Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.
Abstract
Epitheliale Dysregulation ist ein Knoten für eine Vielzahl von menschlichen Zuständen und Beschwerden, einschließlich chronischer Wunden, Entzündungen und über 80% aller menschlichen Krebsarten. Als Auskleidungsgewebe ist das Hautepithel oft Verletzungen ausgesetzt und hat sich evolutionär angepasst, indem es die zelluläre Plastizität erworben hat, die zur Reparatur von geschädigtem Gewebe erforderlich ist. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um die epitheliale Plastizität mit in vitro und ex vivo zellbasierten Modellen zu untersuchen. Diese Bemühungen waren jedoch in ihrer Fähigkeit, die verschiedenen Phasen der Plastizität von Epithelzellen zu rekapitulieren, begrenzt. Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von 3D-epidermalen Sphäroiden und epidermalen Sphäroidzellen aus primären neonatalen menschlichen Keratinozyten. Dieses Protokoll beschreibt die Fähigkeit epidermaler Sphäroidkulturen, verschiedene Stadien der generativen Plastizität von Keratinozytenfunktionalität funktionell zu modellieren, und zeigt, dass die epidermale Sphäroid-Neubeschichtung heterogene normale menschliche Keratinozytenkulturen (NHKc) für integrinα6hi/EGFRlo Keratinozyten-Subpopulationen mit verbesserten stammähnlichen Eigenschaften anreichern kann. Unser Bericht beschreibt die Entwicklung und Aufrechterhaltung eines Hochdurchsatzsystems zur Untersuchung der Plastizität der Hautkeratinozyten und der epidermalen Regeneration.
Introduction
Das geschichtete Epithel von Säugetieren ist die komplexeste Epithelarchitektur in allen lebenden Systemen und ist am häufigsten Schäden und Verletzungen ausgesetzt. Als Schutzgewebe hat sich das geschichtete Epithel entwickelt, um eine komplexe und effektive Gewebeschadensreaktion zu erzeugen. Bei Verletzungen müssen diese Zellen Linienplastizitätsprogramme aktivieren, die es ihnen ermöglichen, an die verletzte Stelle zu wandern und die Reparatur1,2,3durchzuführen . Diese facettenreiche Reaktion erfolgt in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die noch wenig verstanden werden.
Ein großes Hindernis bei der Untersuchung des komplizierten Prozesses der epithelialen Regeneration liegt im Mangel an Hochdurchsatzmodellsystemen, die dynamische zelluläre Aktivitäten in definierten Stadien der Zellregeneration erfassen können. Während In-vivo-Mausmodelle relevante Einblicke in die Wundheilung bieten und den menschlichen Regenerationsprozess am ehesten rekapitulieren, erfordert ihre Entwicklung mühsame Anstrengungen und erhebliche Kosten, was ihre Durchsatzkapazität einschränkt. Es besteht daher ein kritischer Bedarf an der Etablierung von Systemen, die eine funktionelle Untersuchung der Regeneration von menschlichem Epithelgewebe im Hochdurchsatzbereich ermöglichen.
In den letzten Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, die Herausforderung der Skalierbarkeit zu meistern. Dies zeigt sich in der großen Ausweitung innovativer zellbasierter In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, die den regenerativen In-vivo-Kontext genau nachahmen. Dazu gehören Fortschritte bei Organ-on-Chip4, Sphäroid5, Organoid6und organotypischen Kulturen7. Diese zellbasierten 3D-Systeme bieten jeweils einzigartige Vorteile und stellen unterschiedliche experimentelle Einschränkungen dar. Bis heute ist die Sphäroidkultur das kostengünstigste und am weitesten verbreitete 3D-Zellkulturmodell. Und während mehrere Berichte darauf hingewiesen haben, dass Sphäroidkulturen verwendet werden können, um Hautstammzelleigenschaften zu untersuchen, wurden diese Studien größtenteils mit tierischem Gewebe8,9oder mit dermalen Fibroblasten10durchgeführt, wobei praktisch keine Berichte die regenerativen Eigenschaften menschlicher epidermaler Sphäroidkulturen gründlich charakterisieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die funktionelle Entwicklung, Kultur und Aufrechterhaltung epidermaler Sphäroidkulturen aus normalen menschlichen Keratinozyten (NHKc). Wir beschreiben auch den Nutzen dieses Systems, um die sequentiellen Phasen der epidermalen Regeneration und der Plastizität von Keratinozytenstammzellen in vitro zu modellieren.
