala sfäroider och SD-NHKc vid varje sekventiellt steg i epidermal sfäroiden ompläteringsanalys. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av hudens epidermosfärtillväxt. (A) Bilder av sex individuella sfäroider som inte bildas och (B) sfäroidbildande NHKc-stammar i flytande 3D-suspension. c) Epidermosfärer som erhållits med hjälp av olika mängder NHKc. (D) Kvantifiering av genomsnittlig epidermosfärstorlek som erhållits med hjälp av olika mängder NHKc i flytande 3D-suspensionskultur. Staplar anger standardavvikelse. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:Växande sfäroid-härledda kulturer. (A) Tidskursfaskontrastavbildning av SD-NHKc monolayerkulturer som sprider sig från en bifogad epidermosfär 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h och (D) 96 h efter omplätering i 2D-plastkultur. (E) SD-NHKc kulturer vid 80% confluency och (F) 100% confluency 15 och 20 dagar efter omrop i 2D plastkultur, respektive. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av spheroid-härledda (SD) subpopulationer. a) Schematisk representation av 3D-cellspårningsanalys av epidermosfärer in vitro enligt beskrivningen i Woappi et al. 202012. B) EGFP-uttrycksepdermosfärer 2 h och (C) 24 timmar efter sådd i 3D-kultur. D) Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av SD-NHKc-subpopulationer. Ungefär 1/4av alla celler ska vara integrinα6hi/EGFRlo. E) Integrinα6hi/EGFRlo subpopulationer producerar keratinocyte holoclones. F) Immunofluorescerande färgningsanalys av basala epitelial stamcellsmarköruttryck i Integrinα6hi/EGFRlo-celler . Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primersekvens (5'-3') | ||
| Gennamn | Framåt Primer | Omvänd primer |
| ALDH1 (aldh1) | GCACGCCAGACTTACCTGTC (GCACGCCAGACTTACCTGTC) | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG (CCTCCTCAGTTGCAGAG) |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC (på andra) | ATGAGGACATAACCAGCCACC (ATGAGGACATAACCAGCCACC) |
| GAPDH (2000 | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT (PÅ 1999) | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 (på 14) | TGAGCCGCATTCTGAACGAG (TGAGCCGCATTCTGAGAG) | GATGACTGCGATCCAGAGGA (GATGACTGCGATCCAGAGGA) |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG (PÅ ANDRA) | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA (CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA) |
| KLF4 (klf4) | CCCACATGAAGCGACTTCCC (CCCACATGAAGCGACTTCCC) | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA (OLIKA BETYDELSER) |
| TP63 (TP63) | GGACCAGCAGATTCAGAACGG (2000) | AGGACACGTCGAAACTGTGC (AGGACACGTCGAAACTGTGC) |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC (PÅ ANDRA) | CTCCTTAATGTCACGCACGAT (CTCCTTAATGTCACGCACGAT) |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAACAATGCC (ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC) | CAGGCATGGCACGGATAAC (caggcatggcacggataac) |
Tabell 1. Beskriver PCR primer sekvenser som används för detektion av utvalda gener som är involverade i neonatal keratinocyte plasticitet.
