Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Quentin Kimmerlin; Manuela Tavian; Christian Gachet; François Lanza; Nathalie Brouard

doi:10.3791/62498

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Methodenartikel

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

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DOI:

10.3791/62498

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20. Mai 2021

Quentin Kimmerlin¹ , Manuela Tavian² , Christian Gachet¹ , François Lanza¹ , Nathalie Brouard¹

¹Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, ²UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

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Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Zusammenfassung

Knochenmark-Megakaryozyten sind große polyploide Zellen, die die Produktion von Blutplättchen sicherstellen. Sie entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen durch Megakaryopoese. Die Endstadien dieses Prozesses sind komplex und umfassen klassischerweise die bipotenten Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer (MEP) und die unipotenten Megakaryozyten-Vorläufer (MKp). Diese Populationen gehen der Bildung von echten Megakaryozyten voraus, und als solche könnte ihre Isolierung und Charakterisierung eine robuste und unvoreingenommene Analyse der Megakaryozytenbildung ermöglichen. Dieses Protokoll stellt detailliert das Verfahren zur Sammlung hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus, die Anreicherung hämatopoetischer Vorläufer durch magnetische Depletion und schließlich eine Zellsortierungsstrategie vor, die hochreine MEP- und MKp-Populationen ergibt. Zuerst werden Knochenmarkzellen aus dem Femur, der Tibia und auch dem Beckenkamm, einem Knochen, der eine hohe Anzahl hämatopoetischer Vorläufer enthält, gesammelt. Die Verwendung von Beckenkammknochen erhöht drastisch die Gesamtzellzahl pro Maus und trägt somit zu einer ethischeren Verwendung von Tieren bei. Eine magnetische Linienverarmung wurde unter Verwendung von 450 nm magnetischen Kügelchen optimiert, was eine sehr effiziente Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Schließlich präsentiert das Protokoll die Markierungs- und Gating-Strategie für die Sortierung der beiden hochreinen Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) und MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^hell ). Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert genügend zelluläres Material, um i) molekulare Charakterisierung für ein tieferes Wissen über ihre Identität und Biologie, ii) In-vitro-Differenzierungsassays, die ein besseres Verständnis der Mechanismen der Reifung von Megakaryozyten liefern, oder iii) In-vitro-Modelle der Interaktion mit ihrer Mikroumgebung durchzuführen.

Einleitung

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert. Diese großen polyploiden Zellen befinden sich im Knochenmark und stammen wie alle Blutzellen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSC)¹. Der klassische Weg der Produktion von Megakaryozyten im Knochenmark stammt von HSC und beinhaltet die Erzeugung verschiedener Vorläufer, die ihr Differenzierungspotenzial progressiv einschränken². Der erste Vorläufer, der das Engagement für die megakaryozytäre Linie unterzeichnet, ist der Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), ein bipotenter Vorläufer, der sowohl erythroide Zellen als auch Megakaryozyten produzieren kann