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Protocol
Das Protokoll für die Sammlung und Handhabung von Hautproben und die Isolierung menschlicher Keratinozyten wurde von der University of South Carolina (UofSC) IRB überprüft und als "Forschung ohne menschliche Probanden" eingestuft, da die Vorhautproben chirurgische Rückwürfe waren, die bei routinemäßigen chirurgischen Eingriffen (Beschneidung von Neugeborenen) produziert wurden und völlig frei von identifizierenden Informationen waren. Das Protokoll wurde auch regelmäßig vom UofSC-Ausschuss für biologische Sicherheit überprüft und genehmigt, und das gesamte Laborpersonal wurde einer Laborschulung unterzogen. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Sicherheits- und Ethikstandards von UofSC durchgeführt.
1. Isolierung und Kultur menschlicher Keratinozyten aus neonatalem Vorhautgewebe
- Bereiten Sie das Waschmedium vor, indem Sie 0,1 M HEPES-Puffer auf 500 ml KSFM-Medium hinzufügen und auf einen pH-Wert von 7,2 einstellen. Medium in einem 500 mL Vakuumfilter (0,22 μm Porengröße) sterilisieren. MCDB 153-LB Basalmedium kann auch als alternative Waschlösung anstelle von KSFM verwendet werden.
- Waschen Sie in einer Laminar-Flow-Haube die neonatale Vorhaut mit 5 ml Waschmedium in einem 50 ml konischen Rohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
- Die gewaschene Vorhaut in eine sterile Petrischale geben. Kratzen Sie mit Skalpell und Einer Zette Fett- und loses Bindegewebe von der Hautschicht ab. Vorhaut mit 5 mL Waschmedium in einem 50 mL konischen Röhrchen nachspülen.
- Legen Sie die Vorhautepidermis mit der Seite nach oben in eine 6-Well-Platte, die 2 ml Dispase-Enzym enthält, das in Waschmedien (50 U / ml) verdünnt ist.
- Die Platte für 4 Stunden in einen Inkubator geben (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Die Vorhaut aus dem Inkubator entfernen und unter sterilen Bedingungen in eine Petrischale überführen. Trennen Sie mit einer Feinspitzenzette die Epidermis von der Dermisschicht.
- Legen Sie die Epidermis in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. Mit einer 5 mL serologischen Pipett die schwimmende Epidermis mechanisch zerkleinern. 15 min bei 37 °C mit periodischem Wirbeln für 5 s alle 5 min inkubieren.
- Nach der Inkubation 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor hinzufügen und durch Pipettieren mischen, um das Trypsin zu neutralisieren.
- Zentrifugenzellsuspension für 2 min bei 450 x gund dann für 8 min bei 250 x g.
- Entfernen Sie schwimmende Ablagerungen mit einer Zette und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu entfernen. Überstand vorsichtig aus dem Zellpellet absaugen.
- Pellet in 12 mL komplettem KSFM-scm Medium und Teller in einer 10-cm-Schüssel resuspendieren. Inkubationsschale über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Am nächsten Tag das Medium mit einer Ansaugpipette entfernen und durch 12 ml komplettes KSFM-scm ersetzen. Wiederholen Sie dies an den Tagen 4 und 7.
- Um ein optimales Wachstum normaler menschlicher Keratinozytenkulturen (NHKc) aufrechtzuerhalten, passage Zellen 1:5 am Tag 10, um zu verhindern, dass Zellen mehr als 80% Konfluenz erreichen.
2. Erzeugung von Hautepidermosphärenkulturen in vitro
- Bereiten Sie eine 5% ige Agarosemischung vor, indem Sie 2,5 g Agarose zu 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 50 ml Glasflasche hinzufügen. Autoklavflasche unter Flüssigkeitskreislauf. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Zur Zubereitung der Platten die gekühlte Glasflasche mit Agaroselösung in ein 1 L Kunststoffbecherglas geben, das mit 200 ml entionisiertem Wasser (dH2O) gefüllt ist. Agarose-Mischung in einer Mikrowelle in Forschungsqualität bis zu 2 Minuten schmelzen und das Agar alle 60 s mischen, indem Sie die Flasche vorsichtig von Einer Seite zur anderen neigen.