| Kultur villkor | Utseende på faskontrast | Immunostaining | FACS-analys | Transkriptionsomisk signatur | |
| Homeostatiskt underhåll | 2D monoskikt | Små celler < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Epidermalt underhåll (K14, P63, IVL, K10) |
| Differentieringsstopp/återföring | 3D-sfäroid | Kompakt multicellulärt > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | Ej tillämpligt | Avdilektion: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Stress härstamning rörlighet | 3D-till-2D-sfäroidfäste | Sprida små celler (< 20 μm) från sfäroidkanten | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hej/EGFPmed | Spridning av hudceller: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Vävnad restaurering | 3D-till-2D-sfäroid monoskikt | Förökning av små celler < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo och ITGα6hi/EGFPhej | Bildandet av epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabell 2. Strategier för fenotypisk och molekylär karakterisering av epidermal sfäroid replering analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av 3D-sfäroidkultursystem har haft stor nytta vid bedömning av cellstamhet. Dessa system har visat sig förbättra anrikningen avvävnad stamceller 13, men deras nytta för studier av mänskliga epidermal stamceller har undersökts begränsat. Här beskriver vi en strategi för berikande mänskliga keratinocyte stamceller med hjälp av 3D kultur tekniker. I detta system odlas NHKc som självmonterande multicellulära sfäroid suspensioner, bestående av flera keratinocyt subtyper upphängda ovanpå agarose sängar som innehåller KSFM-scm. Inställningen för detta protokoll är tidskänslig eftersom agar polymeriserar snabbt vid rumstemperatur. Förvärmning av serologiska pipetter, mikropipettespetsar och agar/cellblandningsröret, liksom media till 42 °C, kan dramatiskt minska för tidig polymerisation. Vi observerade att placering av 96-brunnsplattan i 4 °C kort efter tillsats av agar/ mediablandning till brunnar avsevärt kan påskynda polymerisationen och säkerställa att agarkudden är tillräckligt fast för efterföljande sådd av celler. Det är viktigt att hålla plattan) nivå hela tiden under polymeriseringsprocessen, eftersom dålig polymerisering av agar / mediablandningen kommer att resultera i celler sådd eller odling inuti den mjuka agaren, ogiltigförklara analysen.
Också beskrivs i detta protokoll, presenterar vi en strategi för att sprida epidermospheres i 2D monolayer kultur för att generera stam-liknande sfäroid-härledda celler. Epidermal sfäroiden re-plating analys berikar för en stamcell-liknande subpopulation av integrinα6hi/EGFRlo keratinocytes. Dessa celler kan användas för att studera epidermal rekonstruktion, psoriasis, eller cellulär neoplasi11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo keratinocytes kan också lätt isoleras av FACS och kännetecknas av immunofluorescerande färgning. När vi utförde sådana experiment fann vi det användbart att använda osorterade autologa 2D-monoskiktsceller som kontroller., hud SCC-cellinjer är ett bra alternativ Om dessa inte är tillgängliga.
Sammanfattningsvis visar denna rapport att mänskliga epidermal sfäroid omplätering modeller keratinocyte regenerativ plasticitet in vitro, eftersom det fångar var och en av de fyra faserna av regenerering: homeostatic underhåll, differentiering återföring, stress härstamning rörlighet och vävnad restaurering. En begränsning av agar-baserade sfäroid självmontering är dock att inte alla NHKc fläckar kan spontant bilda sfäroider. Hängande droppemetod 15 är en bra alternativ strategi för att övervinna denna utmaning och tvinga inducera multicellulär sfäroidbildning. Denna analys kan också multiplexeras med muskel-, stromal- eller immunceller för att få ytterligare insikt i olika cellpopulationers bidrag till epidermal regenerering. det skulle vara intressant att undersöka om tillägg av Matrigel i agar kunde förbättra epidermosphere överlevnad och styrka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska relationer att avslöja.
Acknowledgments
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) gav tillgång till bildbehandlings- och cellsorteringsutrustning och tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes delvis av bidrag 1R21CA201853. MCF och IRF får delvis stöd från NIH-bidrag P20GM103499, SC INBRE. MCF får också stöd från NIH-bidrag P20GM109091. Yvon Woappi stöddes delvis av NIH-bidrag 2R25GM066526-06A1 (PREP) och R25GM076277 (IMSD) och av ett stipendium av Grace Jordan McFadden Professors Program vid UofSC. Geraldine Ezeka och Justin Vercellino stöddes av NIH-bidrag 2R25GM066526-10A1 (PREP) vid UofSC. Sean M. Bloos fick stöd av Magellan Scholar Award 2016 på UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