ACHTUNG: Das Schmelzen von Agar in der Mikrowelle führt dazu, dass der Kolbenbehälter extrem heiß wird, was zu einem Druckaufbau führt. Lösen Sie Druckaufbau alle 30 s. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, um Verletzungen zu vermeiden. - 3 mL geschmolzene 5% Agarose zu 12 mL KSFM-scm vorgewärmt auf 42 °C für eine Endkonzentration von 1% Agarose (wt/vol) geben.
Optional: Die serologischen Pipetten und Pipettenspitzen vorwärmen, um eine vorzeitige Polymerisation des weichen Agars zu verhindern. - Schnell 200 μL der 1%igen Agarmischung mit einem Mehrkanalpipettor in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte pipettieren (Abbildung 1A). Lassen Sie die Platte in steriler Umgebung bei 25 °C für 4 h, damit Agarose vollständig polymerisieren kann.
HINWEIS: Das Experimentieren kann hier gestoppt und am nächsten Tag fortgesetzt werden. Polymerisierte Agaroseplatten können bei 37 °C bis zu 24 h oder bei 4 °C für bis zu 48 h gehalten werden, wenn sie mit Parafilmwickel versiegelt werden. Platte vor Gebrauch mindestens 1 h in einem befeuchteten Inkubator auf 37 °C erwärmen. - Passage sphäroidbildendes NHKc durch Ansaugen von Medien und Waschzellen in 2 ml PBS. Saugen Sie PBS an und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzu. 5 min bei 37 °C oder bis sich alle Zellen vollständig lösen, inkubieren. Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor auf die Platte hinzu und waschen Sie die Zellen von der Platte in ein 15-ml-Röhrchen ab. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
- Resuspend pellet in 1 mL of PBS. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypan-Blaufärbung und einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- Aliquot 2 x 104 NHKc in 100 μL KSFM-scm und Insäen in einzelne Vertiefungen der zuvor präparierten 96-Well-Rundbodenplatte. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Analysieren Sie mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop die Aussaat gut auf Epidermosphärenbildung.
HINWEIS: Menschliche Epidermosphären aus normalen menschlichen Keratinozyten können in 3D-Suspensionskultur bis zu 96 h lebensfähig bleiben, wenn auch mit erheblicher Abnahme der Zelllebensfähigkeit (Abbildung 2).
3. Epidermaler Sphäroid-Re-Plating-Assay
- 24-48 h nach der 3D-Epidermosphärenbildung 4 ml vorgewärmtes KSFM-scm in eine 6 cm große Schüssel geben. Verwenden Sie eine breite 1 mL Pipettenspitze, um ein einzelnes Sphäroid auf die Platte zu übertragen und sicherzustellen, dass es nicht auseinanderbricht. Alternativ können Sie eine 1 mL Pipettenspitze mit einer sterilen Rasierklinge verbreitern, um die Spitze zu schneiden.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Analysieren Sie gesätes Sphäroid auf Befestigung am Boden der Platte und beobachten Sie die Vermehrung von Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop (Abbildung 3). Die Zellen alle 96 h füttern, indem Sie vorsichtig 2 ml des Mediums in der Platte entfernen und langsam 2 ml frisches KSFM-scm-Medium auf die Platte geben.
- Passage sphäroid-abgeleitete (SD) NHKc, sobald sie 70-80% Konfluenz erreicht haben und mit dem Assay der Wahl fortfahren. Überwachen Sie SD-NHKc häufig, um zu verhindern, dass Zellen in Kultur die volle Konfluenz erreichen, da dies zu vorzeitiger Differenzierung und Zellwachstumsstillstand führt (Abbildung 3E-F).
- Der epidermale Sphäroid-Replating-Assay modelliert die Keratinozyten-vermittelte Wundreparatur, indem er jede der wichtigsten sequenziellen Phasen der epidermalen regenerativen Plastizität erfasst: a) homöostatische Aufrechterhaltung, b) Differenzierungsstopp/-umkehrung c) Mobilität der Stresslinie und d) Gewebewiederherstellung (Abbildung 1B; Tabelle 2). Dieser Assay kann auch verwendet werden, um Zellpopulationen für organotypische Floßkulturen herzustellen oder HPV-vermittelte Neoplasie zumodellieren,wie in unserer vorherigen Arbeit 11,12gezeigt.
4.3D Fluoreszenzzell-Tracking
- In einer 6 cm großen Schüssel transfizieren Sie sphäroide bildende 2D-Monoschicht-NHKc-Kulturen mit 1 μg pMSCV-IRES-EGFP-Plasmidvektor, der das Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Gen trägt. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit) Mikroskop (Abbildung 4A).
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Transfektion unter serumfreien antibiotikafreien Bedingungen abgeschlossen wird. - Ohne die Transfektionsmischung zu entfernen, fügen Sie 2 ml vorgewärmtes KSFM-scm zu den Zellen hinzu. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Aspiratieren Sie alle Transfektionsmedien von Platten- und Zuführzellen mit 3 mL vorgewärmtem KSFM-scm. Beurteilen Sie das Vorhandensein von EGFP-exprimierenden Zellen unter dem FITC-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops.
- Passage und Aussaat von 2 x10 4 EGFP-transfizierten Zellen in einzelne Vertiefungen einer zuvor präparierten 96-Well-Rundbodenplatte. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit). Visualisieren und überwachen Sie die Bewegung derEGFP-Pos-Sphäroidzellen unter dem FITC-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops ( Abbildung4B-C).
- 24 h nach dem Plattieren 3 mL vorgewärmtes KSFM-scm in eine 6 cm große Schüssel geben. Verwenden Sie eine breite 1 mL Pipettenspitze, um ein einzelnes Sphäroid auf die Platte zu übertragen und sicherzustellen, dass es nicht auseinanderbricht. Inkubationsplatte über Nacht (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Beobachten und analysieren Sie sich ausbreitende SD-NHKcEGFP mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die Zellen alle 96 h füttern, indem Sie vorsichtig 2 ml des Mediums in der Platte entfernen und langsam 2 ml frisches KSFM-scm-Medium auf die Platte geben.
- Ernten Sie SD-NHKCEGFP für FACS-Isolierung oder Assays Ihrer Wahl.
5. Charakterisierung von Sphäroid-abgeleiteten (SD) Subpopulationen durch FACS
- Passage SD-NHKc und entsprechende autologe 2D-Monolayerkulturen durch Absaugen alter Medien und Waschzellen in 2 mL PBS. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzu. Bei 37 °C für 5 min oder bis sich alle Zellen vollständig lösen, inkubieren.
- Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Platte hinzu und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
- Pellets in 1 ml PBS resuspendieren. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypanblau und einem automatisierten Zellzähler des Hämozytometers.
- Aliquot 100 μL mit 0,1-4 x 106 NHKc-Zellen bis 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Platzieren Sie die Röhre auf Eis in einer dunklen Umgebung, die durch das Ausschalten heller Lichter in der laminaren Motorhaube entsteht.
- Fügen Sie 2 μL FITC-konjugiertes Anti-Integrinα6 und 2 μL PE-konjugiertes Anti-EGFR in Röhrchen hinzu, um eine 1:50-Verdünnung zu erreichen. Bereiten Sie ein Röhrchen ohne Antikörper vor, das als ungefärbte Kontrolle dient. Schläuche auf Eis im Dunkeln oder bei 4 °C für 30 min inkubieren. Die Verwendung von Perlen oder einer Haut-SCC-Linie kann als Positivkontrolle dienen, da Haut-SCC-Zellen erhöhte Integrinα6- und EGFR-Spiegel exprimieren.
- Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse mit einem Durchflusszytometer Ihrer Wahl durch, das geeignete Laser enthält.
- Verwenden Sie die Negativ- und Positivkontrollen, um Tore einzurichten. Sortieren Sie die Subpopulation der integrinα6hi/EGFRlo Zellen; dies ist die epidermale Stammzellfraktion. Integrinα6hi/EGFRhi Zellen sind die proliferative Vorläuferzellfraktion. Die integrinα6lo/EGFRhi Zellen sind die gebundene Vorläuferzellfraktion (Abbildung 4D). Sortier-FACS-Röhrchen sollten mindestens 1 ml eiskaltes KSFM-scm enthalten.
- Testen Sie die proliferative Kapazität sortierter Zellsubpopulationen, indem Sie den Inhalt der jeweiligen Sortierröhrchen in ein konisches 15-ml-Röhrchen übertragen, das das 10-fache des Volumens sortierter Zellen in PBS enthält. HINWEIS: Es ist wichtig, alle am Rand befestigten Zellen zu entfernen, indem Sie die Wand der sortierenden FACS-Röhrchen mehrmals pipettieren, da Keratinozyten dort oft haften können.
- Zentrifuge 15 mL Röhrchen bei 250 x g für 5 min. Überstand entfernen und Pellet in 12 mL KSFM-scm resuspendieren. Die resuspendierten Zellen in eine 6 cm Platte geben und über Nacht inkubieren (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Am nächsten Tag Medien in Platten entfernen und 8 mL vorgewärmtes KSFM-scm hinzufügen. Bei 37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit inkubieren. Zellen alle 3 Tage mit 12 ml Medium erneut füttern, bis 70-80% konfluent sind(Abbildung 4E).
6. Immunfluoreszenz und Färbung von Epidermosphären für basale Stammzellmarker
- Übertragen Sie Epidermosphären auf Decklippen, die mit Polylysin beschichtet sind. Lassen Sie SD-NHKc sich ausbreiten, bis 75% konfluent sind.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (4 °C) für jeweils 5 min.
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur.
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,5% Triton X-100 in 1% Glycin. Mit 0,5% BSA und 5% Ziegenserum für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
- Proben mit Antikörpern gegen P63 (1:200) und Cytokeratin 14 (1:200) in Blocklösung über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Dreimal mit PBS (4 °C) mit Tween 20 (PBST) waschen, gefolgt von der Inkubation mit FITC- und Alexa 568-konjugierten sekundären Antikörpern (1:1000 Verdünnung).
- Färben Sie Kerne mit 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1:5000 Verdünnung) vor der Montage der Zellen.
- Beobachten Sie Zellen mit einem fluoreszationsfähigen Mikroskop mit FITC- und PE-Laserlinien (Abbildung 4F).
7. Transkriptionelle Analyse von Epidermosphärenkulturen
- Richten Sie dreifache Platten von NHKc-Kulturen mit niedriger Passage ein, um RNA zu isolieren, die aus Monolayer-, Sphäroid- und Sphäroid-abgeleiteten Kulturen aus derselben autologen Zelllinie stammen können.
- Pool 3-5 entsprechende Epidermosphären in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Eigen- und 2D-Monolayer-Kulturen separat ernten.
- Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus allen drei Gruppen.
- Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit 1 μg Gesamt-RNA durch.
- Führen Sie mit cDNA eine Echtzeit-PCR durch, wobei GAPDH als interne Kontrolle verwendet wird (Tabelle 1).
- Validierung der Amplicon-Produktgröße durch Agarosegelelektrophorese (2% v/v).
HINWEIS: Für die transkriptomische Profilierung von Epidermosphärenkulturen mittels Ganzgenom-Microarray-Analyse isolieren Sie die Gesamt-RNA aus Massenkulturen eines einzelnen NHKc-Spenders und der entsprechenden SD-NHKc desselben Spenders in jeweils sechs Replikaten. - Bewerten Sie die RNA-Qualität mit einem Bioanalysator, um RNA-Integritätszahlen (RIN) von mindestens 9,0 bis 9,1 zu erreichen.
- Führen Sie Microarray-Experimente durch, indem Sie Gesamt-RNA-Proben amplifizieren und biotinylieren.
- Transkribieren Sie 100 ng der Gesamt-RNA pro Probe in ds-cDNA mit NNN-Zufallsprimern, die eine T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz enthalten.
- Fügen Sie T7-RNA-Polymerase zu cDNA-Proben hinzu, um RNA zu amplifizieren, und kopieren Sie dann RNA in ss-cDNA. Abbau überschüssiger RNA durch Verwendung von RNase H.
- Fragmentieren Sie sscDNA-Moleküle und kennzeichnen Sie sie mit Biotin.
- Markierte Proben 16 h bei 45 °C verstärken.
- Hybridisieren Sie Proben mit einem Hybridisierungsofen und einem Wasch- und Fleckenkit.
- Waschen und färben Sie hybridisierte Arrays.
- Scannen Sie Arrays mit einem System und einer Computer-Workstation.
- Importieren Sie nach Abschluss der Array-Scans CEL-Dateien (Probe Cell Intensity) in die Expressionskonsolensoftware und verarbeiten Sie sie auf Genebene mithilfe von Bibliotheksdateien und RMA-Algorithmen (Robust Multichip Analysis), um KWK-Dateien zu generieren.
- Nachdem Sie die Datenqualität in der Expression Console bestätigt haben, importieren Sie KWK-Dateien mit log2-Expressionssignalen für jede Sonde in eine Transkriptomanalysesoftware, um zelltypspezifische transkriptionelle Antworten mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse zwischen den Probanden zu analysieren.
8. Bewertung der SD-NHKc-Koloniebildungseffizienz
- Saugen Sie Medien aus Platten ab, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80% erreichen. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS (4 °C) für jeweils 5 min.
- Fixieren Sie Zellen mit 3 mL 100% Methanol (4 °C) für 15 min. Dreimal in PBS für jeweils 5 min waschen.
- Färbe Zellen in 3 ml 10% Giemsa für 30 min. Dreimal in PBS für jeweils 5 min waschen. Lassen Sie die Zellen über Nacht an der Luft trocknen.
- Analysieren Sie die Koloniebildung am nächsten Tag und quantifizieren Sie die Anzahl der erhaltenen Kolonien
9. Bestimmen Sie die Verdopplung der SD-NHKc-Population
- Passage SD-NHKc und entsprechende autologe 2D-Monolayer-Kulturen durch Absaugen alter Medien und Waschzellen in 2mL PBS. PbS entfernen und 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen hinzufügen. 5 min oder bis sich alle Zellen vollständig lösen (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
- Fügen Sie 2 ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Platte hinzu und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspend Pellet in 12 mL KSFM-scm.
- Samenzellen bei geringer Dichte 1-2 x 104 NHKc in einzelne 10 cm Geschirr und über Nacht inkubieren (37 °C, 5% CO2,95% Luftfeuchtigkeit).
- Zuführplatten mit 8 mL KSMF-scm am Folgetag. Füttern Sie alle 4 Tage, bis mindestens 25% konfluent, dann füttern Sie alle 2 Tage.
- Serielle Passage Zellen 1:5 in 60 cm Geschirr, bis die zellproliferative Kapazität erschöpft ist. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblaufärbung. Bestimmen Sie die Populationsverdopplungen an jeder Passage mit der Formel: log(N /N 0) / log2, wobei N die Gesamtzellzahl darstellt, die bei jeder Passage erhalten wurde, undN 0 die Anzahl der zellen, die zu Beginn des Experiments plattiert wurden.
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Representative Results
Während des Hautepidermosphärentests werden NHKc-Kulturen in Agarose-beschichteten Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgesät (Abbildung 1A). Sphäroidbildende Zellen sollten sich innerhalb von 48 Stunden selbst aggregieren. Die autonome Sphäroidbildung kann bereits nach 24 Stunden mit einem Standard-Invertierten Phasenkontrastmikroskop beurteilt werden. Hautepidermosphärenbildung und Re-Plating-Assay modellieren verschiedene Phasen der epidermalen Geweberegeneration (Abbildung 1B). Abbildung 2 zeigt hochauflösende Bilder verschiedener NHKc-Stämme, die in 3D-Kultur auf epidermale Sphäroidbildungsfähigkeit untersucht wurden. Es ist wichtig, die Zellen auf dichte Kugelform-Aggregation zu untersuchen, da dies ein Kennzeichen der spontanen Sphäroidbildung ist. Wir fanden es notwendig, mehr als 2 x 104 Zellen zu verwenden, um eine ordnungsgemäße spontane Aggregation zu gewährleisten. Die nicht-sphärische Zellaggregation, wie sie in den Stämmen in Abbildung 2Azu sehen ist, wird nicht als ausreichende Epidermosphärenbildung angesehen. Die Beschichtung von nicht-sphäroidbildenden Zellsuspensionen in 2D-Monolayer-Kultur führt selten zu einem lebensfähigen NHKc-Zellwachstum. Die Beschichtung von Epidermosphären in 2D-Kultur führt jedoch zur Verbreitung von kleinstmöglichem NHKc (Abbildung 3). Bilder von Epidermosphären und SD-NHKc können mit einem Standard-Invertierten Phasenkontrastmikroskop betrachtet und überwacht werden. Es ist wichtig, diese Kulturen unter 100% Konfluenz zu halten, da dies ihr Wachstum und ihren Stammzellzustand in Kultur erheblich beeinflussen kann (Abbildung 3E-F). Der Prozess der epidermalen Sphäroidbildung kann funktionell auf Einzelzellebene verfolgt werden, indem Zellen mit einem fluoreszierenden Reporter transfiziert werden (Abbildung 4A-C). Unter optimalen Bedingungen sind Keratinozyten-Subpopulationen, die hauptsächlich in SD-NHKc-Kulturen angereichert sind, Integrinα6hi/EGFRlo-Zellen. Diese Zellen machen im Allgemeinen etwa 25% aller SD-NHKc-Kulturen aus und können leicht durch FACS isoliert werden (Abbildung 4D). Es ist jedoch wichtig, Forward Side Scatter Area (FSC-A) und Side Scatter Area (SSC-A) Gates zu etablieren, um Dubstoppel auszuschließen (Abbildung 4D). Eine weitere Charakterisierung dieser stammartigen Keratinozyten-Subpopulation kann durch immunfluoreszierende Färbeanalyse der epidermalen Stammzellmarkerexpression, wie basales Cytokeratin 14 (K14) und Tumorprotein 63 (P63) erreicht werden (Abbildung 4F; Tabelle 2).
Abbildung 1: Kultivierung von NHKc-Epidermosphären in 3D-Suspension. (A) Schematische Darstellung des epidermalen Sphäroid-Re-Plating-Assays angepasst von 11. (B) Repräsentative Phasenkontrastbilder von NHKc-Kulturen, epidermalen Sphäroiden und SD-NHKc bei jedem sequenziellen Schritt des epidermalen Sphäroid-Re-Plating-Assays. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beurteilung des Epidermosphärenwachstums der Haut. (A) Bilder von sechs einzelnen sphäroidförmigen nichtbildenden und (B) sphäroidbildenden NHKc-Stämmen in schwimmender 3D-Suspension. (C) Epidermosphären, die unter Verwendung verschiedener Mengen an NHKc erhalten wurden. (D) Quantifizierung der mittleren Epidermosphärengröße, die unter Verwendung unterschiedlicher Mengen nhKc in schwimmender 3D-Suspensionskultur erhalten wurde. Balken zeigen die Standardabweichung an. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wachsende sphäroidabgeleitete Kulturen. (A) Zeitverlauf Phasenkontrastbildgebung von SD-NHKc-Monoschichtkulturen, die sich aus einer angeschlossenen Epidermosphäre 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h und (D) 96 h nach erneuter Beschichtung in 2D-Kunststoffkultur ausbreiten. (E) SD-NHKc-Kulturen bei 80% Konfluenz und (F) 100% Konfluenz 15 bzw. 20 Tage nach der Neuplattierung in 2D-Kunststoffkultur. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Charakterisierung von SD-Subpopulationen (Sheroid). (A) Schematische Darstellung des 3D-Zell-Tracking-Assays von Epidermosphären in vitro, wie von Woappi et al. 202012beschrieben. (B) EGFP-exprimierende Epidermosphären 2 h und (C) 24 h nach Aussaat in 3D-Kultur. (D) Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von SD-NHKc-Subpopulationen. Ungefähr 1/4aller Zellen sollte integrinα6hi/EGFRlosein. (E) Integrinα6hi/EGFRlo Subpopulationen produzieren Keratinozyten-Holoklone. (F) Immunfluoreszierende Färbeanalyse der basalen epithelialen Stammzellmarkerexpression in Integrinα6hi/EGFRlo Zellen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Primer-Sequenz (5'-3') | ||
| Genname | Vorwärts-Primer | Umgekehrte Grundierung |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabelle 1. Beschreibt PCR-Primersequenzen, die zum Nachweis ausgewählter Gene verwendet werden, die an der Plastizität neonataler Keratinozyten beteiligt sind.
| Kultur Bedingung | Phasenkontrast-Erscheinungsbild | Immunfärbung | FACS-Analyse | Transkriptomische Signatur | |
| Homöostatische Wartung | 2D-Monoschicht | Kleine Zellen < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Epidermale Wartung (K14, P63, IVL, K10) |
| Differenzierungsstopp/-umkehrung | 3D-Sphäroid | Kompaktes mehrzelliges Aggregat > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | Nicht/A | Dedifferenzierung: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Mobilität der Stresslinie | 3D-zu-2D-Sphäroid-Befestigung | Diffusion kleiner Zellen (< 20 μm) vom Sphäroidrand | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hi/EGFPmed | Proliferation von Hautzellen: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Gewebewiederherstellung | 3D-zu-2D-Sphäroid-Monoschicht | Vermehrung kleiner Zellen < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo und ITGα6hi/EGFPhi | Bildung der Epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabelle 2. Strategien zur phänotypischen und molekularen Charakterisierung des epidermalen Sphäroid-Replating-Assays.
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Discussion
Die Verwendung von 3D-Sphäroidkultursystemen hat einen breiten Nutzen bei der Beurteilung der Zellstammhaftigkeit. Es wurde gezeigt, dass diese Systeme die Anreicherung von Gewebestammzellenverbessern 13, aber ihr Nutzen für die Untersuchung menschlicher epidermaler Stammzellen wurde nur begrenzt untersucht. Hier beschreiben wir eine Strategie zur Anreicherung menschlicher Keratinozyten-Stammzellen mittels 3D-Kulturtechniken. In diesem System werden NHKc als selbstorganisierende mehrzellige Sphäroidsuspensionen kultiviert, die aus mehreren Keratinozyten-Subtypen bestehen, die auf Agarosebetten mit KSFM-scm schweben. Der Aufbau für dieses Protokoll ist zeitkritisch, da Agar bei Raumtemperatur schnell polymerisiert. Das Vorwärmen von serologischen Pipetten, Mikropipettenspitzen und dem Agar/Zell-Mischrohr sowie der Medien auf 42 °C kann die vorzeitige Polymerisation drastisch reduzieren. Wir haben beobachtet, dass das Platzieren der 96-Well-Platte bei 4 °C kurz nach der Zugabe von Agar/Medien-Mix zu Vertiefungen die Polymerisation erheblich beschleunigen und sicherstellen kann, dass das Agarkissen für die anschließende Aussaat von Zellen ausreichend fest ist. Es ist wichtig, das Plattenniveau während des Polymerisationsprozesses jederzeit aufrechtzuerhalten, da eine schlechte Polymerisation des Agar/Medien-Mixes dazu führt, dass Zellen im weichen Agar säen oder wachsen und den Assay entleeren.
Ebenfalls in diesem Protokoll beschrieben, präsentieren wir eine Strategie zur Vermehrung von Epidermosphären in 2D-Monolayer-Kultur, um stammartige sphäroide Abgeleitete Zellen zu erzeugen. Der epidermale Sphäroid-Re-Plating-Assay reichert für eine stammzellähnliche Subpopulation von integrinα6hi/EGFRlo Keratinozyten an. Diese Zellen können verwendet werden, um epidermale Rekonstruktion, Psoriasis oder zelluläre Neoplasie zu untersuchen11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo Keratinozyten können auch leicht durch FACS isoliert und durch immunfluoreszierende Färbung gekennzeichnet werden. Bei der Durchführung solcher Experimente fanden wir es hilfreich, unsortierte autologe 2D-Monoschichtzellen als Kontrollen zu verwenden., Haut-SCC-Zelllinien sind eine gute Alternative, wenn diese nicht verfügbar sind.
Zusammenfassend zeigt dieser Bericht, dass die menschliche epidermale Sphäroid-Neubeschichtung die regenerative Plastizität von Keratinozyten in vitromodelliert, da sie jede der vier Phasen der Regeneration erfasst: homöostatische Aufrechterhaltung, Differenzierungsumkehr, Mobilität der Stresslinie und Gewebewiederherstellung. Eine Einschränkung der Agar-basierten Sphäroid-Selbstorganisation besteht jedoch darin, dass nicht alle NHKc-Flecken in der Lage sind, spontan Sphäroide zu bilden. Die Hängenden-Drop-Methode15 ist eine gute alternative Strategie, um diese Herausforderung zu meistern und die bildung mehrzelliger Sphäroide zu erzwingen. Dieser Assay kann auch mit Muskel-, Stroma- oder Immunzellen multiplexed werden, um weitere Einblicke in den Beitrag verschiedener Zellpopulationen zur epidermalen Regeneration zu erhalten. Es wäre interessant zu untersuchen, ob die Zugabe von Matrigel in das Agar das Überleben und die Potenz der Epidermosphäre verbessern könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Beziehungen offenzulegen.
Acknowledgments
Die UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bot Zugang zu Bildgebungs- und Zellsortiergeräten sowie technischer Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Förderung 1R21CA201853 unterstützt. Das MCF und das IRF erhalten teilweise Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM103499, SC INBRE. Das MCF erhält auch Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM109091. Yvon Woappi wurde teilweise durch NIH-Stipendien 2R25GM066526-06A1 (PREP) und R25GM076277 (IMSD) sowie durch ein Stipendium des Grace Jordan McFadden Professors Program an der UofSC unterstützt. Geraldine Ezeka und Justin Vercellino wurden durch NIH-Zuschüsse 2R25GM066526-10A1 (PREP) an der UofSC unterstützt. Sean M. Bloos wurde mit dem Magellan Scholar Award 2016 an der UofSC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
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